用于降低氣道高反應(yīng)的方法和藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及選自抗S100B抗體、抗S100B適配子或S100B基因表達(dá)抑制劑的試劑用于降低有需要的受試者中的氣道高反應(yīng)的方法中。本發(fā)明還涉及用于確定受試者是否處于患有或發(fā)展氣道高反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括測(cè)定從所述受試者獲得的生物樣品中S100B蛋白的水平。
【專利說明】用于降低氣道高反應(yīng)的方法和藥物組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于降低有需要的受試者中的氣道高反應(yīng)的方法和藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]氣道高反應(yīng)(“AHR”)是許多氣道疾病的典型特征，其由使氣道響應(yīng)于刺激而太容易變窄和/或過分變窄的氣道異常組成。與各種病癥相關(guān)的呼吸道疾病在一般群體中非常常見。特別在哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD)中觀察到氣道高反應(yīng)。
[0003]哮喘是工業(yè)化國(guó)家中最常見的疾病之一。哮喘是一種特征在于氣道的可變的、在許多情況下可逆性阻塞的病癥。該過程與肺炎癥相關(guān)，并且在一些情況下與肺過敏相關(guān)。許多受試者具有被稱為“哮喘發(fā)作”的急性發(fā)作，而其他受試者患有慢性病癥。所有哮喘患者具有一組癥狀，所述癥狀是該病癥所特有的:發(fā)作性支氣管收縮、肺炎癥和降低的肺表面活性物質(zhì)?，F(xiàn)有支氣管擴(kuò)張劑和抗炎藥是目前可商購(gòu)的并且開處方用于治療哮喘。更重要地，可用于治療哮喘的大多數(shù)藥物在小部分受試者中幾乎無效。
[0004]CCffD的特征在于通常由慢性支氣管炎、肺氣腫或兩者引起的氣流阻塞。通常，氣道阻塞是不完全可逆的，但10-20%的受試者在治療下的確表現(xiàn)出一些氣道阻塞的改善。在慢性支氣管炎中，氣道阻塞由異常氣道粘液的長(zhǎng)期和過量分泌、炎癥、支氣管痙攣和感染所導(dǎo)致。目前幾乎沒有可用的治療來緩減COPD的癥狀、防止惡化、保持最佳肺功能、并改善每日生活活動(dòng)和生活質(zhì)量。許多受試者將在其余生長(zhǎng)期使用藥物，其中在惡化過程中需要增加劑量和額外藥物。目前為COPD受試者開處方的藥物包括:速效-β 2-受體激動(dòng)劑、抗膽堿能支氣管擴(kuò)張劑、長(zhǎng)效支氣管擴(kuò)張劑、抗生素和祛痰藥。在目前可用的CCffD治療中，從抗膽堿能藥物、β 2腎上腺素受體激動(dòng)劑和口服類固醇的施用開始，在其進(jìn)展后發(fā)現(xiàn)短期得益，但非長(zhǎng)期效果。短效和長(zhǎng)效吸入的β2腎上腺素能激動(dòng)劑實(shí)現(xiàn)短期支氣管擴(kuò)張，并且在COPD受試者中提供一些癥狀緩解，但沒有顯示對(duì)疾病進(jìn)展的任何有意義的保持效果。
[0005]因此，存在對(duì)于管理氣道疾病諸如哮喘或COPD中氣道高反應(yīng)性中的額外治療選項(xiàng)的需要。
[0006]S100B是SlOO蛋白家族的成員。SlOO蛋白是脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的低分子量蛋白，其特征在于螺旋-環(huán)螺旋(“EF手型”)構(gòu)型的兩個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)。存在至少21種不同類型的SlOO蛋白。該名稱源自以下事實(shí):該蛋白在中性pH的硫酸銨中100%可溶。S100B是作為由兩個(gè)β亞基組成的同源二聚體存在的分子量為12kDa的酸性蛋白。兩種單體以雙重旋轉(zhuǎn)軸設(shè)置，并且通過二硫鍵保持在一起。S100B已經(jīng)被鑒定為鈣結(jié)合蛋白，其在橫紋肌和骨骼肌收縮中起作用，但 其在氣道高反應(yīng)中的作用尚未研究。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明涉及選自抗S100B抗體、抗S100B適配子或S100B基因表達(dá)抑制劑的試劑用于降低有需要的受試者中的氣道高反應(yīng)的方法中。本發(fā)明還涉及用于確定受試者是否處于患有或發(fā)展氣道高反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括測(cè)定從所述受試者獲得的生物樣品中S100B蛋白的水平。[0009]發(fā)明詳述
[0010]支氣管過度活躍是平滑細(xì)胞肌收縮的體征，導(dǎo)致氣道收縮和呼吸困難。在急性肺損傷和過敏性哮喘的小鼠模型中，反應(yīng)性由細(xì)菌或過敏衍生物誘導(dǎo)。本發(fā)明人已經(jīng)在兩種呼吸攻擊的模型中解決了 SlOOb (RAGE/AGER途徑的配體)在氣道反應(yīng)中的貢獻(xiàn)。氣道刺激后，SlOOb在肺中表達(dá)，其動(dòng)力學(xué)概況類似于促炎細(xì)胞因子。缺乏SlOOb的小鼠表現(xiàn)出降低的LPS誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞募集或?qū)NF- α和IL_6促炎細(xì)胞因子的分泌沒有影響。類似地，在LPS攻擊和過敏性哮喘的OVA敏化模型中，中和抗體治療消除了支氣管反應(yīng)性。LPS攻擊后，表達(dá)SlOOb的細(xì)胞在支氣管中的上氣道上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞附近聚集，表明SlOOb在氣道高反應(yīng)性過程中在控制細(xì)胞重塑的動(dòng)力學(xué)中的潛在作用。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了調(diào)節(jié)支氣管過度活躍的級(jí)聯(lián)上游的SlOOb，并顯示SlOOb阻斷作為用于呼吸疾病包括急性肺損傷和哮喘的潛在治療策略。
[0011]因此，本發(fā)明涉及選自抗S100B抗體、抗S100B適配子或S100B基因表達(dá)抑制劑的試劑用于降低有需要的受試者中的氣道高反應(yīng)(AHR)的方法中。 [0012]值得提及的是，本發(fā)明的試劑能夠降低AHR，而不改變炎癥反應(yīng)(參見實(shí)施例1)。
[0013]如本文所使用，術(shù)語“S100B”具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，并且是指DonatoR.SlOO:a multigenic family of calcium-modulated proteins of the EF-hand type withintracellular and extracellular functional roles.1nt J Biochem Cell Biol.2001Jul ；33(7):637-68中所描述的SlOO鈣結(jié)合蛋白B。
[0014]如本文所使用，“抗體”包括天然存在和非天然存在的抗體。具體地，“抗體”包括多克隆和單克隆抗體，及其單價(jià)和二價(jià)片段。此外，“抗體”包括嵌合抗體、全合成抗體、單鏈抗體及其片段。抗體可以是人或非人抗體。非人抗體可以通過重組方法來人源化，以降低其在人中的免疫原性。
[0015]如本文所使用，術(shù)語“抗S100B抗體”是指任何直接對(duì)抗S100B的抗體。
[0016]抗體可以根據(jù)常規(guī)方法來制備。單克隆抗體可以使用Kohler和Milstein(Nature, 256:495, 1975)的方法來生成。為了制備可用于本發(fā)明的單克隆抗體，小鼠或其它適當(dāng)?shù)乃拗鲃?dòng)物用S100B的抗原形式以合適時(shí)間間隔(例如，每周兩次，每周一次，每月兩次或每月一次)來免疫。動(dòng)物可以在處死一周內(nèi)施用抗原的最后“加強(qiáng)”。經(jīng)常期望在免疫過程中使用免疫佐劑。合適的免疫佐劑包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、明礬、Ribi佐劑、Hunter的Titermax、皂苷佐劑諸如QS21或Quil A或含有CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其它合適的佐劑是本領(lǐng)域眾所周知的。動(dòng)物可以通過皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)或其它途徑來免疫。給定動(dòng)物可以用多種形式的抗原通過多種途徑來免疫。
[0017]簡(jiǎn)而言之，可以使用任何之前描述的方法來提供重組形式的S100B。免疫方案之后，將淋巴細(xì)胞從動(dòng)物的脾、淋巴結(jié)或其它器官分離并使用試劑諸如聚乙二醇與合適的骨髓瘤細(xì)胞系融合以形成雜交瘤。融合之后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法將細(xì)胞置于允許雜交瘤、但非融合伴侶的生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)雜交瘤之后，分析細(xì)胞上清液中具有所需特異性的抗體(即，選擇性結(jié)合抗原)的存在。合適的分析技術(shù)包括ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、免疫沉淀和western印跡。其它篩選技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。優(yōu)選的技術(shù)是證實(shí)抗體與構(gòu)象完整、本身折疊的抗原的結(jié)合的技術(shù)，諸如非變性ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和免疫沉淀。
[0018]具體而言，如本領(lǐng)域眾所周知的，只有抗體分子的一小部分，互補(bǔ)位，參與抗體與其表位的結(jié)合。例如，F(xiàn)e’和Fe區(qū)是補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的效應(yīng)物，但不參與抗原結(jié)合。已經(jīng)從其酶促切割pFc’區(qū)的抗體或在沒有pFc’區(qū)的情況下產(chǎn)生的抗體，被指定為F(ab’)2片段，保留了完整抗體的兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。類似地，已經(jīng)從其酶促切割Fe區(qū)的抗體或在沒有Fe區(qū)的情況下產(chǎn)生的抗體，被指定為Fab片段，保留了完整抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)之一。進(jìn)一步繼續(xù)，F(xiàn)ab片段由共價(jià)結(jié)合的抗體輕鏈和表示為Fd的一部分抗體重鏈組成。Fd片段是抗體特異性的主要決定因素(單一 Fd片段可以與最高達(dá)10個(gè)不同的輕鏈結(jié)合，而不改變抗體特異性)，并且Fd片段在分離的情況下保留表位結(jié)合能力。
[0019]在抗體的抗原結(jié)合部分之內(nèi)，如本領(lǐng)域中眾所周知的，存在直接與抗原表位直接相互作用的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和保持互補(bǔ)位的三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)(FR)(通常參見，Clark, 1986 ；Roitt, 1991)。在IgG免疫球蛋白的重鏈Fd片段和輕鏈兩者中，存在分別由三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rl至⑶RS)隔開的四個(gè)構(gòu)架區(qū)(FRl至FR4)。⑶R，特別是⑶RS區(qū)域，更特別是重鏈⑶RS，主要負(fù)責(zé)抗體特異性。
[0020]現(xiàn)在本領(lǐng)域公認(rèn)的是，哺乳動(dòng)物抗體的非CDR區(qū)可以被同種特異性或異種特異性抗體的相似區(qū)域替換，同時(shí)保留初始抗體的表位特異性。這最清楚地體現(xiàn)在其中非人CDR共價(jià)連接人FR和/或Fc/pFc’區(qū)以產(chǎn)生功能性抗體的“人源化”抗體的開發(fā)和使用中。 [0021]本發(fā)明在某些實(shí)施方案中提供包括抗體的人源化形式的組合物和方法。如本文所使用，“人源化”描述了以下抗體，其中CDR區(qū)域外的一些、大部分或所有氨基酸被從人免疫球蛋白分子衍生的相應(yīng)氨基酸替換。人源化的方法包括，但不限于，美國(guó)專利號(hào)4，816，567、5，225，539,5, 585，089,5, 693，761,5, 693，762 和 5，859，205 (其通過引用并入本文)中描述的那些。上述美國(guó)專利號(hào)5，585，089和5，693，761以及W090/07861也建議可用于設(shè)計(jì)人源化抗體的四種可能標(biāo)準(zhǔn)。第一個(gè)建議是，對(duì)于受體，使用來自通常與待人源化的供體免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的構(gòu)架，或者使用來自許多人抗體的共有構(gòu)架(consensusframework)。第二個(gè)建議是，如果人免疫球蛋白的構(gòu)架中的氨基酸是稀有的并且在該位置的供體氨基酸對(duì)于人序列是典型的，則可以選擇供體氨基酸而不是受體氨基酸。第三個(gè)建議是，在人源化免疫球蛋白鏈中緊鄰3個(gè)CDR的位置中，可以選擇供體氨基酸而不是受體氨基酸。第四個(gè)建議是，使用在以下構(gòu)架位置的供體氨基酸殘基:該位置的氨基酸被預(yù)測(cè)為具有在抗體的三維模型中CDR的3A內(nèi)的側(cè)鏈原子，并被預(yù)測(cè)為能夠與CDR相互作用。上述方法僅僅說明一些本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用來制備人源化抗體的方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將熟悉其它抗體人源化的方法。
[0022]在一個(gè)人源化形式的抗體的實(shí)施方案中，CDR區(qū)域外的一些、大部分或所有氨基酸已經(jīng)替換為來自人免疫球蛋白分子的氨基酸，但其中在一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)域內(nèi)的一些、大部分或所有氨基酸不變。氨基酸的小的增加、刪除、插入、取代或修飾是可允許的，只要其不消除抗體結(jié)合給定抗原的能力。合適的人免疫球蛋白分子將包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM分子。“人源化”抗體保留了與初始抗體相似的抗原特異性。然而，使用某些人源化方法，可以使用如Wu等人，/.Mol.Biol.294:151, 1999 (其內(nèi)容通過引用并入本文)中所描述的“定向進(jìn)化”方法增加抗體結(jié)合的親和力和/或特異性。
[0023]完全人單克隆抗體還可以通過免疫對(duì)于人免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因座的大部分轉(zhuǎn)基因的小鼠來制備。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5，591，669、5，598，369、5，545，806、5，545，807,6, 150, 584和其中弓丨用的參考文獻(xiàn)，其內(nèi)容通過引用并入本文。這些動(dòng)物已經(jīng)遺傳修飾，從而使得在內(nèi)源性(例如，鼠)抗體的產(chǎn)生中存在功能性缺失。進(jìn)一步修飾動(dòng)物以含有所有或一部分人種系免疫球蛋白基因座，從而使得這些動(dòng)物的免疫將導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)目標(biāo)抗體的完全人抗體。免疫這些小鼠(例如，XenoMouse (Abgenix)，HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))之后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。這些單克隆抗體將具有人免疫球蛋白氨基酸序列，并且因此當(dāng)向人施用時(shí)不會(huì)引發(fā)人抗小鼠抗體(KAMA)反應(yīng)。
[0024]產(chǎn)生人抗體也存在體外方法。這些方法包括噬菌體展示技術(shù)(美國(guó)專利號(hào)5，565，332和5，573，905)和人B細(xì)胞的體外刺激(美國(guó)專利號(hào)5，229，275和5，567，610)。這些專利的內(nèi)容通過引用并入本文。
[0025]因此，如對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將顯而易見的，本發(fā)明還提供F(ab’)2Fab、Fv和Fd片段；其中Fe和/或FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替換的嵌合抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替換的嵌合F (ab’) 2片段抗體；其中FR和/或CDRl和/或CDR2和/或輕鏈CDR3區(qū)已被同源的人或非人序列替換的嵌合Fab片段抗體；和其中FR和/或CDRl和/或CDR2區(qū)已被同源的人或非人序列替換的嵌合Fd片段抗體。本發(fā)明還包括所謂的單鏈抗體。
[0026]各種抗體分子和片段可以衍生自任何通常已知的免疫球蛋白類別，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亞類也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括但不限于人 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0027]在另一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體是單一結(jié)構(gòu)域抗體。術(shù)語“單一結(jié)構(gòu)域抗體”(sdAb)或“VHH”是指在駱駝科哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的類型的天然缺失輕鏈的抗體的單一重鏈可變結(jié)構(gòu)域。此類VHH也被稱為“納米抗體⑩”。根據(jù)本發(fā)明，sdAb尤其可以是美洲駝(llama)sdAb。
[0028]如本文所使用，術(shù)語“適配子”是在分子識(shí)別方面代表抗體的替代物的一類分子。適配子是具有以高親和力和特異性識(shí)別幾乎任何類型的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。因此，術(shù)語“抗SlOOB適配子”是指直接對(duì)抗SlOOB的適配子。
[0029]適配子可通過隨機(jī)序列文庫(kù)的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential enrichment, SELEX)來分離。隨機(jī)序列文庫(kù)可通過DNA的組合化學(xué)合成獲得。
[0030]“S100B基因表達(dá)抑制劑”是指具有抑制或顯著降低S100B基因表達(dá)的生物效應(yīng)的天然或合成的化合物。
[0031]用于在本發(fā)明中使用的表達(dá)抑制劑可以基于反義寡核苷酸構(gòu)建體。反義寡核苷酸，包括反義RNA分子和反義DNA分子，將通過結(jié)合S100B mRNA并且由此阻止蛋白翻譯或增加mRNA降解來發(fā)揮作用以直接阻斷S100B mRNA的翻譯，由此降低細(xì)胞中的S100B水平，并且因此降低其活性。例如，可以通過常規(guī)磷酸二酯技術(shù)合成至少大約15個(gè)堿基并且與編碼S100B的mRNA轉(zhuǎn)錄物序列獨(dú)特區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸，并且通過例如靜脈內(nèi)注射或輸注施用。使用反義技術(shù)來特異性抑制其序列已知的基因的基因表達(dá)的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(例如參見美國(guó)專利號(hào) 6，566，135 ;6，566，131 ;6，365，354 ;6，410，323 ;6，107，091 ；6，046，321 ;和 5，981，732)。
[0032] 小的抑制性RNA(SiRNA)也可作為表達(dá)的抑制劑起作用而用于本發(fā)明中。S100B基因表達(dá)可通過將受試者或細(xì)胞與小的雙鏈RNA (dsRNA)或者引起產(chǎn)生小的雙鏈RNA的載體或構(gòu)建體接觸，從而使得SlOOB基因表達(dá)被特異性抑制(即RNA干擾或RNAi)而降低。為其序列已知的基因選擇適當(dāng)?shù)膁sRNA或dsRNA-編碼載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如參見 Tuschl, T.等人(1999) ；Elbashir, S.Μ.等人(2001) ；Hannon, GJ.(2002) ；McManus,MT.等人(2002) ；Brummelkamp, TR.等人(2002);美國(guó)專利號(hào) 6，573，099 和 6，506，559 ;以及國(guó)際專利公布號(hào)W001/36646、W099/32619和W001/68836)。可以有利地保護(hù)所有或部分本發(fā)明的siRNA的磷酸二酯鍵。該保護(hù)通常使用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法經(jīng)由化學(xué)途徑來實(shí)施。例如，磷酸二酯鍵可以通過硫醇或胺官能團(tuán)或通過苯基來保護(hù)。本發(fā)明的siRNA的5’ -和/或3’ -端也可以例如有利地使用上述用于保護(hù)磷酸二酯鍵的技術(shù)來保護(hù)。siRNA序列有利地包含至少12個(gè)連續(xù)的二核苷酸或其衍生物。
[0033]如本文所使用，關(guān)于本核酸序列的術(shù)語“siRNA衍生物”是指與促紅細(xì)胞生成素或其片段具有至少90%，優(yōu)選至少95%，作為實(shí)例至少98%，且更優(yōu)選至少98%的同一性百分比的核酸。
[0034]如本文所使用，在兩個(gè)核酸序列之間的“同一性百分比”是指在待比較的兩個(gè)序列之間采用所述序列的最佳比對(duì)而獲得的相同核酸的百分比，該百分比純粹是統(tǒng)計(jì)學(xué)的，并且這兩個(gè)序列之間的差異隨機(jī)地遍布于核酸序列。如本文所使用，“最佳比對(duì)”或“最優(yōu)比對(duì)”是指確定的同一性百分比(參見下文)為最高的比對(duì)。經(jīng)常通過比較根據(jù)最佳比對(duì)的之前比對(duì)的兩個(gè)核酸序列來實(shí)現(xiàn)這些序列之間的序列比較；為了鑒定并比較相似的局部區(qū)域，針對(duì)比較的片段來實(shí)現(xiàn)該比較。除了通過手工方式，通過使用由SMITH和WATERMAN開發(fā)的全局同源性算法(Ad.App.Math.，vol.2, p:482, 1981)，通過使用由 NEDDLEMAN 和 WUNSCH開發(fā)的局部同源性算法(J.Mol.Biol.，vol.48，p: 443，1970)，通過使用由PEARSON和LIPMAN開發(fā)的相似性的方法(Proc.Natl.Acd.Sc1.USA, vol.85, p:2444, 1988)，通過使用利用這種算法的計(jì)算機(jī)軟件(在Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST P、BLASTN、FASTA、TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison, WI USA),通過使用MUSCLE 多比對(duì)算法(Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol.32, p: 1792, 2004)來實(shí)現(xiàn)進(jìn)行比較的最佳序列比對(duì)。為了得到最佳局部比對(duì)，可優(yōu)選地使用BLAST軟件。通過比較最優(yōu)比對(duì)的兩個(gè)核酸序列來確定這兩個(gè)序列之間的同一性百分比，為了得到這兩個(gè)序列之間的最優(yōu)比對(duì)，核酸序列關(guān)于參考序列能夠包含添加或缺失。通過以下來計(jì)算同一性百分比:確定這兩個(gè)序列之間相同位置的數(shù)目，將該數(shù)目除以比較位置的總數(shù)目，然后將所獲得的結(jié)果乘以100，以得到這兩個(gè)序列之間的同一性百分比。
[0035]shRNA(短發(fā)夾RNA)也可以作為用于本發(fā)明的表達(dá)抑制劑起作用。
[0036]核酶也可作為用于本發(fā)明的表達(dá)抑制劑起作用。核酶是能夠催化RNA的特異性切割的酶性RNA分子。核酶的作用機(jī)制涉及核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA的序列特異性雜交，隨后內(nèi)切核苷酸切割。因此特異性和有效催化S100B mRNA序列的內(nèi)切核苷酸切割的工程改造的發(fā)夾或錘頭基序核酶分子可以在本發(fā)明范圍內(nèi)使用。通過掃描靶分子中的核酶切割位點(diǎn)(其通常包括下列序列:GUA、GUU和⑶C)最初鑒定任何潛在RNA靶內(nèi)的特異性核酶切位點(diǎn)。一旦鑒定出，評(píng)價(jià)對(duì)應(yīng)于包含切割位點(diǎn)的靶基因區(qū)的在約15和20個(gè)核糖核苷酸之間的短RNA序列的預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)特征，諸如致使寡核苷酸序列不適當(dāng)?shù)亩?jí)結(jié)構(gòu)。
[0037]可以通過已知方法制備用作表達(dá)抑制劑的反義寡核苷酸和核酶兩者。這包括用于化學(xué)合成的技術(shù)，諸如，例如通過固相亞磷酰胺化學(xué)合成?；蛘?，反義RNA分子可以通過編碼RNA分子的DNA序列的體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。此類DNA序列可以整合入多種整合有適當(dāng)RNA聚合酶啟動(dòng)子諸如T7或SP6聚合酶啟動(dòng)子的載體中?？梢韵虮景l(fā)明的寡核苷酸引入多種修飾作為增加細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期的手段?？赡艿男揎棸ǖ幌抻谙蚍肿拥?’和/或3’端添加核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的側(cè)翼序列，或者在寡核苷酸主鏈內(nèi)使用硫代磷酸酯或2’ -O-甲基而非磷酸二酯酶鍵。
[0038]本發(fā)明的反義寡核苷酸、siRNA、shRNA和核酶可以單獨(dú)地或者與載體一起向體內(nèi)遞送。“載體”以其最廣義的含義是能夠促進(jìn)反義寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞并且優(yōu)選表達(dá)S100B的細(xì)胞的任何媒介物。優(yōu)選地，載體以相對(duì)于將導(dǎo)致缺乏載體的降解程度降低的降解將核酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。通常，用于本發(fā)明的載體包括，但不限于，質(zhì)粒、噬菌粒、病毒、衍生自病毒或細(xì)菌來源的已經(jīng)通過插入或整合入反義寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列而操作的其它媒介物。病毒載體是優(yōu)選的載體類型，并且包括，但不限于來自下列病毒的核酸序列:逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如莫洛尼鼠白血病病毒、harvey鼠肉瘤病毒、鼠乳腺腫瘤病毒和勞斯肉瘤病毒；腺病毒，腺相關(guān)病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；埃_巴病毒；乳頭瘤病毒；皰疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；和RNA病毒諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒?？梢匀菀椎夭捎梦疵绢I(lǐng)域已知的其它病毒。
[0039]優(yōu)選的病毒載體基于其中非必需基因已經(jīng)被目的基因替換的非細(xì)胞病真核病毒。非細(xì)胞病病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如慢病毒)，其生命周期涉及基因組病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，隨后前病毒整合入宿主細(xì)胞DNA中。逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人基因治療試驗(yàn)。最有用的是復(fù)制缺 陷的那些逆轉(zhuǎn)錄病毒(即，能夠指導(dǎo)期望蛋白質(zhì)的合成，但是不能夠產(chǎn)生感染顆粒)。此類基因工程改變的逆病毒表達(dá)載體通?？捎糜隗w內(nèi)基因的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)。用于產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的標(biāo)準(zhǔn)方案(包括將外源遺傳物質(zhì)整合入質(zhì)粒中、以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系、由包裝細(xì)胞系產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、從組織培養(yǎng)基收集病毒顆粒、和以病毒顆粒感染祀細(xì)胞的步驟)在Kriegler, 1990和Murry, 1991中提供。
[0040]對(duì)于某些應(yīng)用的優(yōu)選病毒是腺病毒和腺相關(guān)(AAV)病毒，其是已經(jīng)批準(zhǔn)用于人基因治療的雙鏈DNA病毒。事實(shí)上，12種不同的AAV血清型(AAV1至12)是已知的，各自具有不同的組織嗜性(Wu，ZMol Ther2006 ; 14:316-27)。重組AAV衍生自依賴性細(xì)小病毒AAV2 (Choi, Vff J Virol2005 ；79:6801-07)。腺相關(guān)病毒I至12型可以被工程改造成復(fù)制缺陷型的并且能夠感染大量細(xì)胞類型和種類(Wu，Z Mol Ther2006 ;14:316_27)。其還具有優(yōu)點(diǎn)諸如，熱和脂質(zhì)溶劑穩(wěn)定性；在不同譜系細(xì)胞，包括造血細(xì)胞中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率；和缺乏重復(fù)感染抑制因此允許多重轉(zhuǎn)導(dǎo)系列。據(jù)報(bào)導(dǎo)，腺相關(guān)病毒可以以位點(diǎn)特異性的方式整合入人細(xì)胞DNA中，由此使逆轉(zhuǎn)錄病毒感染所特有的插入誘變和所插入基因表達(dá)變異性的可能性最小化。此外，在缺乏選擇壓力的情況下，野生型腺相關(guān)病毒感染已經(jīng)在組織培養(yǎng)中傳代超過100代，這意味著腺相關(guān)病毒基因組整合是相對(duì)穩(wěn)定的事件。腺相關(guān)病毒還可以以染色體外方式起作用。
[0041]其它載體包括質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體已經(jīng)在本領(lǐng)域中廣泛描述并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例如Sambrook等人，1989。在最近幾年中，質(zhì)粒載體已經(jīng)用作DNA疫苗用于體內(nèi)向細(xì)胞遞送編碼抗原的基因。對(duì)于此它們是特別有益的，因?yàn)樗鼈儾痪哂信c許多病毒載體所具有的相同的安全性問題。然而，具有與宿主細(xì)胞相容的啟動(dòng)子的這些質(zhì)粒可從質(zhì)粒內(nèi)有效編碼的基因表達(dá)肽。一些常用的質(zhì)粒包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40和pBlueScript。其它質(zhì)粒是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的。此外，質(zhì)?？梢允褂孟拗泼负瓦B接反應(yīng)以去除和添加特定的DNA片斷而定制設(shè)計(jì)。質(zhì)?？梢酝ㄟ^多種腸胃外、粘膜和局部途徑遞送。例如，DNA質(zhì)?？梢酝ㄟ^肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或其它途徑注射。其還可通過鼻內(nèi)噴霧劑或滴劑、直腸栓劑和口服施用。它還可使用基因槍施用至表皮或粘膜表面。質(zhì)?？稍谒芤褐刑峁诮痤w粒上干燥或與另一種DNA遞送系統(tǒng)結(jié)合，所述另一種DNA遞送系統(tǒng)包括但不限于脂質(zhì)體、樹狀聚合物、蝸形體(cochleate)和微囊。
[0042]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反義寡核苷酸、siRNA、shRNA或核酶核酸序列在異源調(diào)控區(qū)，例如，異源啟動(dòng)子的控制下。啟動(dòng)子可以對(duì)于Muller膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是特異性的。例如，在Mu11 er膠質(zhì)細(xì)胞中的特異性表達(dá)可以通過合適的谷氨酰胺合成酶基因的啟動(dòng)子來獲得。啟動(dòng)子也可以是，例如，病毒啟動(dòng)子，諸如CMV啟動(dòng)子或任何合成的啟動(dòng)子。
[0043]根據(jù)本發(fā)明，“氣道高反應(yīng)”或“AHR”是指氣道異常，其由對(duì)許多環(huán)境觸發(fā)物諸如過敏原和運(yùn)動(dòng)的氣道變窄反應(yīng)增加組成。AHR可以是由炎癥或氣道重塑引起的呼吸系統(tǒng)的功能性改變。氣道高反應(yīng)可由膠原蛋白沉積、支氣管痙攣、氣道平滑肌肥大、氣道平滑肌收縮、粘液分泌、細(xì)胞沉積、上皮的破壞、上皮穿透性的改變、平滑肌功能或敏感性的改變、肺實(shí)質(zhì)的異常和/或氣道內(nèi)和周圍的浸潤(rùn)性疾病而引起。這些致病因素中有許多可與炎癥相關(guān)。本發(fā)明涉及任何氣道高反應(yīng)，包括與氣道的炎癥相關(guān)的氣道高反應(yīng)(例如嗜酸性粒細(xì)胞增多和炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生)。
[0044]如本文所使用，“降低氣道高反應(yīng)”是指受試者中任何可測(cè)量的氣道高反應(yīng)的降低和/或發(fā)生氣道高反應(yīng)的發(fā)生率或頻率的任何降低。優(yōu)選地，氣道高反應(yīng)降低了，最佳地，降低至受試者不再遭受不適和/或由氣道高反應(yīng)導(dǎo)致或與氣道高反應(yīng)相關(guān)的功能改變的程度。AHR的降低可以使用本領(lǐng)域中已知的任何合適方法來測(cè)量。呼吸功能可以通過，例如，肺量測(cè)定法、體積描記法、峰值流量、癥狀評(píng)分、生理體征(即呼吸速率)、氣喘、運(yùn)動(dòng)耐量、使用急救藥物(即支氣管擴(kuò)張藥)和血液氣體來測(cè)量。
[0045]在具體實(shí)施方案中，氣道高反應(yīng)與過敏性炎癥相關(guān)。
[0046]在具體實(shí)施方案中，受試者患有選自以下的氣道疾病:哮喘、慢性阻塞性肺疾病、過敏性支氣管肺曲霉病、過敏性肺炎、嗜酸粒細(xì)胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化、結(jié)核病、過敏性肺炎、職業(yè)性哮喘、結(jié)節(jié)病、反應(yīng)性氣道疾病綜合征、間質(zhì)性肺病、嗜酸粒細(xì)胞增多綜合征、鼻炎、鼻竇炎、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的哮喘、污染誘發(fā)的哮喘和肺寄生蟲病。優(yōu)選地，受試者患有哮喘、慢性阻塞性氣道疾病、職業(yè)性哮喘、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的哮喘、污染誘發(fā)的哮喘和反應(yīng)性氣道病綜合征，具有慢性阻塞性氣道疾病。受試者還可以患有與病毒感染諸如由呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、鼻病毒(RV)或腺病毒引起的感染相關(guān)的氣道高反應(yīng)。
[0047]本發(fā)明的試劑可以如下定義的藥物組合物形式施用。優(yōu)選地，所述試劑以治療有效量施用。“治療有效量”是指在適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理效益/風(fēng)險(xiǎn)比下，所述試劑足以治療AHR的量。
[0048]應(yīng)該理解的是，試劑或包含其的藥物組合物的總的每日使用量由主治醫(yī)生在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。用于任何特定受試者的具體的治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括:待治療的疾病和疾病的嚴(yán)重程度；所使用的特定化合物的活性；所使用的特定組合物、受試者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；所使用的特定試劑的給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄速率；治療持續(xù)時(shí)間；與所使用的特定試劑組合使用或同時(shí)使用的藥物；和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的類似因素。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的是，以低于獲得期望治療效果所需的水平開始試劑的劑量，并逐漸增加劑量直到獲得期望的效果。但是，試劑的日劑量可以在每位成人每天0.01至1，OOOmg的較寬的范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地，組合物含有0.01、0.05,0.1,0.5、1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,25.0,50.0、100、250 和 500mg 試劑，以對(duì)癥調(diào)整待治療的受試者的劑量。藥物通常含有約0.01mg至約500mg的活性成分，優(yōu)選含有Img至約IOOmg的活性成分。藥物的有效量通常以每天0.0002mg/kg至約20mg/kg體重,特別是以每天約0.0Olmg/kg至7mg/kg體重的劑量水平提供。
[0049]因此本發(fā)明的試劑可以配制成藥物組合物，所述藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或媒介物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含上述本發(fā)明的試劑和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或媒介物的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明是包含有效量的本發(fā)明的試劑或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、佐劑或媒介物的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體包括，例如，關(guān)于期望施用形式合適地選擇并且與常規(guī)藥物實(shí)踐一致的藥物稀釋劑、賦形劑或載體。
[0050]藥學(xué)上可接受的載體可以含有不過度抑制試劑的生物活性的惰性成分。藥學(xué)上可接受的載體應(yīng)當(dāng)是生物相容的，例如，在向受試者施用之后，無毒、無炎性、無免疫原性或缺乏其它不期望的反應(yīng)或副作用?？梢圆捎脴?biāo)準(zhǔn)藥物配制技術(shù)。
[0051]如本文所 使用，藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物包括適合于所需特定劑型的任何和所有溶劑、稀釋劑或其它液體媒介物、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤(rùn)滑劑等。Remington’s PharmaceuticalSciences, Sixteenth Edition, E.ff.Martin (Mack Publishing C0., Easton, Pa., 1980)公開了用于配制藥學(xué)上可接受的組合物的各種載體和用于其制備的已知技術(shù)。除了任何常規(guī)載體介質(zhì)與本文所述的化合物不相容的程度，諸如通過產(chǎn)生任何不良生物效應(yīng)或者另外以有害方式與藥學(xué)上可接受的組合物的任何其它組分相互作用，否則其用途涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0052]可作為藥學(xué)上可接受的載劑的材料的一些實(shí)例包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(諸如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(諸如twinSO、磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸或山梨酸鉀)、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、鹽，或電解質(zhì)(諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉或鋅鹽)、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羊毛脂、糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末狀黃芪膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油；紅花油；芝麻油；橄欖油；玉米油和大豆油；二醇；如丙二醇或聚乙二醇；酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液(Ringer’s solution);乙醇和磷酸鹽緩沖溶液；以及根據(jù)配制者的判斷，所述組合物中也可存在的其它無毒可相容潤(rùn)滑劑，諸如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑。
[0053]根據(jù)所治療的氣道高反應(yīng)的嚴(yán)重性，本文所述的組合物可以口服、胃腸外、通過吸入噴霧、局部、直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、陰道或經(jīng)由植入儲(chǔ)庫(kù)施用。如本文所使用，術(shù)語“腸胃外”包括，但不限于，皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。
[0054]本文所述組合物的無菌注射形式可以是水性或油性懸浮液。這些懸浮液可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)使用合適的分散劑或濕潤(rùn)劑和懸浮劑來配制。無菌注射制劑也可為在無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如，作為1，3-丁二醇中的溶液?？墒褂玫目山邮茌d體和溶劑為水、林格氏溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，通常使用無菌的、非揮發(fā)油作為溶劑或懸浮介質(zhì)。為此目的，可使用任何溫和的非揮發(fā)油，包括合成的單-或二-甘油酯。脂肪酸，諸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制備注射劑，如作為天然藥學(xué)上可接受的油，諸如橄欖油或蓖麻油，尤其是它們的聚氧乙基化形式。這些油溶液或懸浮液也可以含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，諸如羧甲基纖維素或類似的分散劑，其通常用于制備藥學(xué)上可接受的劑型，包括乳劑和懸浮劑。其它常用的表面活性劑，諸如吐溫、司盤和通常用于制備藥學(xué)上可接受的固體、液體或其它劑型的其它乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑，也可以用于配制目的。
[0055]本文所述的藥物組合物可以以任何口服可接受的劑型口服施用，所述劑型包括但不限于膠囊、片劑、水性懸浮液或溶液。在用于口服使用的片劑的情況下，常用的載體包括，但不限于，乳糖和玉米淀粉。還典型地添加潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂。對(duì)于膠囊形式的口服施用，有用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)需要水性懸浮液用于口服使用時(shí)，所述試劑與乳化劑和懸浮劑組合。如果需要，還可以添加某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
[0056]或者，本文所述的 藥物組合物可以以用于直腸施用的栓劑形式來施用。這些可以通過將試劑與在室溫下為固體、但在直腸溫度下為液體、因此將在直腸中熔融以釋放藥物的合適的無刺激性賦形劑混合而制備。此類材料包括，但不限于，可可脂、蜂蠟和聚乙二醇。
[0057]還可以將藥物組合物施用于呼吸道。肺部遞送組合物可以通過受試者吸入分散體而遞送，從而使得分散體內(nèi)的試劑可以達(dá)到肺部，在其中其可以，例如，容易地通過肺泡區(qū)直接吸收進(jìn)入血液循環(huán)。肺部遞送可以通過不同方法實(shí)現(xiàn)，包括使用霧化、氣溶膠化、膠束和基于干燥粉末的制劑；通過吸入施用可以是經(jīng)口和/或經(jīng)鼻的。遞送可以使用液體噴霧器、基于氣溶膠的吸入器和干燥粉末分散體裝置來實(shí)現(xiàn)。計(jì)量裝置是優(yōu)選的。使用噴霧器或吸入器的益處之一在于，使污染的可能性最小化，因?yàn)檠b置是自含的。例如，干燥粉末分散體裝置遞送可以容易地配制為干燥粉末的藥物。本發(fā)明的藥物組合物可以以本身或與合適的粉末載體組合穩(wěn)定地保存為凍干或噴霧干燥的粉末。用于吸入的本發(fā)明藥物組合物的遞送可以通過計(jì)量定時(shí)元件來介導(dǎo)，所述計(jì)量定時(shí)元件可以包括計(jì)時(shí)器、劑量計(jì)數(shù)器、時(shí)間測(cè)量裝置或時(shí)間指示器，當(dāng)加入裝置時(shí)其在施用氣霧劑藥物的過程中能夠?qū)崿F(xiàn)受試者的劑量追蹤、順應(yīng)性監(jiān)測(cè)和/或劑量引發(fā)。用于氣霧劑遞送的藥物裝置的實(shí)例包括計(jì)量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和空氣噴射噴霧器。
[0058]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于確定受試者是否處于患有或發(fā)展氣道高反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括測(cè)定從所述受試者獲得的生物樣品中S100B蛋白的水平。
[0059]如本文所使用，術(shù)語生物樣品涵蓋從患者獲得的用于確定受試者是否處于患有或發(fā)展氣道高反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的目的的任何樣品。通常，所述生物樣品可以是血液樣品或支氣管肺泡灌洗液樣品。
[0060]確定生物樣品中S100B的水平可以通過多種技術(shù)來進(jìn)行。通常，確定所述水平包括將樣品與抗S100B的結(jié)合伴侶接觸，從而檢測(cè)精液樣品中S100B的存在或測(cè)定精液樣品中S100B的量。如本文所使用，術(shù)語“結(jié)合伴侶”是指任何能夠以高親和力結(jié)合生物標(biāo)志物的(天然或非天然的)任何分子。所述結(jié)合伴侶包括但不限于抗體或適配子。
[0061]本發(fā)明的結(jié)合伴侶，諸如抗體或適配子，可以用可檢測(cè)的分子或物質(zhì)標(biāo)記，諸如，優(yōu)選熒光分子、或放射性分子或任何其它本領(lǐng)域已知的標(biāo)記。本領(lǐng)域已知通常(直接地或間接地)提供信號(hào)的標(biāo)記。如本文所使用，關(guān)于抗體或適配子的術(shù)語“標(biāo)記的”意圖涵蓋通過將可檢測(cè)物質(zhì)，諸如熒光團(tuán)[例如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)或靛青(Indocyanine) (Cy5)])或放射性試劑偶聯(lián)(即，物理連接)至抗體或適配子而對(duì)抗體或適配子進(jìn)行直接標(biāo)記，以及通過與可檢測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)性對(duì)探針或抗體進(jìn)行間接標(biāo)記。本發(fā)明的抗體或適配子可通過本領(lǐng)域已知的任何方法用放射性分子來標(biāo)記。例如放射性分子包括但不限于用于閃爍照相研究的放射性原子，諸如1123、1124、Inlll、Rel86、Rel88。
[0062]接觸可以在任何合適的裝置(諸如板、微量滴定皿，試管、孔、玻璃、柱等)中進(jìn)行。在具體實(shí)施方案中，接觸在用結(jié)合伴侶包被的基底上進(jìn)行?；卓梢允枪腆w或半固體基底，諸如任何適合的支持物，包括玻璃、塑料、尼龍、紙、金屬、聚合物等?；卓梢允歉鞣N形式和尺寸，諸如載玻片、膜、珠、柱、凝膠等。接觸可以在任何適于在結(jié)合伴侶和樣品的生物標(biāo)志物之間形成可檢測(cè)的復(fù)合物(諸如抗體-抗原復(fù)合物)的條件下進(jìn)行。
[0063]S100B的存在可以使用標(biāo)準(zhǔn)的電泳和免疫診斷技術(shù)來檢測(cè)，所述技術(shù)包括免疫測(cè)定法，諸如競(jìng)爭(zhēng)、直接反應(yīng)或夾心型測(cè)定法。此類測(cè)定法包括，但不限于，Western印跡；凝集試驗(yàn)；酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫測(cè)定法，諸如ELISA ;生物素/抗生物素蛋白類型分析；放射免疫測(cè)定法；免疫電泳；免疫沉淀等。反應(yīng)通常包括顯示標(biāo)記，諸如熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性、酶標(biāo)記或染料分子，或用于檢測(cè)抗原和抗體或與其反應(yīng)的抗體之間的復(fù)合物的形成的其它方法。
[0064]上述測(cè)定法通常涉及將液相中未結(jié)合的蛋白與結(jié)合抗原-抗體復(fù)合物的固相支持物分離?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的固體支持物包括基底諸如硝基纖維素(例如，膜或微滴定孔的形式)；聚氯乙烯(例如，片或微滴定孔)；聚苯乙烯膠乳(例如，珠或微滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化紙(diazotized paper);尼龍膜；活化珠、磁反應(yīng)性珠(magneticallyresponsive bead)等。
[0065]更具體地，可使用ELISA方法，其中微滴定板的孔包被有抗待測(cè)試蛋白的抗體。然后將含有或懷疑含有標(biāo)記物蛋白的生物樣品加入包被的孔中。在孵育足夠時(shí)間以使得形成抗體-抗原復(fù)合物后，可以洗滌該板以除去未結(jié)合的部分，再加入可檢測(cè)地標(biāo)記的二級(jí)結(jié)合分子。使二級(jí)結(jié)合分子與任何捕獲的樣品標(biāo)志物蛋白反應(yīng)，洗滌板并使用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)二級(jí)結(jié)合分子的存在。
[0066]本發(fā)明的方法可以進(jìn)一步包括由將S100B的表達(dá)水平與參考值進(jìn)行比較組成的步驟，其中檢測(cè)到樣品中測(cè)定的表達(dá)水平與參考值的差異指示受試者是否處于患有或發(fā)展氣道聞反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，參考值可以是指數(shù)值，或者可以源自一個(gè)或多個(gè)氣道高反應(yīng)事件的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)算法或計(jì)算指數(shù)。參考值可相對(duì)于源自群體研究的數(shù)字或值，包括不限于具有類似的機(jī)體質(zhì)量指數(shù)的受試者、相同或類似年齡范圍的受試者、相同或類似種族的受試者、具有氣道疾病的家族史的受試者,或相對(duì)于可引起氣道高反應(yīng)的經(jīng)歷氣道疾病治療的受試者的起始樣品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，參考值從源自一個(gè)或多個(gè)基本健康的受試者(即，無氣道高反應(yīng)的受試者)的對(duì)照樣品中SlOOB的水平獲得。此類基本健康的受試者缺少氣道高反應(yīng)的傳統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)因子:例如，目前不吸煙，無診斷出的氣道疾病病史。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在此類測(cè)試之后的診斷上相關(guān)的時(shí)期(“縱向研究”)內(nèi)監(jiān)測(cè)和/或周期性再測(cè)試此類受試者以驗(yàn)證氣道高反應(yīng)事件的持續(xù)不存在。此類時(shí)期可以是從確定參考值的起始測(cè)試日期起的I年、2年、2到5年、5年、5到10年、10年、或10年或以上。此外，可使用適當(dāng)累積的歷史受試者樣品中的S100B水平的追溯測(cè)量來產(chǎn)生這些參考值，從而縮短所需研究時(shí)間，假定受試者在產(chǎn)品訴求(product claim)的預(yù)期范圍的干預(yù)期間已被適當(dāng)隨訪。通常，處于氣道高反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的受試者中S100B的水平被認(rèn)為高于從普通群體或從健康受試者獲得的參考值。
[0068]本發(fā)明將進(jìn)一步以以下附圖和實(shí)施例進(jìn)行說明。然而，這些實(shí)施例和附圖將不以任何方式解釋為限制本發(fā)明范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0069]圖1:在wt小鼠中LPS灌輸后肺和血清中S100B蛋白的幻影的動(dòng)力學(xué)。5只小鼠的組用LPS(IOyg)灌輸并在不同時(shí)間點(diǎn)(0、30min、2h、4h、和6h)安樂死。通過測(cè)量中性粒細(xì)胞募集(A)Ji (B)和血清(C)中IL-6、TNF-a和S100B濃度(μ g/ml)來控制炎癥幻影。LPS誘導(dǎo)肺(直到30min(C))中和血清(直到4h)中S100B的產(chǎn)生。所有結(jié)果都通過平均值+sem表示。
[0070]圖2:在SlOOb+和 SlOOb+小鼠中氣道高反應(yīng)的評(píng)估。鼻內(nèi)施用對(duì)照鹽水(NaCl)溶液不影響wt中的PenH，也不影響SlOOb+(A)和SlOOb+(B)中的PenH。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次，對(duì)于每個(gè)條件使用5只小鼠。一個(gè)拷貝S100B基因的喪失趨于降低PenH值(A)，而這些值在SlOOb+小鼠中顯著降低⑶。通過中性粒細(xì)胞募集(C) ,BALF中IL-6和TNF- α細(xì)胞因子(D)和髓過氧化物酶(MPO)活性來測(cè)量肺部炎癥。NaCl不影響任何參數(shù)。LPS細(xì)胞和炎癥反應(yīng)沒有顯示與wt相比雜合子或純合子突變體中測(cè)量的參數(shù)的任何變化。
[0071]圖3:用S100B抗體處理降低LPS依賴的氣道高反應(yīng)。5只小鼠的組用對(duì)照等滲NaCl溶液、LPS或LPS加上I或2mg S100B抗體處理。該實(shí)驗(yàn)在C57BL/6J小鼠上進(jìn)行兩次。Img S100B抗體足以降低PenH值(A),但使用2mg的反應(yīng)更均勻(homogenous)。S100B抗體的存在不改變LPS刺激后24H中性粒細(xì)胞募集⑶、BALF中的MPO活性(C)或TNF- a (D)和IL-6(E)濃度。
[0072] 圖4 =SlOOB抗體對(duì)Prmt2+/_小鼠(LPS反應(yīng)增加的模型)的效果的表征。⑷與用等滲鹽水溶液(NaCl)處理的對(duì)照小鼠相比，用LPS灌輸?shù)腜rmt2+~j、鼠顯示AHR加重。施用2mg S100B抗體顯著降低所述反應(yīng)。與wt小鼠相比，Prmt2+/_小鼠在LPS灌輸后具有增加的炎癥，其特征在于中性粒細(xì)胞募集(B)、BALF中的MPO活性(C)以及TNF-α⑶和IL_6(E)濃度的增加。施用S100B抗體不改變?cè)黾拥姆尾垦装Y反應(yīng)，表明Prmt2和S100B在調(diào)節(jié)肺部炎癥中的獨(dú)立作用。所有結(jié)果都通過平均值+sem表示。Student’ s t-檢驗(yàn):*P < 0.05。[0073]圖5 =MslYah小鼠模型中SlOOb的表達(dá)。(A)在對(duì)照和MslYah突變小鼠中全身注射LPS后90分鐘，與對(duì)照小鼠相比，發(fā)現(xiàn)BALF中的S100B濃度更低。在鹽水對(duì)照溶液(NaCl)注射(A)后或在血漿血清⑶中沒有觀察到變化。與MslYah(C)相比，LPS刺激后2h,在Prmt2突變小鼠的肺中SlOOb的表達(dá)增加。Student’ s t_檢驗(yàn):**P ^ 0.01。
[0074]圖6 =SlOOb中和抗體降低OVA模型中的肺反應(yīng)。(A)與對(duì)照小鼠相比，在OVA敏化的BALB/cJ小鼠之后觀察到嗜酸性粒細(xì)胞的募集(η = 6個(gè)體的組；重復(fù)兩次)。(B)在最后OVA敏化后BALB/cJ血清中SlOOb濃度增加，并且乙酰甲膽堿(Mch)增強(qiáng)了最后卵清蛋白注射后24小時(shí)的S100B的產(chǎn)生。如果不將小鼠針對(duì)OVA敏化并且在Mch之前16h用中和抗體處理，則沒有發(fā)現(xiàn)呼吸作用。相反，與未處理的小鼠相比，最后OVA敏化前16h注射的中和抗體顯著降低處理小鼠中的Penh值。Student’ s t_檢驗(yàn):*P < 0.05。
[0075]圖7:NaCl(A、B、D)或LPS處理(C、E)后4h來自wt小鼠的蘇木素染色的肺切片上SlOOb蛋白的免疫組織化學(xué)染色(初始放大倍數(shù):A:x40 ；B-E:x20)。(A)稀有細(xì)胞，可能是駐留的肺泡巨噬細(xì)胞(A)，在未刺激肺中是SlOOb陽(yáng)性的。(B-E)LPS灌輸后，在肺泡(B-C)和細(xì)支氣管周圍(D、E)，表達(dá)S100B的細(xì)胞數(shù)明顯增加。
【具體實(shí)施方式】
[0076]實(shí)施例1:在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷和卵清蛋白誘導(dǎo)的哮喘模型中SlOO鈣結(jié)合蛋白B調(diào)節(jié)氣道反應(yīng)
[0077]介紹
[0078]呼吸道疾病(RD)諸如哮喘的患病率在過去幾十年內(nèi)增加了(Umetsu等人，2002)。為了更好地理解病理生理學(xué)、鑒定關(guān)鍵標(biāo)志物和測(cè)試治療策略，在小鼠中開發(fā)了 RD模型(Matute-Bello等人，2008 ;Nials和Uddin, 2008)。因此，灌輸脂多糖(LPS)在小鼠中誘導(dǎo)了類似于急性肺損傷的肺反應(yīng)，并且對(duì)卵清蛋白(OVA)敏化、隨后乙酰甲膽堿刺激目前用于模擬哮喘。那些RD模型引發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答，對(duì)肺上皮細(xì)胞具有特異性作用。
[0079]LPS刺激后，氣道表現(xiàn)出可以通過非侵入性體積描記法監(jiān)測(cè)的高反應(yīng)。在氣道中募集并激活巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，并且局部產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，諸如TNF-α和IL-6。簡(jiǎn)而言之，與額外分子結(jié)合或不結(jié)合的LPS結(jié)合其受體TLR4，其導(dǎo)致NF- κ B轉(zhuǎn)錄因子的激活，所述轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中其刺激基因轉(zhuǎn)錄(Dalloneau等人，2011a ；Karin和Ben-Neriah, 2000 ；Takeda和Akira, 2007)。除了經(jīng)典途徑，LPS誘導(dǎo)支氣管肺泡空間(Uchida, 2006)中AGER “高級(jí)糖基化終產(chǎn)物特異性受體”(也稱為RAGE)及其配體SlOO鈣結(jié)合蛋白B SlOOb (Morbini等人，2006)的表達(dá)的增加。AGER屬于細(xì)胞表面受體的免疫球蛋白超家族。AGER通過TIRAP和MyD88與TLR信號(hào)傳導(dǎo)通路相互作用，以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和其它功能(Sakaguchi等人，2011b)。AGER在發(fā)育過程中以組成型方式表達(dá)，然后在成年期其表達(dá)被限制在某些組織中(Brett等人，1993 ；Sasaki等人，2001)。然而,其表達(dá)在肺中更為重要，其中其在I型和II肺泡肺細(xì)胞中、巨噬細(xì)胞中和支氣管上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)(Cheng等人，2005 ；Dahlin, 2004 ；Morbini 等人，2006)。 [0080]SlOOb是AGER配體之一，屬于具有Ca2+-結(jié)合特性的25種蛋白的家族(Donato, 2001 ;Donato等人，2009)。像其它家族成員，SlOOb涵蓋通過鉸鏈區(qū)互連的EF-手型的兩個(gè)Ca2+-結(jié)合位點(diǎn)和C-末端區(qū)域(Donato, 1999)。SlOOb作為同源二聚體(Rustandi等人，2000)或作為S100b/S100al異源二聚體(Donato, 2001)存在。SlOOb在有限數(shù)量的細(xì)胞類型中表達(dá)，根據(jù)細(xì)胞類型和微環(huán)境具有不同結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)SlOOb可以改變細(xì)胞增殖和分化(Arcuri, 2004)，調(diào)節(jié)微管裝配(Donato, 1988)、調(diào)節(jié)p53依賴的轉(zhuǎn)錄(Wilder等人，2006)或抑制細(xì)胞凋亡和分化(Donato等人，2009)。此外，SlOOb由星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放至細(xì)胞外空間中(Eldik和Zimmer, 1987),并且其還在血清中被發(fā)現(xiàn)(Donato等人，2009)。作為細(xì)胞外因子，SlOOb與AGER相互作用，并根據(jù)蛋白濃度、細(xì)胞類型和微環(huán)境導(dǎo)致有益或有害結(jié)果(Donato等人，2009)。在人肺部，在支氣管周圍神經(jīng)和間質(zhì)樹突細(xì)胞的水平表達(dá)SlOOb (Morbini等人，2006)。SlOOb與AGER的結(jié)合激活內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉肺細(xì)胞、單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞T,其涉及細(xì)胞因子和促炎粘附分子的產(chǎn)生(Donato等人，2009 ;Hofmann等人，1999 ；Yan 等人，2003)。
[0081 ] 在本研究中，我們進(jìn)一步繼續(xù)MslYah小鼠的研究，所述MslYah小鼠攜帶Col6al-Prmt2遺傳區(qū)間的缺失，并且在LPS刺激后顯示更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)和抑制的氣道高反應(yīng)(AHR) (Besson等人，2007)。我們證實(shí)了 Prmt2在炎癥反應(yīng)增加和AHR(這是比MslYahLPS-誘導(dǎo)的表型更強(qiáng)且相對(duì)的反應(yīng))中的作用(Dalloneau等人，2011a)。我們用在小鼠中LPS灌輸后肺和血清中產(chǎn)生的SlOOb發(fā)現(xiàn)了新的候選物。因此，我們通過使用基因敲除方法或使用中和抗體研究了改變SlOOb功能的后果，并且我們發(fā)現(xiàn)，SlOOb在控制LPS誘導(dǎo)的AHR中是關(guān)鍵作用因子。此外，我們證明，中和抗體處理在哮喘的OVA敏化模型中降低了乙酰甲膽堿誘導(dǎo)的氣道反應(yīng)性。這些觀察結(jié)果將SlOOb作為調(diào)節(jié)支氣管高反應(yīng)性的級(jí)聯(lián)的主要貢獻(xiàn)者，并強(qiáng)調(diào)SlOOb阻斷作為用于治療RD包括急性肺損傷和哮喘的潛在治療策略。
[0082]材料和方法:
[0083]小鼠品系
[0084]S100B+/_小鼠由 Xiong等人(44)描述，其攜帶SlOOb的外顯子2 (其包括ATG翻譯起始密碼子)的缺失，其側(cè)翼5’和3’內(nèi)含子序列被新霉素抗性(neo)選擇盒替換。在標(biāo)準(zhǔn)條件下用兩對(duì)引物通過PCR鑒定野生型和突變體SlOOb等位基因的存在。Prmt2和MslYah突變小鼠之前已有描述(Besson等人，2007 ；Dal1neau等人，2011b ；Yoshimoto等人，2006)。
[0085]施用LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克
[0086]在深度麻醉下通過鼻內(nèi)灌輸用等滲鹽水溶液或10 μ g LPS (大腸埃希氏菌，血清型055B5, IOmg, Sigma - Aldrich, St Louis, USA)處理動(dòng)物(η = 10)。在 LPS 灌輸前 16h 通過
1.P.施用Img或2mg的多克隆抗S100B抗體(Santa cruz)。
[0087]氣道抗性和支氣管肺泡灌洗液
[0088]在深度麻醉下通過鼻內(nèi)灌輸用等滲鹽水溶液(NaCl0.9% )或10 μ g LPS (大腸埃希氏菌，血清型 055B5, IOmg, Sigma - Aldrich, StLouis, USA)處理動(dòng)物(η = 10)。使用全身體積描記法和PenH(負(fù)責(zé)呼吸概況的無量綱參數(shù))的測(cè)量結(jié)果，考慮在呼吸周期過程中在封閉室中測(cè)量的呼氣期和壓力變化(EMKA Technologies, Paris, France)，在處理后6h期間內(nèi)研究氣道反應(yīng)?？梢詫enH概念化為胸流量和鼻流量曲線的相移。相移增加與呼吸系統(tǒng)阻力增加相關(guān)。通過式PenH = (Te/RT-l)X PEF/PIF計(jì)算PenH，其中Te為呼氣時(shí)間，RT為松弛時(shí)間，PEF為呼氣流量峰值，且PIF為吸氣流量峰值(Togbe等人，2007)。使用Datanalyst軟件(EMKA Technologies)分析數(shù)據(jù)，并表示為平均值土sem(平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。刺激后二十四小時(shí)，將小鼠安樂死并如前所述分析BALF的細(xì)胞組成和細(xì)胞因子定量。等分試樣用臺(tái)盼藍(lán)溶液進(jìn)行染色并分析，以確定細(xì)胞含量。在顯微載玻片上離心后，將空氣干燥的制備物固定，并使用May-Griinwald-Giemsa著色法用Diff-Quick(Merz&Dade)染色。兩次計(jì)數(shù)兩百個(gè)細(xì)胞，用于測(cè)定BALF中每種細(xì)胞類型的差異計(jì)數(shù)。將一部分肺儲(chǔ)存在_80°C用于髓過氧化物酶(MPO)測(cè)定(Besson等人，2007 ；Dal1neau等人，2011a)。
[0089]細(xì)胞因子的測(cè)量和髓過氧化物酶測(cè)定法
[0090]使用供應(yīng)商(RnD Systems)的方案在標(biāo)準(zhǔn)條件下通過Elisa測(cè)試評(píng)估IL-6和TNF-α濃度。以V4稀釋血清并未稀釋地使用BALF。通過讀板器EL800 (ΒΙ0-ΤΕΚINSTRUMENTS)閱讀96孔板。對(duì)于MPO測(cè)量，用鹽水灌注右心室以沖洗血管內(nèi)容物，并將肺冷凍在-80°C直至使用。將肺通過polytron勻漿并離心，并棄去上清液。將沉淀重懸浮于Iml含有0.5%十六烷基三甲基溴化銨(HTAB)和5mM EDTA的PBS中。離心后，將50 μ I上清液置于具有200 μ I PBS-HTABEDTA、2ml HBSS、100 μ I 鄰-聯(lián)茴香胺二鹽酸鹽(1.25mg/ml)和100 μ I Η2020.05%的試管中。在攪拌器中在37°C下孵育15min后，用100 μ I NaN31%停止反應(yīng)。將MPO活性測(cè)定為在460nm針對(duì)介質(zhì)的吸光度。
[0091]施用LPS誘導(dǎo)的全身內(nèi)毒素休克
[0092]小鼠接受腹腔注射100 μ g LPS (血清型055B5) (η = 10)或鹽水對(duì)照溶液(η = 6)，以評(píng)估體內(nèi)全身炎癥反應(yīng)(Besson等人，2007)。90min后,將小鼠安樂死,通過股靜脈收集血液并以2000rpm離心15min，收集血清并儲(chǔ)存在_20°C下用于細(xì)胞因子測(cè)定。然后，打開胸部，并通過將IOml PBS注入心臟的右心室而洗滌肺。肺褪色成白色。然后移除心臟-肺塊，然后將肺分離并儲(chǔ)存在浸在液氮中的管中。使用肺來通過QRT-PCR研究目標(biāo)基因的表達(dá)。
[0093]OVA敏化和肺反應(yīng)
[0094]我們開發(fā)了用于哮喘的急性鼠模型。在第I和7天通過腹膜內(nèi)注射100 μ I由無菌NaClO, 9% 中 20mg/ml 氧氧化招(Sigma A8222, Sigma-Aldrich)中吸附的 0，5mg/ml OVA(卵清蛋白，0VA，V級(jí)-Sigma)構(gòu)成的溶液而敏化雄性BALB/cJ小鼠。然后在第18至21天以卵清蛋白攻擊小鼠。為此，將小鼠用氯胺酮(50mg/kg)和甲苯噻嗪(3，5mg/kg)麻醉,并用25 μ 10，4mg/ml的OVA溶液灌輸。在第17天，首次攻擊之前16h，一組小鼠通過1.p.接受2mg抗S100B抗體(Santa Cruz)。對(duì)照組僅用NaClO, 9%敏化和攻擊。如上所述,在第22天，在最后攻擊后18和24h之間，通過全身體積描記法評(píng)估支氣管反應(yīng)性。在第22天，就在體積描記法獲取之后，收集血清、BALF和肺樣品。對(duì)于每組總數(shù)12只動(dòng)物，進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)。在體積描記器上獲取的方案由30min穩(wěn)定化小鼠(未記錄值)，然后30min測(cè)量基礎(chǔ)值(記錄，稱為基礎(chǔ)值)，然后霧化NaCl0.9% 30秒和隨后30min記錄信號(hào)，然后四次霧化30秒的漸增量的乙酰甲膽堿(0.05 ;0.1 ;0.2和0.3M)(被20min記錄信號(hào)所間隔)所組成。然后用Datanalyst軟件處理數(shù)據(jù)。
[0095]SlOOb的免疫檢測(cè)
[0096]為了免疫檢測(cè)S100B、α-肌動(dòng)蛋白和SV2，將肺通過在6小時(shí)過程中浸潰在PBS中的冰冷4% (w/v) PFA中而固定，在PBS中洗滌，并包埋在石蠟中。免疫染色之前，將來自石蠟包埋組織的組織學(xué)切片收集在載玻片上，在40分鐘過程中在94 °C浴中用Tr i s-EDTA緩沖液(IOmM Tris堿，ImM EDTA溶液，0.05% Tween20, pH9.0)處理。對(duì)于免疫染色，在4°C下將切片與單獨(dú)的兔多克隆抗體SlOOB (1/10000稀釋，HPAO15768, Sigma Aldrich)孵育過夜用于色原免疫染色，或者與兔多克隆抗體S100B (1/10000稀釋，HPA015768，Sigma Aldrich)與小鼠單克隆抗體 SV2 (1/500稀釋 SV2_c, Developmental Studies Hybridoma Bank)或肌動(dòng)蛋白α平滑肌(1/10000稀釋，Α5228，Sigma Aldrich)的組合孵育過夜用于雙重免疫熒光染色。對(duì)于SlOOb的色原免疫染色,根據(jù)制造商的說明書,使用elite vectastain ABC技術(shù)(PK-6101, Vector)實(shí)現(xiàn)主要抗體的檢測(cè)。使用二氨基聯(lián)苯胺片(D4168, Sigma Aldrich)顯示過氧化物酶。對(duì)于免疫突光，通過使用1/500稀釋的Cy3-結(jié)合的山羊抗兔IgG(JacksonTmmuno Research Laboratories)(對(duì)于 S100B)或 Alexa-Fluor-488-結(jié)合的小鼠抗體(Molecular Probes ;對(duì)于SV2和肌動(dòng)蛋白)將切片在室溫孵育I小時(shí)而實(shí)現(xiàn)主要抗體的檢測(cè)。將切片用DAPI復(fù)染。
[0097]統(tǒng)計(jì)分析
[0098]經(jīng)由Statgraphics 軟件(Centurion XV, Sigma plus, Levallois Perret)使用參數(shù) Fischer Student’ s t_ 檢驗(yàn)(當(dāng)適用時(shí))或非參數(shù) Wilcoxon Mann - Whitney’ s U 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。值表示為平均值土SEM，且顯著性閾值為P〈0.05，或另有說明。
[0099]研究批準(zhǔn)
[0100]所有小鼠程序由ICS或TAAM的當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)。YH,作為本研究中的主要研究員，被授予認(rèn)證45-31和67-369以進(jìn)行所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)。
[0101]結(jié)果:
[0102]LPS刺激后SlOO b在肺和血清中表達(dá)
[0103]為了研究SlOOb在LPS誘導(dǎo)的呼吸和炎癥反應(yīng)中的作用，我們首先檢查了 LPS攻擊后蛋白的產(chǎn)生。C57BL/6J(B6)小鼠組用LPS(IOyg)灌輸并在不同時(shí)間點(diǎn)(0、30min、2h、4h、和6h)安樂死。我們通過測(cè)量支氣管肺泡灌洗流體中巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)目加上兩種促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的濃度評(píng)價(jià)肺炎癥(BALF ;圖1)。在O和2h之間，巨噬細(xì)胞是BALF中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞類型。2h后中性粒細(xì)胞開始被募集，并且我們觀察到在2h和4h之間巨噬細(xì)胞減少和中性粒細(xì)胞增加的轉(zhuǎn)變(圖1A)。TNF- α已經(jīng)在O和30min以弱濃度檢測(cè)到，并且強(qiáng)烈產(chǎn)生，直到LPS攻擊后2h (圖1B)。IL-6的分泌在30min開始，其中在2h時(shí)有重要增加(圖1B)。在LPS刺激后30min，在BALF中強(qiáng)烈產(chǎn)生SlOOb，顯示在2h的集中聚集(a pick of accumulation),隨后LPS處理后緩慢減少(圖1)。我們?cè)谘逯杏^察到相同現(xiàn)象，其中在Omin時(shí)TNF-α已經(jīng)以低水平存在。LPS刺激后4h，TNF-α、IL-6和SlOOb的血清濃度以敏感方式增加(圖1C)。所有這些結(jié)果顯示，SlOOb在肺和血清中表現(xiàn)出與促炎細(xì)胞因子相同的動(dòng)力學(xué)。因此，SlOOb是肺反應(yīng)的標(biāo)志物，其聚集動(dòng)力學(xué)與通過LPS直接控制的促炎細(xì)胞因子相當(dāng)類似。
[0104]LPS灌輸導(dǎo)致SlOOb+小鼠中AHR降低而不影響肺中的炎癥
[0105]根據(jù)SlOOb在BALF中的聚集，我們?cè)赟lOOb突變小鼠中LPS攻擊之后監(jiān)測(cè)肺中的變化。我們使用全身體積描記法，并且我們對(duì)反映呼吸模式的暫停增強(qiáng)時(shí)間(PenH)評(píng)分以評(píng)價(jià)SlOOb突變小鼠中肺對(duì)LPS的反應(yīng)。如先前顯示，攜帶單一拷貝SlOOb的MslYah小鼠在LPS灌輸后具有降低的呼吸反應(yīng)(Besson等人，2007)。為了研究SlOOb在AHR中的精確作用，我們使用SlOOb的功能喪失等位基因(Xiong等人，2000)，并且我們比較了用LPS(IOyg)或鹽水(NaCl)對(duì)照溶液灌輸?shù)膶?duì)照野生型(wt)動(dòng)物、雜合子(S100b+/_)和純合子(SlOOb—勺突變個(gè)體。如由Wt小鼠與S100b+/-和SlOOb+兩者中的PenH所評(píng)價(jià)，用鹽水溶液處理不影響呼吸功能(圖2A-B)。LPS灌輸在wt小鼠中誘導(dǎo)AHR，其特征在于PenH值優(yōu)于5的增加。S100b+/_小鼠中PenH值趨于降低(圖2B)，而SlOOb+小鼠中AHR顯著降低(圖2A)。兩個(gè)拷貝SlOOb的喪失對(duì)LPS刺激誘導(dǎo)的AHR具有主要影響。
[0106]與野生型小鼠相比，LPS灌輸?shù)腗slYah小鼠在支氣管肺泡空間中具有增強(qiáng)的炎性細(xì)胞募集和TNF- α和IL-6產(chǎn)生(Besson等人，2007)，我們將其與Prmt2關(guān)聯(lián)(Dalloneau等人，2011a)。我們研究了 SlOOb在局部炎癥反應(yīng)中的參與。灌輸LPS或鹽水對(duì)照溶液后24小時(shí)，我們測(cè)量了野生型、S100b+/_和SlOOb+小鼠中LPS誘導(dǎo)的炎癥。我們追蹤了 BALF中的中性粒細(xì)胞募集(圖2C)、髓過氧化物酶(MPO)活性(圖2D)和TNF-α和IL-6的濃度(圖2Ε)。用鹽水對(duì)照溶液灌輸?shù)男∈鬀]有呈現(xiàn)炎癥細(xì)胞募集類型的任何變化。測(cè)量的炎癥參數(shù)在wt和S100b+/_或SlOOb+小鼠之間沒有呈現(xiàn)任何變化。因此，我們?cè)谶@里證明，改變SlOOb基因功能強(qiáng)烈損害LPS誘導(dǎo)的AHR，但不干擾肺中的炎癥反應(yīng)。
[0107]中和抗SlOOb抗體降低C57BL/6J小鼠中的AHR而不影響肺中的炎癥
[0108]SlOOb的失活降低了 LPS處理后的肺反應(yīng)而不改變炎癥信號(hào)的分泌。然后我們想知道抗SlOOb的中和抗體是否改變LPS誘導(dǎo)的AHR。使用注射多克隆抗SlOOb抗體，我們?cè)谝吧虲57BL/6J(B6)小鼠中進(jìn)行被動(dòng)免疫。我們將三組B6小鼠與5個(gè)個(gè)體進(jìn)行比較，所述5個(gè)個(gè)體為:用對(duì)照鹽水溶液處理的個(gè)體、用LPS灌輸?shù)牧硪粋€(gè)陽(yáng)性對(duì)照和接受LPS前16h腹膜內(nèi)(1.p.)注射Img或2mg抗SlOOb的多克隆抗體的兩個(gè)額外個(gè)體(Vandal等人，2003b)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地進(jìn)行兩次以達(dá)到η = 10個(gè)體每組?？筍lOOb預(yù)注射導(dǎo)致與僅接受LPS的小鼠相比PenH值的顯著降低。Img抗體足以降低AHR,然而使用2mg的反應(yīng)更均勻(圖3A)。抗SlOOb對(duì)BALF中觀察的炎癥沒有影響，因?yàn)榕c單獨(dú)的LPS刺激的小鼠相比，在接受Img或2mg抗體加上LPS的小鼠中測(cè)量的參數(shù)均沒有改變(圖3B-E)。此外，在處理的小鼠中沒有注意到異常行為變化。在類似條件下用中和抗體處理的BALB/cJ小鼠中觀察到類似結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。所有獲得的結(jié)果證實(shí)，SlOOb參與LPS誘導(dǎo)的AHR。SlOOb的活性可以被中和抗體完全衰減而對(duì)LPS攻擊過程中的炎癥沒有強(qiáng)烈后果。
[0109]中和抗SlOOb降低Prmt2+/_小鼠(LPS反應(yīng)增加的模型)中的AHR
[0110]與wt相比，Prmt2+/_突變小鼠在LPS灌輸后呈現(xiàn)出推遲、但加重的AHR(Dalloneau等人，2011a)。這些小鼠還呈現(xiàn)在血清和BALF兩者中增加的促炎癥反應(yīng)。然后，我們測(cè)試了 SlOOb抗體對(duì)Prmt2缺陷小鼠中觀察到的氣道反應(yīng)增加的作用。如前一段中描述，在Prmt2+/_小鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？筍100B處理導(dǎo)致與僅接受LPS的小鼠相比PenH值的顯著降低(圖4A)。與wt小鼠相比，用S100B抗體處理的Prmt2+〃小鼠表現(xiàn)出相同加重的炎癥反應(yīng)，其具有在BALF中分泌的更高水平的TNF- α和IL-6，與僅接受LPS的Prmt2+/_小鼠類似(圖4B-E)。對(duì)于Prmt2純合子突變體發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0111] 然后，我們追蹤全身注射LPS后的SlOOb反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)SlOOb在肺中比血清中更重要地分泌(圖5A、B)。有趣的是，SlOOb的表達(dá)被突變小鼠中Prmt2的功能喪失進(jìn)一步刺激，增強(qiáng)了 SlOOb對(duì)于LPS誘導(dǎo)的肺AHR是關(guān)鍵的假設(shè)(圖5C)。這些結(jié)果一方面證實(shí)了SlOOb參與LPS誘導(dǎo)的AHR，另一方面證實(shí)了 SlOOb不是LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)的主要作用因子。其證實(shí)了(I) SlOOb應(yīng)當(dāng)通過LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中Prmt2依賴性途徑、受LPS/TLR4和S100b/AGER信號(hào)傳導(dǎo)途徑控制的NF-Kb轉(zhuǎn)錄因子而起作用；和(2)Prmt2和SlOOb功能的抑制對(duì)于重現(xiàn)MslYah突變體中LPS誘導(dǎo)的表型是需要的(Besson等人，2007)。
[0112]中和抗SlOOb降低OVA哮喘小鼠模型中的AHR
[0113]SlOOb抗體降低wt和Prmt2+小鼠中LPS誘導(dǎo)的AHR。因此，我們探討SlOOb在另一種肺攻擊、卵清蛋白(OVA)哮喘鼠模型中的效果。用卵清蛋白敏化后，BALB/cJ小鼠在用乙酰甲膽堿進(jìn)一步攻擊后呈現(xiàn)出AHR和組織炎癥。肺部過敏性哮喘需要淋巴細(xì)胞T輔助細(xì)胞2(LTh2型)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。這些細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，引發(fā)嗜酸性粒細(xì)胞募集到炎癥部位。我們首先檢查了該OVA誘導(dǎo)的哮喘中SlOOb的產(chǎn)生。在第O和7天使兩組5只小鼠對(duì)卵清蛋白敏化，并且在第18、19、20和21天用過敏原攻擊。在第22天，一組接受增加量的乙酰甲膽堿(Mch, O, 05 ;0，I ;0，2和0，3M)。在t = 0、2h、6h和24h時(shí)將小鼠處死，并且我們?cè)u(píng)估了嗜酸性粒細(xì)胞的募集和SlOOb產(chǎn)生(圖6)。募集嗜酸性粒細(xì)胞直至2h，并且在最后攻擊后24h仍然存在于BALF。在無Mch的組中，在6h時(shí)在血清中檢測(cè)到SlOOb，但在24h時(shí)減少。乙酰甲膽堿似乎放大了反應(yīng):用Mch攻擊的小鼠顯示高于未攻擊小鼠中發(fā)現(xiàn)的SlOOb濃度。然后我們檢查了在幼稚小鼠和敏化小鼠中抗SlOOb的抗體的效果(圖6C-D)。在用Mch攻擊第22天測(cè)量呼吸功能之前，如下所述，將兩組6只小鼠敏化，然后以卵清蛋白進(jìn)行攻擊。
[0114]在第17天，OVA攻擊前16h，一組接受2mg的S100B抗體。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立地重復(fù)兩次。在對(duì)Mch攻擊正常反應(yīng)的對(duì)照幼稚小鼠中沒有觀察到顯著效果(圖6C)。OVA敏化后，小鼠呈現(xiàn)出對(duì)Mch的高反應(yīng)性，并且我們發(fā)現(xiàn)，Mch的量越重要，抗體的效果越顯著(圖6D)。事實(shí)上，與對(duì)照小鼠相比，接受抗體的小鼠趨向于具有較低的PenH值。S100B蛋白的抑制在OVA哮喘模型中降低了 Mch-誘導(dǎo)的高反應(yīng)性。這些結(jié)果使得預(yù)見能夠抑制SlOOb活性的分子尤其在肺疾病諸如哮喘中的治療影響。
[0115]SlOOb在肺中表達(dá)并且在LPS刺激后增加。
[0116]抗SlOOb的中和抗體能夠降低AHR，而不改變LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。然后我們?cè)噲D破譯SlOOb反應(yīng)的細(xì)胞成分是什么？為了檢測(cè)LPS處理前后鼠肺中的SlOOb，我們?cè)谛∈蠓谓M織切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)。在用NaCl處理的正常條件下，發(fā)現(xiàn)SlOOb散布在肺泡壁的細(xì)胞中。在肺泡內(nèi)空間中發(fā)現(xiàn)幾個(gè)表達(dá)細(xì)胞，并且基于其位置和形態(tài)將其鑒定為巨噬細(xì)胞(圖7A)。LPS灌輸后四小時(shí)，與對(duì)照NaCl處理的肺相比，SlOOb表達(dá)在LPS處理的肺中高得多(圖7B-E)。用LPS灌輸四小時(shí)后的肺切片的蘇木精和伊紅(H&E)染色顯示在肺的肺泡和細(xì)支氣管周圍空間中炎癥細(xì)胞(基本上為表達(dá)SlOOb的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的增加。使用免疫熒光法，我們發(fā)現(xiàn)，與H&E切片上觀察到的炎癥細(xì)胞類似，表達(dá)SlOOb的細(xì)胞基本上在肺泡的間質(zhì)空間中和細(xì)支氣管周圍被發(fā)現(xiàn)，顯示SlOOb在LPS灌輸后募集的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞中表達(dá)。
[0117]由于在抗S100B處理的小鼠中不再觀察到LPS介導(dǎo)的AHR，我們檢查了均參與肺反應(yīng)的細(xì)支氣管周圍平滑肌細(xì)胞和神經(jīng)叢中S100B的表達(dá)。如用泛神經(jīng)標(biāo)志物、已知在NEB和氣道神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中表達(dá)的突觸小泡蛋白2(SV2)的雙重免疫熒光染色所顯示，在支氣管上皮下的神經(jīng)束中和神經(jīng)上皮體(NEB)中發(fā)現(xiàn)SlOOb的表達(dá)。如用平滑肌α-肌動(dòng)蛋白抗體的雙重免疫熒光染色所顯示，SlOOb不在細(xì)支氣管周圍平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。在表達(dá)SV2的神經(jīng)中觀察到SlOOb的整體部分表達(dá)，顯示SlOOb將被限制在神經(jīng)的特定區(qū)域。
[0118]討論:[0119]在本報(bào)道中，我們證實(shí)了 SlOOb在急性肺損傷(ALI)的LPS模型中和OVA哮喘模型中調(diào)節(jié)呼吸功能的新作用。SlOOb對(duì)LPS誘導(dǎo)的AHR的調(diào)節(jié)具有劑量依賴性作用，而關(guān)鍵炎癥參數(shù)沒有變化?？筍lOOb的中和抗體的使用使得C57BL/6J、BALB/cJ和Prmt2缺陷小鼠中LPS誘導(dǎo)的AHR顯著降低(Dalloneau等人，2011b)。在BALF中，SlOOb從刺激的駐留巨噬細(xì)胞和肺泡中和細(xì)支氣管處的平滑肌細(xì)胞附近募集的嗜中性粒細(xì)胞分泌，表明SlOOb可能干擾AHR過程中肌肉收縮的控制。
[0120]SlOOb與受體AGER的相互作用體內(nèi)誘導(dǎo)NF- κ B轉(zhuǎn)錄因子的激活(Yan等人，1994)，和隨后尤其是肝和肺中IL-6的產(chǎn)生(Schmidt等人，2000)以及TNF-α的表達(dá)(Hofmann等人，1999)。已知AGER在敗血性休克過程中(Yamamoto等人，2011)或在肺中(Yamakawa等人，2011)在與LPS間接或直接相互作用的情況下促進(jìn)炎癥反應(yīng)。已建議AGER作為肺損傷的標(biāo)志物(Su等人，2009)，并且其表達(dá)在LPS刺激后增加(Zhang等人，2008)。已經(jīng)描述了 AGER和TLR4信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)之間的交叉對(duì)話，但是對(duì)于AGER的另一種配體(Park等人，2006 ；Qin等人，2009)。此處，我們?cè)赟lOOb突變小鼠中發(fā)現(xiàn)兩次肺攻擊中SlOOb對(duì)AHR的直接影響，在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中沒有差別。沒有觀察到細(xì)胞募集和促炎細(xì)胞因子分泌的變化。IL-6和TNF-α的表達(dá)不受影響，表明甚至在突變小鼠中不存在SlOOb或使用中和抗體的情況下TLR4/NF- κ B途徑?jīng)]有任何改變。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Prmt2(NF-kb的間接抑制劑)失活時(shí)，SlOOb表達(dá)受LPS調(diào)節(jié)，并且甚至上調(diào)(Dalloneau等人，2011a)。已經(jīng)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到SlOOb的此類LPS依賴性表達(dá)(Donato等人，2009 ;Guerra等人，2011)。在急性肺攻擊模型中，SlOOb通過與TLR4/TIRAP/MYD88/NF-kB途徑共享共同中間體的AGER來信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)氣道和炎癥反應(yīng)(Sakaguchi等人，2011a)ο
[0121]三體和部分單體21患者呈現(xiàn)對(duì)實(shí)際上代表患者的主要死亡原因的呼吸道感染的敏感性增加(Day等人，2005 ；Pandit和Fitzgerald, 2012)。為了破譯該現(xiàn)象,我們開發(fā)了不同的人21號(hào)染色體 區(qū)域的非整倍體的鼠模型(Herault等人，2012 ;Raveau等人，2012)。我們之前證實(shí)，MslYah模型呈現(xiàn)出不存在LPS誘導(dǎo)的AHR (Besson等人，2007)。Prmt2是MslYah模型中缺失的基因。其屬于蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族，并且其調(diào)節(jié)NF-kb的核聚集。我們表明，Prmt2的表達(dá)是劑量敏感的，并且在LPS處理后降低(Besson等人，2007 ；Dalloneau等人，201 Ia)。一個(gè)或兩個(gè)拷貝Prmt2缺陷的小鼠的呼吸模式的研究表明與wt小鼠相比時(shí)間也延遲并保持的加重的AHR(Dal1neau等人，2011a)。該結(jié)果指出，Prmt2-Col6al區(qū)域的至少另一個(gè)基因參與MslYah小鼠中觀察到的AHR的控制。然后，我們把我們的注意力集中在肺中表達(dá)發(fā)現(xiàn)的SlOOb (Besson等人，2007)。對(duì)于LPS灌輸后呼吸模式的本研究顯示SlOOb對(duì)調(diào)節(jié)AHR的劑量效應(yīng)。S100b+/_小鼠中PenH值趨于降低，并且在SlOOb+小鼠中顯著降低。我們首次證實(shí)了 SlOOb在以劑量依賴性方式誘導(dǎo)的LPS誘導(dǎo)的AHR中的明確作用。類似地，發(fā)現(xiàn)SlOOb在OVA哮喘模型中增加，并且中和抗體可以阻止敏化和攻擊后部分的乙酰甲膽堿誘導(dǎo)的收縮?；旧弦阎猄lOOb是一些類型癌癥(Hwang等人，2010)、腦損傷(ZurekandFedora, 2011)和心臟驟停(Song等人，2010)的標(biāo)志物，但現(xiàn)在SlOOb應(yīng)被視為肺反應(yīng)的標(biāo)志物。
[0122]功能喪失SlOOb導(dǎo)致呼吸功能的改進(jìn)，而不改變突變小鼠中肺中的炎癥反應(yīng)。最初，我們檢查了野生小鼠中SlOOb的抑制重現(xiàn)了 SlOOb+小鼠中觀察到的表型。然后，我們使用阻斷抗體來探討SlOOb在呼吸功能中的作用。用抗S100B抗體處理降低了 LPS誘導(dǎo)的HRA，而不改變B6小鼠中的炎癥反應(yīng)。在呈現(xiàn)加重AHR的Prmt2+/_和PrmtZ+ (數(shù)據(jù)未顯示)小鼠中進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)。該模型允許我們證實(shí)該抗體的作用。在這些小鼠中注射抗體導(dǎo)致Penh值的顯著降低，而不改變?cè)谕蛔凅w中保持較高的炎癥應(yīng)答。
[0123]SlOOb屬于23鈣結(jié)合蛋白的家族，并且與相同家族的其它蛋白相反，SlOOb不是肺炎癥的主要作用因子。事實(shí)上，SlOOaS和S100a9基本上在炎癥部位分泌，在那里它們誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的趨化和粘附(Ryckman等人，2003 ；Vandal等人，2003a)。S100al2經(jīng)由與AGER相互作用而起作用，導(dǎo)致促炎介質(zhì)的分泌(Hofmann等人，1999)。這些SlOO蛋白的血清濃度與炎癥疾病活動(dòng)性相關(guān)(Foell等人，2004 ；Frosch等人，2000)。LPS灌輸后，我們證實(shí)，表達(dá)SlOOb的細(xì)胞數(shù)量增加，但在SlOOb缺陷小鼠中測(cè)量的炎癥參數(shù)不改變，表明SlOOb對(duì)于誘導(dǎo)炎癥是不必需的。在正常人肺中，SlOOb在間質(zhì)樹突細(xì)胞和支氣管周圍神經(jīng)中(以高水平)、在煙霧相關(guān)損傷中的氣道樹突狀細(xì)胞中和肺炎中的間質(zhì)樹突狀細(xì)胞中(5)表達(dá)。此處，我們發(fā)現(xiàn)在肺泡駐留巨噬細(xì)胞中和LPS激活的巨噬細(xì)胞和募集的肺中性粒細(xì)胞中表達(dá)的SlOOb。但是，即使表達(dá)SlOOb的細(xì)胞數(shù)量在這些肺疾病或攻擊過程中增加，該蛋白的確切作用僅通過該系列顯示SlOOb是AHR和因此是呼吸道疾病的作用因子的實(shí)驗(yàn)而揭示。
[0124]SlOOb是鈣結(jié)合蛋白，因此其可以參與控制肌肉收縮。SlOOb在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，并且可以刺激Ca2+流量、抑制PKC-介導(dǎo)的磷酸化和微管組裝。如之前所述(5)，在肺中，SlOOb在肺泡駐留巨噬細(xì)胞和LPS刺激后募集的中性粒細(xì)胞中、神經(jīng)上皮體周圍和神經(jīng)中表達(dá)。沒有觀察到SlOOb與肺中的平滑肌 細(xì)胞的直接共定位。已知SlOOb是控制鈣儲(chǔ)備的有效性的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)物(18)。如果SlOOb作為Ca2+水平的傳感器(sense Ca2+level)，則LPS處理過程中SlOOb的分泌可以促進(jìn)肌肉收縮，限制鈣的擴(kuò)散?；蛘撸琒lOOb可以改變的Ca2+依賴性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，諸如涉及Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶的級(jí)聯(lián)，其上調(diào)免疫細(xì)胞中許多細(xì)胞因子和促炎因子(Crabtree和Olson, 2002)?；蛘?，已知SlOOb與來自細(xì)胞骨架的幾種蛋白相互作用，并且因此可以介導(dǎo)細(xì)胞重塑和細(xì)胞遷移(Donato等人，2009)。將需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來更好地理解SlOOb在AHR中的分子和細(xì)胞機(jī)制。
[0125]降低SlOOb功能且在不改變炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)的情況下降低AHR代表從治療觀點(diǎn)(特別是對(duì)于長(zhǎng)期治療)來看代表令人感興趣的途徑。事實(shí)上，如果我們考慮哮喘發(fā)作，更不利的方面是患者的呼吸困難，這一方面導(dǎo)致細(xì)支氣管收縮后從細(xì)支氣管直徑(gauge)的降低，另一方面導(dǎo)致粘液產(chǎn)生。因此，在這種情況下，令人感興趣的是促進(jìn)支氣管擴(kuò)張而不改變長(zhǎng)期治療中的炎癥反應(yīng)。事實(shí)上，用中和抗體治療可用于降低在過敏性哮喘中或慢性阻塞性支氣管肺病中觀察到的氣道阻力。今天，哮喘的主要治療仍然是持續(xù)時(shí)間較短。用糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期治療誘導(dǎo)一些副作用，諸如高血糖、骨質(zhì)疏松癥、抑郁癥(Donihi等人，2006)。在LPS模型中，已經(jīng)接受抗體的小鼠呈現(xiàn)相對(duì)低的PenH值，并且這持續(xù)獲取的所有持續(xù)時(shí)間。用單獨(dú)LPS刺激的小鼠(B6和Prmt2+/-)在60和90min之間呈現(xiàn)出PenH值的上升，然后在達(dá)到峰值后，在刺激后180min，這些值找到與已經(jīng)接受抗體的小鼠相同的基礎(chǔ)水平。該觀察結(jié)果顯示，抗SlOOb抗體的效果在LPS模型中至少持續(xù)3h ;這不是驚人的，因?yàn)閬碜宰陨砻庖咝约膊〉闹委熤惺褂玫目贵w在血清中的半衰期在8天和8周之間變化(Chan和Carter, 2010)。這對(duì)于檢查抗體在哮喘鼠模型中的作用的有效性和持續(xù)時(shí)間當(dāng)然是必要的。所有這些結(jié)果首次顯示，SlOOb蛋白在支氣管收縮中的重要性和SlOOb抗體在LPS鼠模型中的用途揭示了能夠抑制SlOOb的分子的潛在治療作用。
[0126]參考文獻(xiàn)
[0127]貫穿本申請(qǐng)，各種參考文獻(xiàn)描述了本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的現(xiàn)狀。這些參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用并入本公開內(nèi)容。
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【權(quán)利要求】
1.用于降低有需要的受試者中的氣道高反應(yīng)的方法，包括向所述受試者施用選自抗SlOOB抗體、抗S100B適配子或S100B基因表達(dá)抑制劑的試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述受試者患有選自以下的氣道疾病:哮喘、慢性阻塞性肺疾病、過敏性支氣管肺曲霉病、過敏性肺炎、嗜酸粒細(xì)胞性肺炎、肺氣腫、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化、結(jié)核病、過敏性肺炎、職業(yè)性哮喘、結(jié)節(jié)病、反應(yīng)性氣道疾病綜合征、間質(zhì)性肺病、嗜酸粒細(xì)胞增多綜合征、鼻炎、鼻竇炎、運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的哮喘、污染誘發(fā)的哮喘和肺 寄生蟲病。
3.用于確定受試者是否處于患有或發(fā)展氣道高反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括測(cè)定從所述受試者獲得的生物樣品中S100B蛋白的水平。
【文檔編號(hào)】C07K16/24GK103998466SQ201280062394
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月22日
【發(fā)明者】Y·埃羅, E·達(dá)隆諾 申請(qǐng)人:國(guó)家醫(yī)療保健研究所, 斯特拉斯堡大學(xué), 國(guó)家科學(xué)研究中心