在植物中調(diào)節(jié)β大馬酮的制作方法
【專利摘要】一種突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞，其含有：(i)包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:6具有至少60％的序列同一性的序列所組成的多核苷酸；(ii)由如(i)所示的多核苷酸編碼的多肽；(iii)與SEQ?ID?NO:2具有至少66％的序列同一性、或與SEQ?ID?NO:7具有至少60％的序列同一性的多肽；或者(iv)含有如(i)所示的分離多核苷酸的構(gòu)建體、載體或表達(dá)載體，以及其中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性與對照或野生型植物相比被調(diào)節(jié)。
【專利說明】在植物中調(diào)節(jié)β大馬酮

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開來自紅花煙草和變體的新黃質(zhì)合酶、番茄紅素β環(huán)化酶和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的多核苷酸序列、其同源物和片段。具體地，本發(fā)明描述修飾新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或由其編碼的蛋白活性來調(diào)節(jié)β大馬酮的量導(dǎo)致在煙草中新的風(fēng)味譜，所述β大馬酮的量在加熱煙草的氣霧中可檢測到。

【背景技術(shù)】
[0002]β大馬酮是烤煙的蒸餾氣霧中的芳香因子。其具有典型的水果和熟蘋果風(fēng)味，其也可在大馬士革玫瑰Mill (Rosa damascen Mill)(大馬士革玫瑰)中天然發(fā)現(xiàn),從而表明酶促途徑的存在導(dǎo)致其在一些植物中合成。大馬士革玫瑰的花以其細(xì)膩芬芳聞名，并為用于香水和制造玫瑰水的玫瑰精油進(jìn)行商業(yè)收獲。花瓣有時也直接用于風(fēng)味食品或飲料，并且對于人類消耗被視作是安全的。
[0003]類胡蘿卜素是β大馬酮生產(chǎn)的潛在前體。新黃質(zhì)的熱氧化導(dǎo)致β大馬酮的形成。新黃質(zhì)是一種含氧類胡蘿卜素衍生物，其屬于葉黃素類以及由8個類異戊二烯單元組成。在衰老和烤制葉子中，游離的新黃質(zhì)不存在或僅在非常低水平被檢測到。在發(fā)生在質(zhì)體(如葉綠體)中的植物類胡蘿卜素通路內(nèi)，已知形成新黃質(zhì)的酶屬于新黃質(zhì)合酶類。新黃質(zhì)合酶催化從紫黃質(zhì)形成新黃質(zhì)，新黃質(zhì)合酶由ΑΒΑ4多核苷酸編碼。番茄紅素β環(huán)化酶也催化從紫黃質(zhì)形成新黃質(zhì)，番茄紅素β環(huán)化酶由NeSy多核苷酸編碼。9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶催化在C25-丙二烯-脫輔基醛和黃質(zhì)中順式-新黃質(zhì)的切割，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶由NCED2多核苷酸編碼。
[0004]在本領(lǐng)域中仍然需要具有改變風(fēng)味譜的植物材料，例如煙草。本發(fā)明的目的是滿足這種需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]已經(jīng)從紅花煙草(Nicotiana tabacum)中克隆并測序了相應(yīng)的ΑΒΑ4、NeSy和NCED2基因，并且已調(diào)查了這些基因的調(diào)節(jié)的表達(dá)效果。認(rèn)為由NeSy和NCED2多核苷酸編碼的酶是類胡蘿卜素生物合成通路的組分、以及發(fā)現(xiàn)在植物中上調(diào)NeSy多核苷酸的表達(dá)和下調(diào)NCED2多核苷酸的表達(dá)增加類胡蘿卜素含量。然而，未檢測到β大馬酮的生產(chǎn)改變。令人吃驚地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)增加ΑΒΑ4多核苷酸的表達(dá)不僅增加了類胡蘿卜素含量而且還顯著地增加了在加熱煙草植物制備的烤制煙草后形成的氣霧中的β大馬酮含量。這種發(fā)現(xiàn)甚至更令人吃驚，因為NeSy多核苷酸編碼這樣的酶，其在類胡蘿卜素生物合成通路中與ΑΒΑ4多核苷酸在相同點上發(fā)揮作用，但是發(fā)現(xiàn)NeSy多核苷酸對β大馬酮水平?jīng)]有顯著效果。不愿由任何特定理論所約束，這種發(fā)現(xiàn)表示由ΑΒΑ4多核苷酸編碼的新黃質(zhì)合酶在紅花煙草的β大馬酮合成中起核心作用。這允許產(chǎn)生這樣的植物，所述植物中β大馬酮的水平被調(diào)節(jié)并因此具有改變的風(fēng)味譜。可工程化植物使得其中類胡蘿卜素含量被調(diào)節(jié)。這樣的植物可對消費者具有營養(yǎng)益處。此外，調(diào)節(jié)植物的類胡蘿卜素含量可用于生成耐受抑制類胡蘿卜素生物合成的除草劑的植物，其可延伸至類胡蘿卜素抑制劑作為目前對這些化合物敏感的作物的除草劑的用途。有利地，這些變化基本沒有改變植物的視覺外觀，所述視覺外觀是產(chǎn)業(yè)接受的重要標(biāo)準(zhǔn)并用于植物產(chǎn)量最大化等。
[0006]發(fā)明的方面和實施方案
[0007]本發(fā)明的方面和實施方案如所附權(quán)利要求所示。
[0008]在一方面，提供分離的多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:6具有至少60%的序列同一性的序列所組成。
[0009]在另一方面，提供由所述多核苷酸編碼的分離的多肽。
[0010]在另一方面，提供與SEQ ID N0:2具有至少66%的序列同一性、或與SEQ ID NO:7具有至少60%的序列同一性的分離的多肽。
[0011]在另一方面，提供含有所述分離的多核苷酸的構(gòu)建體、載體或表達(dá)載體。
[0012]在另一方面，提供突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞，其含有本文所述的分離的多核苷酸、多肽或構(gòu)建體、載體或表達(dá)載體，以及其中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性與對照或野生型植物相比被調(diào)節(jié)。
[0013]在一個實施方案中，突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物含有植物細(xì)胞。
[0014]在另一方面，提供用于調(diào)節(jié)植物的類胡蘿卜素含量的方法，包括步驟:(i)調(diào)節(jié)在植物中的新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性，優(yōu)選地，其中所述新黃質(zhì)合酶含有如本文所示的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)測量在獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物的至少部分中的類胡蘿卜素含量；以及(iii)鑒定其中其內(nèi)類胡蘿卜素含量與對照植物相比已經(jīng)變化的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物，在所述對照植物中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性未被調(diào)節(jié)。
[0015]在一個實施方案中，番茄紅素β環(huán)化酶或9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶或其組合的表達(dá)或活性在植物中也被調(diào)節(jié)。
[0016]在一個實施方案中，番茄紅素β環(huán)化酶含有如SEQ ID Ν0:8所示的或者與其具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列、或者含有如SEQ ID Ν0:9所示或與其具有至少60%的序列同一性的多肽序列，以及其中9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶含有如SEQ IDNO: 13所示的或者與其具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列。
[0017]在另一方面，提供用于調(diào)節(jié)植物的β大馬酮含量的方法，包括以下步驟:(i)調(diào)節(jié)在植物中的新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性，優(yōu)選地，其中新黃質(zhì)合酶含有本文所述的多核苷酸序列或多肽序列；(ii)測量獲自步驟(i)的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物的至少部分中的β大馬酮含量；以及(iii)鑒定其中其內(nèi)β大馬酮含量與對照植物相比已變化的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物，所述對照植物中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性未被調(diào)節(jié)。
[0018]在另一方面，提供通過本文所述的方法獲得的或可獲得的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物或源自或可源自其的植物材料。
[0019]在另一方面，提供突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物，其中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或由其編碼的蛋白的活性已經(jīng)增加；其中植物的綠葉葉黃素含量或β胡蘿卜素含量或組合的葉黃素和β胡蘿卜素含量比對照植物更高，所述對照植物中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性沒有增加；以及其中在烤制植物材料的氣霧中的β大馬酮含量比來自對照植物的氣霧中高至少10%，優(yōu)選地，其中:(i)植物的綠葉葉黃素含量是至少約18mg/100g ;(ii)其中植物的β胡蘿卜素含量是至少約12mg/100g ;以及(iii)其中加熱來自植物的葉生物質(zhì)時的氣霧中的β大馬酮含量是至少約lng/mg。
[0020]在另一方面，提供包括來自本文所述植物的植物材料，其包含生物質(zhì)、種子或葉。
[0021]在另一方面，提供含有本文所述的植物細(xì)胞、植物的至少部分或植物材料的煙草制品。
[0022]在另一方面，提供用于生產(chǎn)β大馬酮的方法，包括步驟:(a)提供如本文所述的植物的至少部分、植物材料或煙草制品；以及(b)對其供熱以產(chǎn)生含β大馬酮的氣霧。
[0023]其它方面包括下列。
[0024]含有本文所述一個或多個分離多核苷酸的嵌合基因，所述分離多核苷酸可操作地連接到一個或多個調(diào)節(jié)序列。
[0025]含有本文所述一個或多個分離多核苷酸的多核苷酸構(gòu)建體，以及所述多核苷酸構(gòu)建體包含、由或基本上由至少15-30個核苷酸、30-50個核苷酸、50-100個核苷酸、100-150個核苷酸、150-200個核苷酸、200-300個核苷酸、300-400個核苷酸、400-500個核苷酸、500-600個核苷酸或600-700個核苷酸所組成。
[0026]整合或利用如本文所述的植物材料、生物質(zhì)、種子或葉的可消費產(chǎn)品。
[0027]含有本文所述的分離多核苷酸、嵌合基因、多核苷酸構(gòu)建體、雙鏈RNA、綴合物或表達(dá)載體等的細(xì)胞系。
[0028]用于在細(xì)胞中調(diào)節(jié)本文所述的一個或多個多核苷酸表達(dá)、或者由其編碼的一個或多個多肽活性的方法，所述方法包括施用如本文所述的嵌合基因、多核苷酸構(gòu)建體、雙鏈RNA、綴合物或表達(dá)載體。
[0029]用于檢測、分離、擴(kuò)增、或分析本文所述的一個或多個多核苷酸的方法，所述方法包括步驟:提供含有多核苷酸的樣本，以及將所述多核苷酸雜交至含有來自分離核苷酸序列的至少10個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子。
[0030]一種用于在植物的至少部分中與對照植物相比調(diào)節(jié)類胡蘿卜素含量和β大馬酮含量、或者類胡蘿卜素含量或β大馬酮含量的方法，所述方法包括使用調(diào)節(jié)本文所述的一個或多個多核苷酸的表達(dá)、或由其編碼的蛋白的活性的試劑。
[0031]調(diào)節(jié)本文所述的一個或多個多核苷酸的表達(dá)、或由其編碼的蛋白的活性的試劑，用于在植物的至少部分中與對照植物相比來調(diào)節(jié)類胡蘿卜素含量和β大馬酮含量、或者類胡蘿卜素含量或β大馬酮含量的用途。
[0032]在一個實施方案中，所述試劑是或源自嵌合多核苷酸基因、含有一個或多個多核苷酸的多核苷酸構(gòu)建體、反義RNA、雙鏈RNA、cDNA、含有一個或多個多核苷酸的綴合物或者與其共價附著的至少一種非核苷酸或非多核苷酸半體、核酶、誘變劑、鋅指、小分子或大范圍核酸酶。
[0033]在另一個實施方案中，多核苷酸片段編碼反義核酸、核酶、影響剪接體介導(dǎo)的反式剪接的RNA、干擾RNA、向?qū)NA、或其它非翻譯RNA等。在另一實施方案中，多核苷酸片段編碼干擾RNA。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:在植物中的類胡蘿卜素通路的簡化版本。新黃質(zhì)和葉黃素是有助于β大馬酮在葉中形成的前體候選者。此外，至今未表征的步驟分別包括在烤制期間糖苷形成和細(xì)菌降解。
[0035]圖2: (A)從K326擴(kuò)增的NtABA4 cDNA序列用于工程化35S::NtABA4植物；(B)NtABA4翻譯序列；(C)用于擴(kuò)增NtABA4序列的正向(F)和反向(R)引物。F引物中的5’ cacc序列是克隆到pENTER Gateway載體所必須的。
[0036]圖3:克隆并測序與NtABA4基因拷貝對應(yīng)的來自?？怂归熑~的煙草基因組序列。(A)具有五個外顯子和4個內(nèi)含子的此基因組序列覆蓋總計1808bp(1792+16bp內(nèi)含子邊界)。(B)NtABA4 cDNA⑴和克隆的基因組N1ABA4同種型(CQ)不相同。(C)從基因組序列(Sbjct)推導(dǎo)出預(yù)測的786 bp長的NIABA4拷貝與克隆的N1ABA4 cDNA (Query)在7個氨基酸上不同，克隆的N1ABA4 cDNA包括在葉綠體轉(zhuǎn)運肽上第9位I個絲氨酸，所述絲氨酸不存在于基因組拷貝中。
[0037]圖4:⑷從K326擴(kuò)增的NtNeSy cDNA序列用于工程化35S::NtNeSy植物；(B)NtNeSy翻譯序列；(C)用于擴(kuò)增NtNeSy序列的正向(F)和反向(R)引物。F引物中的5’ cacc序列是克隆到pENTER Gateway載體所必須的。
[0038]圖5: (A)用于工程化NtNCED2干擾RNA植物的NtNCED2部分cDNA序列；⑶用于擴(kuò)增NtNCED2部分序列的正向(F)和反向(R)引物。F引物中的5’ cacc序列是克降到pENTER Gateway載體所必須的。
[0039]圖 6:在 TN90-4、35S::NtNeSy_l_2 (NeSy 1-2)、35S:: NIABA4_2_2 (ABA4_2_2)以及NtNCED2干擾RNA-1_4(CED2-1_4)選擇系的“綠色”樣本(葉池)中的葉黃素、β胡蘿卜素濃度和半定量的新黃質(zhì)。
[0040]圖7:在系 ΤΝ90_4(ΤΝ90 對照)、35S:: NtNeSy_l_2 (NeSy 卜 2)、35S:: NtABA4-2_2 (ABA4-2-2)以及 NtNCED2_ 干擾 RNA_1_4 (CED2_1_4)的氣霧形成之后(煙草塊(Plug))，在氣霧(氣霧)、烤煙(煙草)和煙草塊中的β大馬酮含量。β大馬酮的定量一式三份進(jìn)行，包括煙霧模擬器、氣霧誘捕和β大馬酮定量。T-檢驗分析表明，在系NtABA4-2_2的氣霧中β大馬酮含量在統(tǒng)計學(xué)上與ΤΝ90-4 (Ρ〈0.01)不同，在系NtABA4_2_2的煙草塊中的β大馬酮含量在統(tǒng)計學(xué)上與ΤΝ90-4(Ρ〈0.05)不同。

【具體實施方式】
[0041]定義
[0042]在本申請的范圍內(nèi)，所用的技術(shù)術(shù)語和表達(dá)通常賦予普遍適用于植物和分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域中的含義。所有下列術(shù)語定義適用于本申請中的全部內(nèi)容。詞“包括”不排除其它元素或步驟，并且不定冠詞“一”或“一個”不排除復(fù)數(shù)。單個步驟可能實現(xiàn)權(quán)利要求中記載的幾個特征的功能。一個給定計算值或范圍的上下文中，術(shù)語“約”、“基本上”和“近似地”指給定值或范圍的20%內(nèi)、10%內(nèi)、或5%、4%、3%、2%或1%內(nèi)的值或范圍。
[0043]術(shù)語“分離的”是指取自其天然環(huán)境的任何實體，但是所述術(shù)語并不意味著任何程度的純化。
[0044] “載體”是指核酸載體，其包括能夠轉(zhuǎn)運核酸、核酸構(gòu)建體和核酸綴合物等等的核酸組分的組合。合適的載體包括能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的附加體，如環(huán)形、雙鏈核酸質(zhì)粒；線性化的雙鏈核酸質(zhì)粒；以及任何來源的其它載體。
[0045]“表達(dá)載體”是指核酸載體，其包括能夠表達(dá)核酸如ABA4多核苷酸、核酸構(gòu)建體和核酸綴合物等的核酸組分的組合。合適的表達(dá)載體包括能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的附加體，如環(huán)形、雙鏈核酸質(zhì)粒；線性化的雙鏈核酸質(zhì)粒；以及任何來源的其它功能等同的表達(dá)載體。表達(dá)載體包括至少一個位于上游的并且可操作地連接至如下所限定的核酸、核酸構(gòu)建體或核酸綴合物的啟動子。
[0046]術(shù)語“構(gòu)建體”是指雙鏈、重組核酸片段，其包括一個或更多多核苷酸。構(gòu)建體包括與互補(bǔ)的“有義或編碼鏈”堿基配對的“模板鏈”。給定的構(gòu)建體可以按兩個可能的方向插入到載體中，相對于位于載體(如表達(dá)載體)中啟動子的方向相同(或有義)方向或相反(或反義)方向。
[0047]“啟動子”是指通常位于上游并且可操作地連接至雙鏈DNA片段的核酸元件/序列。啟動子可完全源自靠近目標(biāo)天然基因的區(qū)域，或可由源自不同天然啟動子或合成DNA節(jié)段的不同元件所組成。
[0048]術(shù)語“同源性、同一性或相似性”是指通過序列比對比較的兩個多肽之間或兩個核酸分子之間序列相似性的程度。待比較兩個離散核酸序列之間的同源性程度是在可比較的位置上相同的、或匹配的核苷酸數(shù)目的函數(shù)。百分比同一性可通過目測和數(shù)學(xué)計算來確定。或者，可以通過使用計算機(jī)程序如ClustalW、BLAST、FASTA或Smith-Waterman比較序列信息來確定兩個核酸序列的百分比同一性。
[0049]術(shù)語“植物”是指在其生命周期或發(fā)育的任何階段的任何植物及其后代。在一個實施方案中，植物是“煙草植物”，其是指屬于煙草屬的植物。本文描述了煙草植物的優(yōu)選物種。
[0050]“植物細(xì)胞”指植物的結(jié)構(gòu)和生理單元。植物細(xì)胞可以是沒有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的形式、分離的單細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞、或作為更高組織單元的部分，例如而不限于植物組織、植物器官或整個植物。
[0051]術(shù)語“植物材料”是指可獲自植物的任何固體、液體或氣體組合物、或其組合，其包括生物質(zhì)、葉、莖、根、花或花部分、果實、花粉、卵細(xì)胞、受精卵、種子、插條、分泌物、提取物、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其它部分或產(chǎn)品。在一個實施方案中，植物材料包括或由生物質(zhì)、種子或葉組成。在另一個實施方案中，植物材料包括或由葉組成。
[0052]術(shù)語“品種”是指共享恒定特性的植物群體，所述特性將植物群體從相同物種的其它植物中分離出來。當(dāng)具有一個或更多獨特性狀時，品種還通過所述品種內(nèi)個體間非常小的整體差異來表征。品種往往是市售的。
[0053]本文所用術(shù)語“系”或“育種系”表示植物育種期間所使用的一組植物。系不同于品種，因為系表現(xiàn)個體間一個或更多目標(biāo)性狀的小差異，盡管對于其它性狀可有一些個體間差異。
[0054]術(shù)語“調(diào)節(jié)”可指減少、抑制、增加或其它影響多肽的表達(dá)或活性。所述術(shù)語也可指減少、抑制、增加或其它影響編碼多肽的基因活性，其可包括而非限制于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。
[0055]本文所用術(shù)語“減少”或“減少的”是指從約10%至約99%的減少，或至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、至少99 %、或至少100 %、或更多的量或活性的減少，例如但不限于多肽活性、轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。
[0056]如本文所用術(shù)語“抑制”或“抑制的”是指從約98%至約100%的減少，或至少98%、至少99%、但尤其是100%的量或活性的減少，例如但不限于多肽活性、轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。
[0057]本文所用術(shù)語“增加”或“增加的”是指從約5%至約99%的增加，或至少5%、至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少100%、或更多的量或活性的增加，例如但不限于多肽活性、轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。
[0058]術(shù)語“對照”在對照植物的上下文中，指其中酶的表達(dá)或活性未經(jīng)改變(例如增加或減少的)植物或植物細(xì)胞，因此其可以提供與其中酶的表達(dá)或活性已被改變的植物作比較。對照植物可包括空載體。對照植物可與野生型植物相對應(yīng)。
[0059]發(fā)明詳述
[0060]在一個實施方案中，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由與本文所述的任何序列具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列所組成，包括在序列表中顯示的任何多核苷酸。適宜地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由下列序列所組成:與其具有至少 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的同一性的序列。
[0061]在另一個實施方案中，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQ ID NO:1具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列所組成。合適地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由與SEQ ID N0:1具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列所組成。
[0062]在另一個實施方案中，提供分離多核苷酸,其包含、由或基本上由下列多核苷酸序列所組成，所述多核苷酸序列編碼番茄紅素β環(huán)化酶且與SEQ ID Ν0:8具有至少60%的序列同一性。合適地，分離多核苷酸包含、由或基本上由與SEQ ID Ν0:8具有至少約60%、61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性的序列所組成。
[0063]在又一個實施方案中，提供分離多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶且與SEQ ID NO: 13具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列所組成。合適地，所述分離多核苷酸包含、由或基本上由與SEQ ID NO: 13具有至少約60%、61 62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的序列同一性的序列所組成。
[0064]如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，其可以是未修飾或修飾的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，多核苷酸可以是，而非限制于基因組DNA、互補(bǔ)DNA(cDNA)、mRNA、或反義RNA或其片段。此外，多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA、包含DNA和RNA的雜交分子、或具有單鏈和雙鏈區(qū)混合物的雜交分子或其片段。此外，所述多核苷酸可以由含有DNA、RNA或兩者或其片段的三鏈區(qū)所組成。多核苷酸可以含有一個或更多修飾堿基如硫代磷酸酯(phosphoth1ates),以及可以是肽核酸。通常，多核苷酸可以從cDNA、基因組DNA、寡核苷酸、或單個核苷酸(individualnucleotides)、或上述的組合的分離的或克隆的片段來組裝。雖然本文所述的多核苷酸序列以DNA序列顯示，所述序列包括其對應(yīng)的RNA序列，及其互補(bǔ)(例如，完全互補(bǔ)的)DNA或RNA序列，包括其反向互補(bǔ)。
[0065]術(shù)語“NtABA4多核苷酸”涉及編碼來自紅花煙草的新黃質(zhì)合酶的多核苷酸，以及包括其它多核苷酸，所述多核苷酸包含、由或基本上由與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:6基本上同源(即序列相似)或基本同一的多核苷酸所組成；多核苷酸變體，其與SEQ ID NO:1或SEQ ID 勵:6的序列具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%、或99%的序列同一性；NtABA4多核苷酸的片段，其包括SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:6的片段；SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的片段，其與如下序列具有基本同源性(即序列相似性)或基本同一性，所述序列與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 6的相應(yīng)片段具有至少約60%、
6162%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性。所述NtABA4多核苷酸還包括這樣的序列，所述序列含有與SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:6具有足夠或相當(dāng)程度同一性或相似性以編碼發(fā)揮新黃質(zhì)合酶功能的多肽。在一個實施方案中，術(shù)語“NtABA4多核苷酸”指包含、由或者基本上由在本文中指定為SEQ ID N0:1或SEQ IDNO:6的多核苷酸所組成的核苷酸的聚合物。
[0066]術(shù)語“NtNeSY多核苷酸”涉及編碼來自紅花煙草的番茄紅素β環(huán)化酶的多核苷酸，以及包括其它多核苷酸，所述多核苷酸包含、由或基本上由與SEQ ID Ν0:8基本上同源(即序列相似)或基本同一的多核苷酸所組成；NtNeSy多核苷酸的片段，其包括SEQ IDN0:8的片段；多核苷酸變體，其與SEQ ID N0:8的序列具有至少約60%、61%、62%、63%、64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,9192%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%的序列同一性；SEQ ID N0:8 的片段，其與如下序列具有基本同源性(即序列相似性)或基本同一性，所述序列與SEQ ID N0:8的相應(yīng)片段具有至少約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性；以及SEQ ID N0:8的片段，其與如下序列具有基本同源性(即序列相似性)或基本同一性，所述序列與SEQ ID N0:8的相應(yīng)片段具有至少約60%、61%、62%、63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的序列同一性。所述 NtNeSy多核苷酸還包括這樣的序列，所述序列含有與SEQ ID N0:8具有足夠或相當(dāng)程度的同一性或相似性以編碼發(fā)揮番茄紅素β環(huán)化酶功能的多肽。在一個實施方案中，術(shù)語“NtNeSy多核苷酸”指包含、由或者基本上由在本文中指定為與其具有100%的序列同一性的SEQ IDNO:8的多核苷酸所組成的核苷酸的聚合物。
[0067] 術(shù)語“NtNCED2多核苷酸”涉及編碼來自紅花煙草的9_順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的多核苷酸，以及包括其它多核苷酸，所述多核苷酸包含、由或基本上由與SEQID N0:13基本上同源(即序列相似)或基本同一的多核苷酸所組成；多核苷酸變體，其與SEQ ID N0:13具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性；NtNeSy多核苷酸的片段，其包括SEQ ID N0:13的片段；SEQ ID NO: 13的片段，其與如下序列具有基本同源性(即序列相似性)或基本同一性，所述序列與SEQ IDNO: 13 的相應(yīng)片段具有至少約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98^^99%或100%的序列同一性。所述NtNCED2多核苷酸還包括這樣的序列，所述序列含有與SEQ ID NO:13具有足夠或相當(dāng)程度的同一性或相似性以編碼發(fā)揮9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶功能的多肽。在一個實施方案中，術(shù)語“NtNCED2多核苷酸”指包含、由或者基本上由在本文中指定為與其具有100%的序列同一性的SEQ ID NO: 13的多核苷酸所組成的核苷酸的聚合物。
[0068]本文所述的多核苷酸將普遍含有磷酸二酯鍵，然而在某些情況下包括多核苷酸類似物，類似物可具有包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯鏈接的替換主鏈；以及肽多核苷酸主鏈和鏈接。其它多核苷酸類似物包括具有陽性主鏈、非離子型主鏈和非核糖主鏈的那些。核糖-磷酸主鏈的修飾可以出于各種原因進(jìn)行，例如為了增加這樣的分子在生理環(huán)境中或在生物芯片上作為探針的穩(wěn)定性和半衰期?？梢灾苽涮烊淮嬖诘亩嗪塑账岷皖愃莆锏幕旌衔?；或者，可以制備不同多核苷酸類似物的混合物、以及天然存在的多核苷酸和類似物的混合物。
[0069]已知各種多核苷酸類似物，包括例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯鏈接以及肽多核苷酸主鏈和鏈接。其它多核苷酸類似物包括具有陽性主鏈、非離子型主鏈和非核糖主鏈的那些。也包括含有一個或更多個碳環(huán)糖的多核苷酸。
[0070]其它類似物包括肽多核苷酸，其是肽的多核苷酸類似物。與天然存在多核苷酸的高電荷磷酸二酯主鏈不同，這些主鏈在中性條件下基本上是非離子型的。這可能會帶來優(yōu)勢。首先，肽多核苷酸主鏈可能會表現(xiàn)出改善的雜交動力學(xué)。相對于完全匹配的堿基對，肽多核苷酸對于錯配的堿基對在解鏈溫度上具有更大的變化。DNA和RNA對于內(nèi)部錯配在解鏈溫度上通常表現(xiàn)出2-4°C的下降。對于非離子型的肽多核苷酸主鏈，下降接近7-9°C。相似地，由于其非離子性質(zhì)，附著至這些主鏈的堿基的雜交對鹽濃度相對不敏感。此外，肽多核苷酸可能不會被細(xì)胞酶降解或降解程度較小，因此可能會更穩(wěn)定。
[0071]在公開的多核苷酸、及其片段的組合的用途當(dāng)中，是片段在核酸雜交分析中作為探針、或者在核酸擴(kuò)增分析中用作引物的用途。這樣的片段通常包括DNA序列的至少約10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多個連續(xù)核苷酸。在其它實施方案中，DNA片段包括DNA序列的至少約10、15、20、30、40、50或60或更多個連續(xù)核苷酸。因此，在一方面，也提供用于檢測ABA4多核苷酸的方法，包括使用探針或引物或兩者。示例引物如SEQ ID NO: 3至5所示。在另一方面，也提供用于檢測NeSy多核苷酸的方法，包括使用探針或引物或兩者。示例引物如SEQ ID N0:10至12所示。在另一方面，也提供用于檢測NCED2多核苷酸的方法,包括使用探針或引物或兩者。示例引物如SEQ ID N0:14至16所示。
[0072]影響雜交條件選擇的基本參數(shù)和制定合適條件的指南描述于Sambrook, J.，E.F.Fritsch 和 T.Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。使用遺傳密碼子的知識結(jié)合本文所述氨基酸序列，可以制備簡并寡核苷酸的集合。如在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中，這樣的寡核苷酸用作引物，由此分離并擴(kuò)增DNA片段。在某些實施方案中，可以用簡并引物作為遺傳文庫的探針。這種文庫包括但不限于cDNA文庫、基因組文庫、以及甚至電子表達(dá)序列標(biāo)簽或DNA文庫。然后將通過此方法鑒定的同源序列用作探針，來鑒定本文所鑒定序列的同源物。
[0073]潛在用途還有多核苷酸和寡核苷酸(例如引物或探針)，其在降低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下、通常中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下、以及通常高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交至本文所述的多核苷酸。影響雜交條件選擇的基本參數(shù)和制定合適條件的指南描述于Sambrook, J.，E.F.Fritsch和 T.Maniatis(1989，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于如多核苷酸的長度或堿基組成很容易地確定。
[0074]實現(xiàn)中等嚴(yán)謹(jǐn)條件的一種方法涉及使用含有5X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉、0.5%十二烷基硫酸鈉、1.0mM乙二胺四乙酸(pH8.0)的預(yù)洗溶液，約50%甲酰胺、6X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉的雜交緩沖液，以及約55°C的雜交溫度(或其它相似的雜交溶液，如含有約50%甲酰胺的一種，雜交溫度約42°C )，以及0.5X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉、0.1 %十二烷基硫酸鈉中約60°C的洗滌條件。一般來說，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為如上雜交條件，但在約68°C，0.2X標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉中洗滌。SSPE (I X SSPE是0.15M氯化鈉、1mM磷酸鈉和1.25mM乙二胺四乙酸，pH值7.4)在雜交以及洗滌緩沖液中可替換為標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉(IX標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉是0.15M氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)；雜交完成后，進(jìn)行15分鐘的洗滌。應(yīng)當(dāng)理解，洗滌溫度和洗滌鹽濃度，通過應(yīng)用控制雜交反應(yīng)和雙鏈體穩(wěn)定性的基本原則，可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整以實現(xiàn)所需的嚴(yán)謹(jǐn)程度，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的并在下面進(jìn)一步描述(見，例如 Sambrook, J., E .F.Fritsch 和 T.Maniatis(1989, Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。當(dāng)多核苷酸雜交至未知序列的靶多核苷酸時，雜交長度假定為雜交多核苷酸的長度。當(dāng)已知序列的多核苷酸雜交時，雜交長度可通過比對多核苷酸的序列以及鑒定最佳序列互補(bǔ)性的區(qū)域或多個區(qū)域來確定。雜交期望小于50堿基對長度的雜交溫度應(yīng)該是低于雜交的解鏈溫度5至10°C，其中根據(jù)下列等式確定解鏈溫度。對于小于18堿基對長的雜交，解鏈溫度(°C )=2 (A+T堿基數(shù)目)+4 (G+C堿基數(shù)目)。對于18堿基對長以上的雜交，解鏈溫度(°C )=81.5+16.6 (1glO [Na+]) +0.41 (% G+C) - (600/N)，其中 N 是雜交堿基數(shù)目，以及[Na+]是鈉離子在雜交緩沖液中的鈉離子的濃度(對于IX標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鈉，[Na+] = 0.165M)。一般來說，每個這種雜交多核苷酸具有這樣的長度，是其所雜交的多核苷酸的長度的至少25%(通常至少50%、60%、或70%，并最常用為至少80% )，并且與其所雜交的多核苷酸具有至少 60%的序列同一性(例如，至少 70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或 100% )。
[0075]本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，線性DNA具有兩個可能的方向:5’至3’方向和3’至5’方向。例如，如果參考序列處于5’至3’方向，并且如果第二序列在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)處于5’至3’方向，那么參考序列和第二序列取向相同的方向，或具有相同的取向。一般來說，在給定啟動子的調(diào)控下，啟動子的序列和目標(biāo)基因處于相同的取向。然而，相對于處于5’至3’方向的參考序列,如果第二序列在相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)處于3’至5’方向，那么參考序列和第二序列取向反義方向，或具有反義的取向。如果參考序列(5’至3’方向)和參考序列的反向互補(bǔ)序列(參考序列處于5’至3’)處于相同多核苷酸分子/鏈內(nèi)，相對于彼此具有反義取向的兩條序列可以可選擇地描述為具有相同的取向。本文所示序列以5’至3’方向顯示。
[0076]本文提供的重組構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞以調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)或活性水平。重組多核苷酸構(gòu)建體可包括編碼如本文所述的一個或更多多核苷酸的多核苷酸，其可操作地連接于適于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)多肽的調(diào)控區(qū)。因此，多核苷酸可包括編碼本文所述多肽的編碼序列。其中蛋白表達(dá)或活性水平得到調(diào)節(jié)的植物可包括突變植物、非天然存在的植物、轉(zhuǎn)基因植物、人工植物或遺傳工程化的植物。合適地，轉(zhuǎn)基因植物含有通過重組DNA的穩(wěn)定整合而得到改變的基因組。重組DNA包括已經(jīng)遺傳工程化和在細(xì)胞外構(gòu)建的DNA、以及包括含有天然存在DNA或cDNA或合成DNA的DNA。轉(zhuǎn)基因植物可包括由原始轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生的植物、以及來自轉(zhuǎn)化植物后代或雜交的子代轉(zhuǎn)基因植物。
[0077]由重組多核苷酸編碼的多肽可以是天然多肽、或可以是對細(xì)胞異源的。在一些情況中，重組構(gòu)建體含有調(diào)節(jié)表達(dá)的多核苷酸，其可操作地連接到調(diào)控區(qū)。合適的調(diào)控區(qū)的實例在本文中描述。
[0078]還提供了如本文所述的那些含有重組多核苷酸構(gòu)建體的載體。合適的載體骨架包括例如本領(lǐng)域常規(guī)使用的那些，例如質(zhì)粒、病毒、人工染色體、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體或曬菌體人工染色體。合適的表達(dá)載體包括，但不限于，源自例如曬菌體、桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的質(zhì)粒和病毒載體。許多載體和表達(dá)系統(tǒng)是商業(yè)上可獲得的。
[0079]載體還可以包括例如復(fù)制起點、支架附著區(qū)或標(biāo)志物。標(biāo)志物基因可以為植物細(xì)胞賦予可選擇的表型。例如，標(biāo)志物可以賦予殺生物劑抗性，比如對抗生素(例如卡那霉素、G418、博來霉素或潮霉素)或除草劑(例如草甘膦、氯磺隆或草銨膦)的抗性。此外，表達(dá)載體可以包括設(shè)計用來促進(jìn)操作或檢測(例如，純化或定位)所表達(dá)多肽的標(biāo)簽序列。標(biāo)簽序列，如熒光素酶、β葡糖醛酸酶、綠色熒光蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸、c-myc或血凝素序列，通常作為與所編碼的多肽的融合體來表達(dá)。這樣的標(biāo)簽可以插入多肽內(nèi)的任何地方，包括在羧基末端或氨基末端。
[0080]植物或植物細(xì)胞可以通過將重組多核苷酸整合至其基因組進(jìn)行轉(zhuǎn)化來成為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化。因此，本文所述的植物或植物細(xì)胞可以是穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常在每次細(xì)胞分裂中保留所引入的多核苷酸。也可以瞬時轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞，從而重組多核苷酸沒有整合至其基因組中。瞬時轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通常在每次細(xì)胞分裂中丟失引入的重組多核苷酸的所有或一些部分，從而引入的重組多核苷酸在足夠次數(shù)的細(xì)胞分裂之后不能在子細(xì)胞中檢測到。
[0081] 用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞一些方法在本領(lǐng)域中是可用的，這些方法全部包括在本文中，包括生物彈技術(shù)、基因槍技術(shù)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和電穿孔法。用于向植物染色體中整合外源DNA的農(nóng)桿菌系統(tǒng)已經(jīng)針對植物遺傳工程進(jìn)行了廣泛的研究、改進(jìn)和探索。包括DNA序列的裸重組DNA分子通過常規(guī)方法被連接到適當(dāng)?shù)腡-DNA序列上，其中DNA序列對應(yīng)著目標(biāo)純化的煙草蛋白，并按有義或反義方向可操作地連接至調(diào)控序列。通過聚乙二醇技術(shù)或通過電穿孔技術(shù)將這些引入煙草原生質(zhì)體，兩者都是標(biāo)準(zhǔn)的?；蛘撸瑢⑦@種含有編碼目標(biāo)純化煙草蛋白的重組DNA分子的載體引入活的農(nóng)桿菌細(xì)胞，隨后所述農(nóng)桿菌細(xì)胞將DNA轉(zhuǎn)移到煙草植物細(xì)胞中。通過煙草原生質(zhì)體與含有DNA的脂質(zhì)體進(jìn)行融合或者通過電穿孔可以實現(xiàn)不伴有T-DNA載體序列的裸DNA的轉(zhuǎn)化。不伴有T-DNA載體序列的裸DNA也可通過惰性、高速微彈(microprojectile)用于轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞。
[0082]如果細(xì)胞或培養(yǎng)的組織用作轉(zhuǎn)化受體組織，如果需要的話通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，植物可以從轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物中再生。
[0083]待納入重組構(gòu)建體的調(diào)控區(qū)選擇取決于若干因素，包括但不限于效率、可選擇性、可誘導(dǎo)性、所需的表達(dá)水平和細(xì)胞的或組織的優(yōu)先表達(dá)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，通過適當(dāng)選擇和相對于編碼序列的定位調(diào)控區(qū)來調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)是一個常規(guī)的事情。多核苷酸的轉(zhuǎn)錄可以以類似方式調(diào)節(jié)。一些合適的調(diào)控區(qū)僅僅或主要在某些細(xì)胞類型中起始轉(zhuǎn)錄。用于鑒定和表征植物基因組DNA中調(diào)控區(qū)的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0084]合適的啟動子包括組織特異性因子所識別的組織特異性啟動子，其存在于不同組織或細(xì)胞類型中(例如，根特異性啟動子、莖特異性啟動子、木質(zhì)部特異性啟動子)、或不同發(fā)育階段出現(xiàn)的、或者響應(yīng)不同環(huán)境條件而出現(xiàn)的。合適的啟動子包括組成型啟動子，其可以在大多數(shù)細(xì)胞類型中被激活而無需特定的誘導(dǎo)物。用于控制RNAi多肽生產(chǎn)的合適啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒 35S(CaMV/35S)、SSU、OCS、lib4、usp、STLSU B33、nos或泛素或菜豆素啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生重組啟動子的多種變體。
[0085]組織特異性啟動子是轉(zhuǎn)錄控制元件，其僅在植物發(fā)育期間的特定時間中在特定細(xì)胞或組織中有活性，如在營養(yǎng)組織或繁殖組織中。例如，當(dāng)優(yōu)選在某些組織中表達(dá)多核苷酸時，組織特異性表達(dá)可以是有利的。發(fā)育控制下的組織特異性啟動子實例包括可以僅在(或主要僅在)某些組織(如營養(yǎng)組織例如根或葉，或生殖組織如果實、胚珠、種子、花粉、pistols、花或任何胚組織)中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。生殖組織特異性啟動子可以是例如花藥特異性、胚珠特異性、胚特異性、胚乳特異性、珠被特異性、種子和種皮特異性、花粉特異性、花瓣特異性、萼片特異性的或其組合。
[0086]合適的葉特異性啟動子包括來自C4植物(玉米)的丙酮酸、正磷酸二激酶(ProK)啟動子、來自玉米的cab-ml Ca+2啟動子、擬南芥(Arabidopsis thaliana)myb相關(guān)基因的啟動子(Atmyb5)、核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動子(例如，在葉和光照生長的幼苗中表達(dá)的番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因、在發(fā)育中的番茄果實中表達(dá)的RBCSl和RBCS2、或者幾乎只在葉片和葉鞘的葉肉細(xì)胞中高水平表達(dá)的核酮糖二磷酸羧化酶啟動子)。
[0087]合適的衰老特異性啟動子包括在果實成熟、衰老和葉脫落期間的番茄啟動子，編碼半胱氨酸蛋白酶的基因的玉米啟動子。可以使用合適的花藥特異性啟動子。可以選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知合適的根優(yōu)選啟動子。合適的種子優(yōu)選啟動子包括種子特異性啟動子(在種子發(fā)育期間有活性的那些啟動子，比如種子貯藏蛋白的啟動子)和種子萌發(fā)啟動子(在種子萌發(fā)期間有活性的那些啟動子)。這樣的種子優(yōu)選啟動子包括但不限于Ciml (細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的信息)；cZ19Bl (玉米19kDa的玉米醇溶蛋白)；milps (肌-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2也稱為Zm-40 ;nuclc ;以及celA (纖維素合酶)。Y-玉米醇溶蛋白是胚乳特異性啟動子。Glob-1是胚特異性啟動子。對于雙子葉植物，種子特異性啟動子包括但不限于豆β菜豆素(bean beta-phaseolin)、油菜籽蛋白、β _伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對于單子葉植物,種子特異性啟動子包括但不限于玉米15kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、22kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa的玉米醇溶蛋白啟動子、g-玉米醇溶蛋白啟動子、27kDa的Y-玉米醇溶蛋白啟動子(如gzw64A啟動子，參閱GenBank登錄號S78780)、糯質(zhì)基因(waxy)啟動子、超甜基因(shrunken) I啟動子、超甜基因2啟動子、球蛋白I啟動子(見GenBank登錄號L22344)、Itp2啟動子、ciml啟動子、玉米endl和end2啟動子、nucl啟動子、Zm40啟動子、eepl和eep2 ;lecl、硫氧還蛋白H啟動子；mlipl5啟動子、PCNA2啟動子；以及超甜基因2啟動子。
[0088]可誘導(dǎo)啟動子的實例包括響應(yīng)病原體攻擊、厭氧條件、溫度升高、光、干旱、低溫或高鹽濃度的啟動子。病原體可誘導(dǎo)的啟動子包括來自病理相關(guān)蛋白(PR蛋白)的那些，病理相關(guān)蛋白是病原體感染之后誘導(dǎo)的(例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶)。
[0089]除了植物啟動子，其它合適的啟動子可源自細(xì)菌來源，例如，章魚堿合酶啟動子、胭脂堿合酶啟動子和源于Ti質(zhì)粒的其它啟動子)，或可以源自病毒啟動子(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S和19S RNA啟動子、煙草花葉病毒的組成型啟動子、花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S和35S啟動子、或玄參花葉病毒35S啟動子)。
[0090]術(shù)語“NtABA4多肽”指來自紅花煙草的編碼所謂“新黃質(zhì)合酶”的多肽并包括其它多肽變體，所述多肽變體包含、由或基本上由多核苷酸變體編碼的氨基酸序列所組成，所述多核苷酸變體與SEQ ID N0:1具有至少約66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，或多核苷酸變體與SEQ ID N0:6具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性；多肽變體，與SEQ ID N0:2具有至少約66%,67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性，或多肽變體與SEQ ID N0:7具有至少約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 的序列同一性；SEQID NO:2 或 SEQ ID NO:7 的 NtABA4 多肽的片段；以及 SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:7 的片段，其分別與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的對應(yīng)片段具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性。所述NtABA4多肽也包括與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7含有足夠或相當(dāng)程度的同一性或相似性以發(fā)揮新黃質(zhì)合酶作用的序列。所述NtABA4多肽的片段通常保留新黃質(zhì)合酶活性。只要NtABA4多肽仍作為新黃質(zhì)合酶起作用，NtABA4多肽也包括通過引入任何類型的改變(例如，氨基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態(tài)的變化；影響重新折疊或異構(gòu)化、三維結(jié)構(gòu)或自我結(jié)合狀態(tài)的變化)而產(chǎn)生的突變體，其可以有意地經(jīng)過工程化或者是天然分離的。NtABA4多肽可以處于線性形式或使用已知方法環(huán)化。術(shù)語“NtABA4多肽”也可指多肽，其是由SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:6所編碼的且與其具有100%的序列同一性，或多肽，其包含、由或基本上由如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7所示的且與其具有100%的序列同一性的序列所組成。
[0091]術(shù)語“NtNeSy多肽”指來自紅花煙草的編碼番茄紅素β環(huán)化酶的多肽并包括其它多肽變體，所述多肽變體包含、由或基本上由多核苷酸編碼的氨基酸序列所組成，所述多核苷酸與SEQ ID Ν0:9具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%、99%或100%的序列同一性；多肽變體，其與SEQ ID NO:9具有至少87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性；SEQ IDNO: 9的NtNeSy多肽的片段；以及SEQ ID NO: 9的片段，其與SEQ ID NO: 9的對應(yīng)片段具有至少約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性。所述NtNeSy 多肽也包括與SEQ ID NO:9含有足夠或相當(dāng)程度的同一性或相似性以發(fā)揮番茄紅素β環(huán)化酶作用的序列。所述NtNeSy多肽的片段通常保留番茄紅素β環(huán)化酶活性。只要NtNeSy多肽仍作為番茄紅素β環(huán)化酶起作用，NtNeSy多肽也包括通過引入任何類型的改變(例如，氨基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態(tài)的變化；影響重新折疊或異構(gòu)化、三維結(jié)構(gòu)或自我結(jié)合狀態(tài)的變化)而產(chǎn)生的變體和突變體，其可以有意地經(jīng)過工程化或者是天然分離的。NtNeSy多肽可以處于線性形式或使用已知方法環(huán)化。術(shù)語“NtNeSy多肽”也可指多肽，其包含、由或基本上由如SEQ ID NO:9所示的且與其具有100%的序列同一1丨生的序列所組成。
[0092]術(shù)語“NtNCED2多肽”指來自紅花煙草的編碼9_順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶的多肽并包括多肽，所述多肽包含、由或基本上由多核苷酸編碼的氨基酸序列所組成，所述多核苷酸與SEQ ID NO: 13具有100%的序列同一性；或多肽變體，其包含、由或基本上由多核苷酸所編碼的并且與SEQ ID勵:13具有至少約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列所組成。也包括NtNCED2多肽的片段，其通常保留9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶活性。只要NtNCED2多肽仍作為9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶起作用，NtNCED2多肽也包括通過引入任何類型的改變(例如，氨基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態(tài)的變化；影響重新折疊或異構(gòu)化、三維結(jié)構(gòu)或自我結(jié)合狀態(tài)的變化)而產(chǎn)生的變體和突變體，其可以有意地經(jīng)過工程化或者是天然分離的。NtNCED2多肽可以處于線性形式或使用已知方法環(huán)化。
[0093]在另一方面，提供分離多肽，其包含、由或基本上由與本文所述的任何序列具有至少60%的序列同一性的多肽序列所組成的，其包括在序列表中顯示的任何多肽。合適地，所述分離多肽包含、由或基本上由與其具有至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%,68%,69%,70%,75%,80%,85%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的序列所組成。
[0094]多肽包括通過引入任何類型的改變所產(chǎn)生的變體(例如，氨基酸的插入、刪除或取代；糖基化狀態(tài)的變化；影響重新折疊或異構(gòu)化、三維結(jié)構(gòu)或自我結(jié)合狀態(tài)的變化)，其可以有意地經(jīng)過工程化改造或是天然分離的。所述變體可具有產(chǎn)生沉默改變并導(dǎo)致功能等同蛋白的改變。只要保留底物的二級結(jié)合活性，基于在殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和兩親性上的相似性可進(jìn)行有意的氨基酸取代。例如，帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；以及具有相似親水性值的具有不帶電極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？蛇M(jìn)行保守取代，例如根據(jù)下表。在第二列相同方框中的氨基酸以及優(yōu)選在第三列相同行中的氨基酸可互相取代:
[0095]

【權(quán)利要求】
1.一種突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因的植物細(xì)胞，其含有: (i)包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQID N0:1或SEQ ID N0:6具有至少60%的序列同一性的序列所組成的多核苷酸； (ii)由如(i)所示的多核苷酸編碼的多肽； (iii)與SEQID NO:2具有至少66%的序列同一性、或與SEQ ID NO:7具有至少60%的序列同一性的多肽；或者 (iv)含有如(i)所不的分離多核苷酸的構(gòu)建體、載體或表達(dá)載體， 以及其中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性與對照或野生型植物相比被調(diào)節(jié)。
2.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物。
3.一種用于調(diào)節(jié)植物的類胡蘿卜素含量的 方法，所述方法包括以下步驟: (a)調(diào)節(jié)在植物中的新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性，優(yōu)選地，其中所述新黃質(zhì)合酶含有: (i)包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQID NO:1或SEQ ID NO:6具有至少60%的序列同一性的序列所組成的多核苷酸； (ii)由如(i)所示的多核苷酸編碼的多肽；或者 (iii)與SEQID NO:2具有至少66%的序列同一性、或與SEQ ID NO:7具有至少60%的序列同一'I"生的多肽； (b)測量在獲自步驟(a)的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物的至少部分中的類胡蘿卜素含量；以及 (C)鑒定其中其內(nèi)類胡蘿卜素含量與對照植物相比已經(jīng)變化的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物，在所述對照植物中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性未被調(diào)節(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中番茄紅素β環(huán)化酶或9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶或其組合的表達(dá)或活性在植物中也被調(diào)節(jié)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中番茄紅素β環(huán)化酶含有如SEQID NO: 8所示的或者與其具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列、或者含有如SEQ ID ΝΟ:9所示的或與其具有至少60%的序列同一性的多肽序列，以及其中9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶含有如SEQ ID NO: 13所示的或者與其具有至少60%的序列同一性的多核苷酸序列。
6.一種用于調(diào)節(jié)在植物中的β大馬酮含量的方法，所述方法包括以下步驟: (a)調(diào)節(jié)在植物中的新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性，優(yōu)選地，其中新黃質(zhì)合酶含有: (i)包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQID ΝΟ:1或SEQ ID NO:6具有至少60%的序列同一性的序列所組成的多核苷酸； (ii)由如(i)所示的多核苷酸編碼的多肽；或者 (iii)與SEQID NO:2具有至少66%的序列同一性、或與SEQ ID NO:7具有至少60%的序列同一'I"生的多肽； (b)測量在獲自步驟(a)的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物的至少部分或其氣霧中的β大馬酮含量；以及 (C)鑒定其中β大馬酮含量與對照植物相比已變化的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物，所述對照植物中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性未被調(diào)節(jié)。
7.—種通過根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法獲得的或可獲得的突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物、或者源自或可源自其的植物材料。
8.一種突變、非天然存在的或轉(zhuǎn)基因植物，其中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或由其編碼的蛋白的活性已經(jīng)增加；其中植物的綠葉葉黃素含量或β胡蘿卜素含量或組合的葉黃素和β胡蘿卜素含量比對照植物更高，所述對照植物中新黃質(zhì)合酶的表達(dá)或活性沒有增加；以及其中在烤制的植物材料的氣霧中的β大馬酮含量比來自對照植物的氣霧高至少10%，優(yōu)選地，其中:(i)植物的綠葉葉黃素含量是至少約18mg/100g ;(ii)其中植物的β胡蘿卜素含量是至少約12mg/100g ;以及(iii)其中加熱時氣霧中的β大馬酮含量是至少約lng/mg。
9.一種植物材料，其包含來自根據(jù)權(quán)利要求2、7或8所述的植物的生物質(zhì)、種子或葉。
10.一種煙草制品，其含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞、根據(jù)權(quán)利要求2、7或8中任一項所述的植物的至少部分、或者根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物材料。
11.一種用于生產(chǎn)β大馬酮的方法，所述方法包括以下步驟: (a)提供根據(jù)權(quán)利要求2、7或8中任一項所述的植物的至少部分、根據(jù)權(quán)利要求9所述的植物材料、或者根據(jù)權(quán)利要求10所述的煙草制品；以及 (b)對其供熱以產(chǎn)生含有β大馬酮的氣霧。
12.—種分離的多核苷酸，其包含、由或基本上由編碼新黃質(zhì)合酶并且與SEQ ID NO:1或SEQ ID ΝΟ:6具有至少60%的序列同一性的序列所組成。
13.一種分離的多肽，其由權(quán)利要求12所示的多核苷酸所編碼。
14.一種分離的多肽，其與SEQ ID NO:2具有至少66%的序列同一性、或與SEQ ID NO:7具有至少60%的序列同 一性。
15.—種構(gòu)建體、載體或表達(dá)載體,其含有根據(jù)權(quán)利要求12所述的分離的多核苷酸。
【文檔編號】C07K14/415GK104080802SQ201280064294
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月31日
【發(fā)明者】L·博韋, J·卡蒂諾特, J·施瓦爾 申請人:菲利普莫里斯產(chǎn)品有限公司