超濃縮的速效胰島素類似物制劑的制作方法
【專利摘要】一種藥物制劑包含胰島素，所述胰島素具有變體胰島素B-鏈多肽，所述B-鏈多肽含有在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸置換以及在位置B10處的含酸性側鏈的氨基酸置換，從而允許所述胰島素以0.6mM至3.0mM的濃度存在。所述制劑可以任選地不含有鋅。在位置B3、B28和B29中的一個或多個處的氨基酸置換可以額外存在。所述變體B-鏈多肽可以是胰島素原類似物或單鏈胰島素類似物的組成部分。所述胰島素類似物可以是哺乳動物胰島素（諸如人胰島素）的類似物。一種降低患者血糖的方法包括：給所述患者施用生理學上有效量的胰島素類似物或其生理上可接受的鹽。
【專利說明】超濃縮的速效胰島素類似物制劑
[0001 ] 關于聯(lián)邦政府資助的研究或開發(fā)的聲明
本發(fā)明得到在由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)于授權號DK40949和DK074176中簽訂的合作協(xié)議下的政府支持。美國政府對本發(fā)明可享有一定的權利。
【背景技術】
[0002]本發(fā)明涉及在比藥物制劑中通常采用的濃度更大的多肽濃度表現(xiàn)出增強的藥物性能(諸如更快速的藥代動力學)的多肽激素類似物。本發(fā)明也涉及這樣的胰島素類似物:其通過摻入非標準氨基酸而修飾，以使得它們的制劑在高于100單位/ml (U-100)的濃度能夠:(i)與在U-100濃度的野生型人胰島素相比，保留速效藥代動力學(PK)和藥效動力學(PD)性能，并且以至于，(ii)與野生型人胰島素相比，它們的促有絲分裂性能沒有升高。這樣的非標準序列可以任選地含有在胰島素類似物的A或B鏈中的其它位點處的標準氨基酸替換。
[0003]非標準蛋白(包括治療劑和疫苗)的工程改造可能具有廣泛的醫(yī)學和社會益處。醫(yī)學益處的一個例子是蛋白的藥代動力學性能的優(yōu)化。其它社會益處的一個例子是適合于高蛋白濃度制劑的蛋白的工程改造，其具有制劑的ρκ/ro性能的劣化。胰島素提供了治療性蛋白的一個例子。含有非標準氨基酸替換的胰島 素類似物原則上可以表現(xiàn)出就ρκ/ro而言的優(yōu)良性能或ρκ/ro對制劑中的胰島素濃度的依賴性。皮下注射以后由胰島素吸收的藥代動力學引起的挑戰(zhàn)會影響糖尿病(dm)患者的達到緊密血糖控制并限制胰島素泵的安全性和性能的能力。
[0004]以下患者表現(xiàn)出的顯著胰島素抗性提出了一個特定醫(yī)學需求:某些具有與肥胖有關的DM的患者，某些具有與胰島素抗性遺傳素質(zhì)有關的DM的患者，和具有在脂質(zhì)營養(yǎng)不良、皮質(zhì)類固醇治療或內(nèi)源性皮質(zhì)類固醇過度分泌(庫欣綜合征)之后的DM的患者。具有顯著胰島素抗性的患者的數(shù)目正在增加中，這是由于在發(fā)達國家和發(fā)展中國家內(nèi)的肥胖大范圍流行(導致“糖尿病肥胖(diabesity)”的綜合征)和由于越來越多的對從線粒體DNA中的突變引起的單基因形式的DM (其中胰島素抗性可以是非常嚴重的)的認識(van den Ouwe I and, J.Μ., Lemke s, Η.H., Ruitenbeek, ff., Sandkuijl, L.A., de Vijlder,Μ.F., Struyvenberg, P.A., van de Kamp, J.J., & Maassen, J.Α.(1992) Mutation inmitochondrial tRNA(Leu) (UUR) gene in a large pedigree with maternally transmittedtype II diabetes mellitus and deafness.Nature Genet.1, 368-71)。這樣的在其它方面不同的患者子集的治療，通常需要皮下注射大體積的常規(guī)胰島素制劑(U-100強度；通常
0.6 mM胰島素或胰島素類似物)。如此大體積的注射可以導致疼痛以及胰島素作用的起效速率和持續(xù)時間的變異性。盡管野生型胰島素的U-500制劑可用于臨床應用(優(yōu)泌林(Humulin)eR U-500; Eli Lilly and C0.),胰島素濃度從0.6 mM至3 mM的增加會導致胰島素作用的起效延遲和延長，使得優(yōu)泌林?R U-500或類似的這類產(chǎn)品的PK/H)性能類似于含有魚精蛋白-鋅的胰島素六聚體的微結晶性混懸液的那些PK/ro性能；該制劑長期以來被稱作中性魚精蛋白//agadorn (NPH)。因而預見到,通過皮下注射施用的野生型胰島素的U-500制劑的膳食應用會降低血糖控制的效力和增加低血糖發(fā)作的風險。同樣預見到，優(yōu)泌林爾U-500或類似的這類產(chǎn)品在用于連續(xù)皮下胰島素輸注的裝置(CSII ;“胰島素泵”)中的應用，會干擾患者或控制算法的基于血糖濃度的當前或過去測量而做出對胰島素輸注速率的有效判斷的能力，從而導致次優(yōu)的血糖控制和增加的低血糖事件的風險。
[0005]一個非常確定的胰島素藥理學原理將注射的胰島素分子的聚集狀態(tài)與從貯庫向毛細血管中并因此向體循環(huán)中的吸收的時程相關聯(lián)。一般而言，胰島素分子聚集成高分子量復合物的程度越高，吸收的延遲越大，且胰島素作用越延長。本領域已知，胰島素分子中減弱它自己的自裝配的氨基酸替換與相對于野生型人胰島素的更快速吸收有關；通過替換ProB28 —Asp (門冬胰島素，諾和銳(Novolog)?的活性成分；Novo-Nordisk, Ltd)和配對的替換ProB28 — Lys和LysB29 — Pro (賴脯胰島素,優(yōu)泌樂(Humalog)?的活性成分；Eli Lillyand C0.)提供了例子。相反，本領域已知，胰島素分子的造成它的等電點(pi)從約pH 5遷移至約pH 7的氨基酸延伸或化學修飾會導致皮下貯庫中經(jīng)修飾的胰島素的等電沉淀；這樣的高分子量復合物會提供延長的吸收作為基礎胰島素制劑。NovoSol Basal? (Novo-Nordisk的停用產(chǎn)品，其中ThrB27被Arg替換，且其中ThrB3°的C-端羧酸酯部分被酰胺化)和甘精胰島素(Lantus?的活性成分，所述Lantus?是其中用二肽ArgB31_ArgB32延伸B鏈的基礎制劑；Sanof1-Aventis, Ltd.)提供了例子(NovoSol Basal?和Lantus?各自含有額外替換Asnm — Gly,以使得它們成為在酸性條件(分別pH 3和pH 4)下可溶解的制劑，而沒有由AsnA21的脫酰胺化引起的化學降解)。經(jīng)典的微結晶性胰島素混懸液(NPH、半緩慢的、緩慢的和超緩慢的)的延長會表現(xiàn)出一定范圍的中間至長效PK/ro性能，從而反映這些微晶體的各種物理化學性能和它們的相對溶出速率。
[0006]以上的胰島素產(chǎn)品(包括野生型人胰島素或動物胰島素的當前和過去制劑)采用胰島素分子的自 裝配作為實現(xiàn)化學穩(wěn)定性的方式、作為避免纖絲形成的方式、作為調(diào)節(jié)PK/ro性能的方式、或作為實現(xiàn)這些目的的組合的方式。并且，胰島素自裝配還可以引入不利的或不希望的性能。例如，優(yōu)泌林爾化500 (或類似的這類產(chǎn)品)的非最佳的延長的PK/PD性能可能是在制劑中和在皮下貯庫中的六聚體-六聚體結合的結果。實際上，通過激光散射進行的體外野生型牛胰島素鋅六聚體的研究已經(jīng)提供了在0.3-3 mM濃度范圍內(nèi)的漸進性六聚體-六聚體相互作用的證據(jù)。因此胰島素制劑的組成和胰島素類似物的設計的當前和過去策略面臨開發(fā)速效超濃縮胰島素制劑的不可調(diào)和的屏障:然而必需自裝配才能得到化學和物理穩(wěn)定性，它在0.6 mM以上的漸進性質(zhì)會導致PK/PD的不利延長。
[0007]在過去的十年中，已經(jīng)描述了對胰島素分子的特異性化學修飾，所述修飾選擇性地修飾蛋白的一種或另一種特定性能，以促進目標應用。然而，在重組DNA時代開始時(1980)，認為野生型人胰島素對于在不同治療背景下的應用而言是最佳的，胰島素類似物在過去的十年中的廣泛臨床應用提示，一系列非標準類似物(每種為了解決特定未滿足的需求而定制)會提供顯著的醫(yī)學和社會益處。用另一種天然氨基酸替換在蛋白的特定位置處的一種天然氨基酸是本領域眾所周知的，且在本文中被稱作標準替換。胰島素中的非標準替換會提供加速吸收的前景，而沒有PK/ro作為在0.6-3.0mM范圍內(nèi)的胰島素類似物濃度的函數(shù)的劣化。
[0008]胰島素的施用長期以來被確立為糖尿病的治療法。胰島素是在脊椎動物的代謝中起重要作用的小球狀蛋白。胰島素含有2條鏈:A鏈含有21個殘基，B鏈含有30個殘基。該激素作為Zn2+穩(wěn)定的六聚體貯存于胰腺β -細胞內(nèi)，但在血流中作為不含Zn2+的單體起作用。胰島素是單鏈前體胰島素原的產(chǎn)物，在所述胰島素原中，一個連接區(qū)(35個殘基)將B鏈的C端殘基(殘基Β30)與A鏈的N端殘基相連。已經(jīng)通過電子顯微術(EM)觀察到鋅胰島素六聚體在成熟貯存顆粒內(nèi)的結晶陣列。在圖1中以示意圖形式顯示了胰島素的序列。通過氨基酸的身份(通常使用標準的三字母代碼)、鏈和序列位置(通常作為上標)來指示單個殘基。
[0009]象在一般的球狀蛋白中一樣，胰島素中的芳族側鏈可以參與多種疏水的和弱極性的相互作用，不僅涉及鄰近的芳族環(huán)，而且涉及正或負靜電勢的其它來源。例子包括肽鍵中的主鏈羰基和酰胺基。認為芳族側鏈的疏水包裝發(fā)生在蛋白的核心內(nèi)和蛋白之間的非極性界面處。這樣的芳族側鏈可以在脊椎動物蛋白之間是保守的，從而反映它們對結構或功能的關鍵貢獻。天然的芳族氨基酸的一個例子是苯丙氨酸。它的芳族環(huán)系含有6個排列為平面六邊形的碳。芳香性是這6個碳之間的結合排列的共同性能，從而導致在該環(huán)的平面以上和以下的η電子軌道。這些面表現(xiàn)出部分負靜電勢，而所述環(huán)的邊緣(含有5個C-H部分)表現(xiàn)出部分正靜電勢。部分電荷的這種不對稱分布會引起四極靜電矩，且可能參加與蛋白中的其它有效電荷或部分電荷的弱極性相互作用。芳族側鏈的一個額外特有特征是它的體積。該體積的決定因子包括它的在平面環(huán)的邊緣處的5個C-H部分的地貌輪廓。預見到，C-F部分對一個C-H部分的替換會保留它的芳香性，但是在環(huán)中引入顯著的偶極矩，這是由于氟原子的電負性和隨后在環(huán)平面以上和以下的η電子軌道的扭曲。鑒于C-F部分的尺寸類似于天然C-H部分的尺寸(且所以原則上可以適應不同的蛋白環(huán)境)，它的局部電負性和環(huán)特異性的氟誘導的靜電偶極矩可以引入與蛋白中的鄰近基團的有利或不利的靜電相互作用。這樣的鄰近基團的例子包括、但不限于=CO-NH肽鍵單位，二硫鍵中的硫原子的孤對電子，側鏈羧酰胺官能團(functions) (Asn和Gln),其它芳族環(huán)(Phe、Tyr、Trp和His),和酸性側鏈(Asp和Glu)、堿性側鏈(Lys和Arg)的有效正和負電荷，具有在胰島素形成中使用的范圍內(nèi)的潛在PKa的可滴定側鏈(His)，可滴定的N-和C-端鏈末端，結合的金屬離子(諸如Zn2+或Ca2+)和蛋白結合的水分子。
[0010]在胰島素的B鏈的位置B24處的苯丙氨酸(命名為PheB24)提供了治療性蛋白中的保守芳族殘基的一個例子。這是胰島素中的3個苯丙氨酸殘基(位置B1、B24和B25)之一。結構上類似的酪氨酸是在位置B26處。在條帶模型中(圖2A)和在空間填充模型中(圖2B)顯示了胰島素單體中的PheB24的結構環(huán)境。在脊椎動物胰島素和胰島素樣生長因子中是保守的PheB24的芳族環(huán)緊靠著疏水核心(但不在其內(nèi))裝配以穩(wěn)定B鏈的超二級結構。PheB24位于經(jīng)典的受體結合表面，并且已經(jīng)被認為在受體結合中指導構象的改變。PheB24在胰島素的二聚體界面處包裝，且所以在胰島素六聚體的3個界面處包裝。它在胰島素單體中的結構環(huán)境不同于它在這些界面處的結構環(huán)境。具體地，在單體中PheB24的側鏈可利用的周圍體積大于在二聚體或六聚體中。
[0011] 在DM患者中的胰島素補償療法的一個主要目的是，緊密控制血糖濃度以預防它偏離健康人對象的特有正常范圍以上或以下。在正常范圍以下的偏離與立即的腎上腺素能或神經(jīng)低糖征狀有關，所述征狀在嚴重發(fā)作中會導致驚厥、昏迷和死亡。在正常范圍以上的偏離與增加的長期微血管疾病(包括視網(wǎng)膜病變(retinapathy)、失明和腎衰竭)的風險有關。因為野生型人胰島素或人胰島素類似物(當以大于U-1OO的強度配制時)的吸收的藥代動力學相對于餐后代謝體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的生理學需求而言經(jīng)常過慢、過于延長和過于易變，具有與顯著胰島素抗性有關的DM的患者經(jīng)常不能達到最佳血糖靶標，并因而處于增加的立即和長期并發(fā)癥的風險中。因而，常規(guī)和速效胰島素產(chǎn)品的安全性、效力和真實世界方便性已經(jīng)受限于PK/ro的延長，因為制備的自裝配的胰島素或胰島素類似物的濃度高于約0.6 mM。
[0012]本發(fā)明規(guī)避了對胰島素自裝配(作為實現(xiàn)具有足夠化學穩(wěn)定性和足夠物理穩(wěn)定性以滿足或超過管理標準的制劑的機制)的需要?；瘜W降解表示胰島素分子中的原子排列的變化，諸如Asn的脫酰胺化、異-Asp的形成、和二硫鍵的斷裂。胰島素對化學降解的易感性與它的熱力學穩(wěn)定性有關(如通過化學變性實驗所探測到的)；因為它是作為對化學降解最易感的物質(zhì)的單體，通過在自裝配內(nèi)隔離單體，會降低化學降解的速率。物理降解表示纖絲形成(原纖維形成)，所述纖絲形成是導致在富含β_折疊的構象中含有數(shù)千個(或更多個)胰島素原聚體的直鏈結構的自裝配的非天然形式。原纖維形成是在室溫以上制備、貯存和使用胰島素和胰島素類似物的一個嚴重憂慮。原纖維形成的速率隨著較高的溫度、較低的pH、攪拌或者脲、胍、乙醇共溶劑或疏水表面的存在而增加?，F(xiàn)行的美國藥物規(guī)章要求，如果原纖維形成發(fā)生的水平為1%或以上，則棄用胰島素。因為較高溫度促進原纖維形成，因此DM患者最好在使用前將胰島素冷藏保存。使用外部胰島素泵(其中定期將少量胰島素或胰島素類似物注射到患者體內(nèi))的這類患者可能特別擔心胰島素或胰島素類似物的原纖維形成。在這種用法當中，胰島素或胰島素類似物不是在泵設備內(nèi)冷藏保存，并且胰島素的原纖維形成可以導致用于將胰島素或胰島素類似物注射入機體中所用的導管的堵塞，這可能導致不能預見的血糖水平波動，甚至危險的高血糖癥。至少一份最新報道已經(jīng)指出，賴脯胰島素(KP-胰島素，其中殘基B28和B29相對于它們在野生型人胰島素中的位置發(fā)生互換的一種類 似物；商業(yè)名稱優(yōu)泌樂?)可能特別易于發(fā)生原纖維形成并導致胰島素泵導管的堵塞。在25°C以上的溫度，每增加10°C，胰島素展示的降解速率提高10倍或更大；因此，指南要求貯存于〈30°C的溫度，優(yōu)選冷藏貯存。這樣的制劑通常主要包括天然胰島素自裝配。
[0013]本發(fā)明的蛋白原纖維形成理論斷定，原纖維形成的機制經(jīng)由部分地折疊的中間狀態(tài)進行，所述中間狀態(tài)又聚集以形成淀粉樣蛋白形成核。在該理論中，穩(wěn)定天然狀態(tài)的氨基酸替換可能穩(wěn)定或不穩(wěn)定所述部分地折疊的中間狀態(tài)，且可增加或不增加(或減少)天然狀態(tài)和中間狀態(tài)之間的自由能屏障。因此，當前的理論指示，胰島素分子中給定氨基酸替換的增加或減少原纖維形成風險的趨勢是非常不能預見的；具體地，在可檢測的原纖維形成發(fā)作之前觀察到的延遲時間與天然狀態(tài)單體的熱力學穩(wěn)定性測量(如通過化學變性實驗所探測到的)無關。鑒于給定的替換可能穩(wěn)定總天然狀態(tài)和淀粉樣蛋白形成部分折疊并從而延遲原纖維形成的發(fā)作，另一種替換可能穩(wěn)定天然狀態(tài)，但是不會穩(wěn)定淀粉樣蛋白形成部分折疊，且所以對延遲時間幾乎沒有或根本沒有影響。其它替換可能使天然狀態(tài)失穩(wěn)，但是穩(wěn)定淀粉樣蛋白形成部分折疊，并從而導致加速的原纖維形成(盡管它具有表觀穩(wěn)定性能)。
[0014]因此，需要這樣的胰島素類似物:其在0.6 mM至3.0 mM的寬胰島素濃度范圍(通常對應于在u-100至u-500范圍內(nèi)的制劑強度)下表現(xiàn)出就DM治療而言快速的PK/PD，同時表現(xiàn)出對應的野生型胰島素的活性的至少一部分，并維持它的化學和/或物理穩(wěn)定性的至少一部分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]本發(fā)明的一個方面是提供胰島素類似物，其提供具有足夠化學穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性的無鋅單體和二聚體物質(zhì)，以使得它們的制劑處于在皮下注射以后實現(xiàn)快速吸收的蛋白濃度范圍和形式。本發(fā)明解決了關于超濃縮的胰島素制劑和胰島素類似物制劑的先前限制，即，它們?nèi)匀徊粫銐蚩焖俚仄鹱饔靡詢?yōu)化餐后血糖控制或?qū)崿F(xiàn)在胰島素泵中的應用。要求保護的發(fā)明通過在位置B24處摻入非標準氨基酸替換而規(guī)避了以前的設計限制，包括關于PheB24的替換的那些限制。在位置B24處的非標準氨基酸側鏈(2F-PheB24;也命名為鄰-單氟-PheB24)會顯著地穩(wěn)定分離的胰島素單體。這通過鹵素修飾的芳族類似物(其在尺寸和形狀上類似于苯丙氨酸)對芳族氨基酸側鏈的替換來實現(xiàn)，其中所述類似物然后維持含有天然芳族側鏈的對應胰島素或胰島素類似物的生物活性的至少一部分。此外，所述經(jīng)修飾的側鏈會減少胰島素與I型IGF受體(IGF-1R)的交叉結合，并調(diào)節(jié)與胰島素受體的結合，從而規(guī)避通過穩(wěn)定替換HisB1° — Asp而賦予的異常促有絲分裂性能。本發(fā)明的另一個方面是，將2-F-PheB24修飾與在位置BlO處的酸性側鏈(Asp或Glu)相組合，使得得到的類似物具有與野生型人胰島素類似的對IGF-1R的親和力。本發(fā)明的另一個方面是，可以以pH 7-8以U-100至U-500 (大約0.6 - 3.0 mM)的強度配制這樣的胰島素類似物，任選地以無鋅制劑形式，并保留與U-100強度的野生型人胰島素的常規(guī)制劑類似的或更快速的且更少延長的PK/ro性能。在一個特定實施方案中，所述制劑中的胰島素濃度是至少2 mM。本發(fā)明的另一個方面是，含有2F-PheB24和在位置BlO處的酸性側鏈的胰島素類似物可以含有在A鏈或B鏈中的額外替換，所述額外替換進一步增強化學或物理穩(wěn)定性或進一步損害自裝配。
[0016]一般而言，本發(fā)明提供了一種包含胰島素的藥物制劑，所述胰島素具有變體胰島素B-鏈多肽，所述B-鏈 多肽含有相對于人胰島素序列在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸替換、以及選自天冬氨酸和谷氨酸的相對于人胰島素序列在位置BlO處的含有酸性側鏈的氨基酸的替換，其中所述胰島素以0.6 mM至3.0 mM的濃度存在。在某些特定實施方案中，所述藥物制劑含有至少2 mM濃度的胰島素。在一個特定實施方案中，所述藥物制劑含有
2.4 mM或更高濃度的胰島素。
[0017]額外地或可替代地，所述胰島素類似物可以是哺乳動物胰島素類似物，諸如人胰島素的類似物。在一組實施方案中，所述B-鏈多肽包含選自SEQ.1D.N0.4-7的氨基酸序列和具有其3個或更少額外氨基酸替換的多肽。在另一個實施方案中，所述A鏈含有選自SEQ.1D.N0.4-7的在位置A8處的替換(除了 B-鏈修飾以外，SEQ.1D, N0.8)。
[0018]在另一個實施方案中，所述胰島素類似物可以任選地含有在B鏈的位置29處的非標準氨基酸替換。在一個實施例中，所述在B29處的非標準氨基酸是正亮氨酸(Nle)。在另一個實施例中，所述在B29處的非標準氨基酸是鳥氨酸(Orn)。在其它實施例中，所述非標準氨基酸可以是氨基丁酸、氨基丙酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。
[0019]還提供了編碼胰島素類似物的核酸，所述胰島素類似物包含在位置B24處摻入了非標準氨基酸的B-鏈多肽。在一個實施例中，所述非標準氨基酸由終止密碼子(諸如核酸序列TAG)編碼。表達載體可以包含這樣的核酸，且宿主細胞可以含有這樣的表達載體。[0020]本發(fā)明還提供了降低患者的血糖水平的方法。所述方法包括:給所述患者施用生理學上有效量的胰島素類似物或其生理上可接受的鹽，其中所述胰島素類似物或其生理上可接受的鹽含有這樣的B-鏈多肽:其摻入在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸(2F-Phe)和在位置BlO處的Asp或Glu替換。在另一個實施方案中，所述胰島素類似物是哺乳動物胰島素類似物，諸如人胰島素的類似物。在某些實施方案中，所述B-鏈多肽包含選自SEQ.1D.N0.4-7的氨基酸序列和具有其3個或更少額外氨基酸替換的多肽。在其它實施方案中，所述A-鏈多肽包含與包含選自SEQ.1D.N0.4-7的氨基酸序列的B-鏈多肽相組合的、選自SEQ.1D.N0.8的氨基酸序列。
[0021]本發(fā)明的另一個方面是提供一種多肽，其包含變體胰島素B-鏈多肽序列，所述多肽序列含有相對于人胰島素序列在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸替換、以及相對于人胰島素序列在位置BlO處的含有酸性側鏈的氨基酸的替換、和選自以下的相對于人胰島素序列在位置B29處的非標準氨基酸的替換:鳥氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸和氨基丙酸。在某些實施方案中，所述多肽可以是胰島素原類似物或單鏈胰島素類似物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是人胰島素序列的示意圖，其指示了 B鏈中的殘基B24的位置。
[0023]圖2A是胰島素單體的條帶模型，其顯示了相對于3個二硫鍵的PheB24的芳族殘基。顯示了 LeuB15 (箭頭)和PheB24的鄰接側鏈。A-和B鏈分別以淺灰色和深灰色顯示，并且半胱氨酸的硫原子顯示為圓形。
[0024]圖2B是胰島素的空間填充模型，其顯示了在位于疏水核心的邊緣處的口袋內(nèi)的PheB24 側鏈。
[0025]圖3A是苯丙氨酸(Phe)的一系列球和桿(頂部)和空間填充(底部)表示。
[0026]圖3B是2F_Phe的一系列球和桿(頂部)和空間填充(底部)表示。
[0027]圖4的圖顯示了胰島素類似物的受體結合研究的結果。通過競爭性結合測定確定胰島素受體的B同種型(IR-B)的相對活性，其中用遞增濃度的人胰島素(.)或它的類似物DKP-胰島素(▲)和2F-PheB24-DKP-胰島素(▼)替換受體-結合的1251-標記的人胰島素；曲線擬合的結果總結在表2和3中。
[0028]圖5的直方圖顯示了配體刺激的IGF-1受體自磷酸化的程度。將穩(wěn)定地表達人IGF-1受體的IGF-1受體缺陷型小鼠胚胎成纖維細胞血清饑餓過夜，然后用10 nM配體處理5 min,并制備細胞裂解物和通過ELISA來分析磷酸化的IGF-1受體(IGF-1R)。由2F-DKP實現(xiàn)的自磷酸化與HI類似。
[0029]圖6顯示了關于絲裂原活性的乳腺癌相關的MCF-7集落形成測定的結果。在有10nM配體存在下培養(yǎng)1-周以后，在軟瓊脂中針對集落形成(反映致瘤潛力)來分析MCF-7人乳腺癌細胞。2F-PheB24-DKP的致瘤潛力與野生型人胰島素和未處理的細胞相當。
[0030]圖7提供了⑶-檢測的胍變性的圖。人胰島素(HI，.)、賴脯胰島素(KP，□)、Aspbic1-KP-胰島素(DKP，?)和2F_PheB24-DKP-胰島素(▲)胰島素類似物的化學變性。在磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4)中在25°C收集波譜。通過在222 nm的⑶來監(jiān)測解折疊。分別相對于DKP-胰島素和人胰島素，2F-PheB24-DKP類似物的穩(wěn)定性表現(xiàn)出0.6(±0.2)和1.6(±0.2) kcal/mol的穩(wěn)定性增益(Δ Δ Gu)(參見表4)。
[0031]圖8的直方圖對比了胰島素類似物的原纖維形成延遲時間。硫代黃素T熒光監(jiān)測原纖維形成延遲時間。在無Zn的磷酸鹽緩沖鹽水中在37°C和pH 7.4輕輕攪拌樣品。2F-DKP-胰島素對原纖維形成的抗性分別是賴脯胰島素和野生型人胰島素的3.7和2.4倍(如通過延遲時間所探測的)。
[0032]圖9提供了與當前胰島素產(chǎn)品優(yōu)泌樂(U-100強度；頂條)和優(yōu)泌林R U-500 (底條)相比，U-400強度的2F-PheB24-DKP-胰島素(在pH 7.4的含有5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)的無鋅Lilly稀釋劑中；中間條)在麻醉豬中的藥效動力學的圖形總結。
[0033]圖10提供了在鋅KP-胰島素六聚體的背景下，2F_PheB24的晶體結構的結構描繪。(A)作為T3Rf3鋅六聚體的野生型人胰島素的條帶模型。⑶呈相同晶型的2F-PheB24-KP-胰島素的對應條帶模型。變體T3Rf3結構與親本六聚體的結構類似，從而證實了大范圍結構攝動的缺乏和氟原子在天然樣二聚體界面處的適應。 [0034]圖11解釋了在2.5A的分辨率確定的、在2F_PheB24的晶體結構中在2F_PheB24周圍的電子密度。(A)在T-狀態(tài)原聚體中的2F-PheB24和鄰近電子密度。⑶在Rf-狀態(tài)原聚體中的2F-PheB24和鄰近電子密度。B24環(huán)的取向和氟部分的相互作用在2種構象狀態(tài)之間是不同的。
【具體實施方式】
[0035]本發(fā)明涉及使快速PK和ro能夠被維持在U-100至U-500的寬胰島素濃度范圍內(nèi)的胰島素類似物。所述類似物則維持對應的未修飾的胰島素或胰島素類似物的生物活性的至少一部分，并維持類似的或增強的熱力學穩(wěn)定性和對纖絲形成的抗性。我們已經(jīng)發(fā)明了這樣的胰島素類似物:其具有與u-100強度的野生型人胰島素的常規(guī)制劑、例如，優(yōu)泌林ReU-1OO; Eli Lilly and C0.)類似的或更快速的PK/H)性能，使得這些PK/H)性能不受在
0.6mM-3.0mM范圍內(nèi)的胰島素類似物濃度顯著影響。
[0036]本發(fā)明涉及在位置B24處的非標準氟修飾，以改善超濃縮的胰島素制劑就皮下注射以后的快速吸收而言的性能。在一個實例中，所述胰島素類似物是經(jīng)工程改造的含有在位置BlO處的酸性替換(Glu或Asp)的二聚體，引入所述酸性替換以阻止天然殘基HisB1°與鋅離子的結合和使胰島素的三聚體界面(如在鋅胰島素六聚體的分子結構中所限定的)失穩(wěn)。在另一個實例中，所述類似物是經(jīng)工程改造的單體，其除了含有上述的在位置BlO處的酸性替換以外，還含有在位置B28和/或B29處的額外替換，引入所述額外替換以使胰島素的經(jīng)典二聚體界面(如在鋅胰島素六聚體和無鋅二聚體的分子結構中所限定的)失穩(wěn)。在另一個實例中，上述的二聚體和單體類似物可以含有在位置AS處的額外替換。
[0037]在2個特定實施方案(2F-PheB24-DKP-胰島素(其中DKP代表AspB1°、Lyse28和ProB29)和2F-PheB24-[AspB1°，0rnB29]_胰島素；其中Orn表示鳥處麼)中的任一個中，本發(fā)明提供了這樣的胰島素類似物:其表現(xiàn)出類似于或低于野生型人胰島素的對I型IGF受體的親和力，類似于或低于野生型人胰島素的刺激I型IGF受體的自磷酸化的活性，和類似于或低于野生型人胰島素的刺激人乳腺癌衍生細胞系的增殖的活性。但是，本發(fā)明不限于人胰島素的2F-PheB24_衍生物和它的類似物。還預見到,這些替換也可以在從動物胰島素(作為非限制性例子，諸如豬、牛、馬和犬胰島素)衍生出的二聚體和單體類似物中產(chǎn)生。[0038]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當在Lilly稀釋劑中配制并在雄性Lewis大鼠(用鏈脲霉素產(chǎn)生糖尿病)中皮下注射以后，2F-PheB24-DKP-胰島素和2F-PheB24-[AspB1°，0rnB29]_胰島素會指導血糖濃度的下降，其效能類似于相同制劑中的野生型人胰島素的效能。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當在Lilly稀釋劑中配制并在麻醉的約克夏豬(通過靜脈內(nèi)施用奧曲肽抑制其胰島素的內(nèi)源性b-細胞分泌沖皮下注射以后，2F-PheB24-DKP-胰島素和2F-PheB24_[AspB1°，0rnB29]_胰島素會指導血糖濃度的下降，其效能類似于相同制劑中的野生型人胰島素的效能。
[0039]額外地或替代性地，本發(fā)明的胰島素類似物可以含有在B鏈的位置29處的標準或非標準氨基酸替換，所述位置29在野生型胰島素中是賴氨酸(Lys)。在一個實例中，所述在B29處的非標準氨基酸是正亮氨酸(Nle)。在另一個實例中，所述在B29處的非標準氨基酸是鳥氨酸(Orn)。
[0040]此外，考慮到人與動物胰島素之間的相似性以及以往動物胰島素在人糖尿病患者中的應用，還預見到，可以將其它微小修飾引入胰島素的序列中，尤其是被認為“保守”的那些替換。例如，可以在具有類似側鏈的氨基酸組內(nèi)進行氨基酸的其它替換，而不脫離本發(fā)明。這些包括中性疏水氨基酸:丙氨酸(Ala或A)、纈氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、異亮氨酸(He或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同樣，中性極性氨基酸可在其組內(nèi)彼此替換:甘氨酸(Gly或G)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。認為堿性氨基酸包括賴氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和組氨酸(His或H)。酸性氨基酸為天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另外指出或從上下文中顯而易見，否則本文所述氨基酸應當視為L-氨基酸。標準氨基酸也可以被屬于相同化學類別的非標準氨基酸替換。作為非限制性例子，堿性側鏈Lys可以被具有較短側鏈長度的堿性氨基酸(鳥氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)替代。Lys也可以被中性脂族電子等排體正亮氨酸(Nle)替 代，后者又可以被含有較短脂族側鏈的類似物(氨基丁酸或氨基丙酸)替換。
[0041]在一個實例中，除了本發(fā)明的2F_PheB24和BlO替換以外，本發(fā)明的胰島素類似物含有4個或更少的保守替換。在一對特定實施例中，含有變體B-鏈多肽序列的制劑也含有相對于人胰島素在位置B3處的Asn或Lys替換。額外地或替代性地，所述制劑可以額外包括含有在位置AS處的谷氨酸替換或組氨酸替換的胰島素A-鏈多肽序列。
[0042]如在本說明書和權利要求中所使用的，胰島素或胰島素類似物中的不同氨基酸可以用目標氨基酸殘基和隨后的所述氨基酸的位置(任選用上標)表示。目標氨基酸的位置包括替換所在的胰島素的A鏈或B鏈。因此，PheB24表示在胰島素B鏈的第24個氨基酸處的苯丙氨酸。芳族環(huán)的氟衍生物保留平面性，但是在η電子分布方面存在差異，從而導致靜電勢的變化，如苯丙氨酸(圖3A)相對于2F-苯丙氨酸(圖3B)的前視圖和側視圖所示。本文中使用的特定替換的列舉位置應當理解為相對于野生型人胰島素的位置，不論在討論的任何特定實施方案中使用的特定物質(zhì)。以此方式，替換的位置將是可鑒別的，不論在特定多肽中的任何插入、延伸或缺失。
[0043]本發(fā)明預見到，在PheB24處的2F修飾會引入負電性的原子和靜電偶極矩，其導致:
(i)胰島素單體的熱力學穩(wěn)定和(ii)受體結合表面的功能特性的改變。鑒于本領域已知的替換會增強胰島素穩(wěn)定性(與受體結合的增強有關)，2F_PheB24會在降低受體結合的同時穩(wěn)定胰島素。具體地，該改變用于抵消在位置BlO處的酸性替換(Asp或Glu)的影響，以增強與I型IGF受體的結合和通過I型IGF受體的信號傳遞；該改變用于抵消這樣的BlO替換的影響，以增強與胰島素受體的結合，據(jù)推測是通過縮短類似物在受體上的停留時間；并且借助于這些和其它可能的機制，2F-PheB24能夠在BlO處摻入酸性殘基，而不引起相對于野生型人胰島素的過度絲裂原活性。
[0044]在B24處的苯丙氨酸是在功能性胰島素中的不變氨基酸并含有芳族側鏈。造成人糖尿病的臨床突變(SerB24)指示PheB24在胰島素中的生物學重要性。盡管不希望受理論約束，但是認為PheB24在經(jīng)典受體結合表面的疏水核心邊緣處裝配。該模型是基于結晶原聚體(2-Zn分子I ;蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫標記符4INS)。PheB24位于B鏈的C端β鏈(殘基Β24-Β28)內(nèi)，鄰接中心α-螺旋(殘基Β9-Β19)(圖2Α)。在胰島素單體中，芳族環(huán)的一個面和邊位于由LeuB15和CysB19限定的淺口袋內(nèi)；另一個面和邊則暴露于溶劑(圖2B)。該口袋被主鏈羰基和酰胺基部分地包圍，并由此產(chǎn)生復雜的且不對稱的靜電環(huán)境，其具有不規(guī)則的且松散的立體邊界。在胰島素二聚體中，且在胰島素六聚體的3個二聚體界面中的每一個內(nèi)，PheB24的側鏈包裝在更緊密包含的空間環(huán)境內(nèi)，作為每個二聚體界面的8個芳族環(huán)簇的一部分(TyrB16、PheB24、PheB25、TyrB26和它們的二聚體相關的配對物)。不論理論如何，2F衍生物對PheB24的芳族環(huán)的替換會保留二聚體界面內(nèi)的一般疏水包裝，同時在胰島素單體內(nèi)引入有利的不對稱的靜電的相互作用。
[0045]本發(fā)明涉及在位置B24處的非標準修飾，以改善二聚體或單體胰島素類似物的超濃縮制劑就物理穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性和絲裂原活性而言的性能。因為這些改善，可以以大于U-100且至多u-500的強度配制胰島素類似物，使得不論胰島素類似物的濃度如何，所述制劑在皮下注射以后 維持與常規(guī)野生型人胰島素u-100制劑類似的快速吸收和藥理學活性；后者的例子是優(yōu)泌林*R U-100 (Eli Lilly and Co)或 Novalin?R U-100 (Novo-Nordisk)。在一個實例中，胰島素類似物含有與在位置BlO處的酸性替換(Asp或Glu)結合的2F-PheB24。在其它實例中，在B24處的非標準氨基酸替換伴有在BlO處的酸性替換和在位置B29處的非標準替換，或伴有在A-或B鏈的別處的3個或更少的標準替換。
[0046]預見到，本發(fā)明的替換可以在許多現(xiàn)有胰島素類似物中的任一種做出。例如，本文中提供的位置B24處的苯丙氨酸的鄰-氟衍生物(2F-PheB24)可以在賴脯胰島素([LysB28，ProB29]_胰島素，在本文中縮寫為KP-胰島素)、門冬胰島素(AspB28_胰島素)、谷賴胰島素([LysB3, GIub29]-胰島素)或其它經(jīng)修飾的胰島素或胰島素類似物的背景下或在不同的藥物制劑內(nèi)在含有位置BlO的酸性殘基的胰島素類似物(除了人胰島素以外，諸如常規(guī)胰島素、NPH胰島素、緩慢胰島素或超緩慢胰島素)中做出。門冬胰島素含有Aspb28替換，且作為諾和銳?來銷售，而賴脯胰島素含有LysB28和ProB29替換，且被稱作名稱優(yōu)泌樂?和在名稱優(yōu)泌樂?下銷售；谷賴胰島素含有替換LysB28和ProB29，且被稱作名稱Apidra?和在名稱Apidra?下銷售。這些類似物描述在美國專利號5，149，777、5，474，978和7，452，860中。這些類似物各自被稱作速效胰島素。
[0047]為了對比目的，將人胰島素原的氨基酸序列提供為SEQ ID NO:1。
[0048]SEQ ID NO:1 (人胰島素原)
【權利要求】
1.一種包含胰島素的藥物制劑，所述胰島素具有變體胰島素B-鏈多肽，所述B-鏈多肽含有相對于人胰島素序列在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸替換、以及選自天冬氨酸和谷氨酸的相對于人胰島素序列在位置BlO處的含有酸性側鏈的氨基酸的替換，其中所述胰島素以0.6 mM至3.0 mM的濃度存在。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物制劑，其中所述胰島素以至少2mM的濃度存在。
3.根據(jù)權利要求2所述的藥物制劑，其中所述變體B-鏈多肽還含有相對于人胰島素序列在位置B29處的非標準氨基酸替換，所述替換選自:正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸。
4.根據(jù)權利要求1-3中的任一項所述的藥物制劑，其中所述變體B鏈另外含有選自天冬氨酸、脯氨酸和賴氨酸的相對于人胰島素序列在位置B28處的替換。
5.根據(jù)權利要求1、2或4中的任一項所述的藥物制劑，其中所述變體B鏈另外含有相對于人胰島素序列在位置B29處的替換，所述替換選自:賴氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
6.根據(jù)權利要求1-5中的任一項所述的藥物制劑，其中所述變體B鏈還含有相對于人胰島素序列在位置B3處的賴氨酸替換。
7.根據(jù)權利要求1-6中的任一項所述的藥物制劑，其包含選自以下的配對替換:在位置B28處的賴氨酸替換和在位置B29處的脯氨酸替換，或在位置B28處的天冬氨酸替換和在位置B29處的脯氨酸替換，所述替換位置是相對于人胰島素序列。
8.根據(jù)權利要求1-7中的任一項所述的藥物制劑，其中所述胰島素是哺乳動物胰島素的類似物。
9.根據(jù)權利要求8所述的藥物制劑，其中所述哺乳動物胰島素是人胰島素的類似物。
10.根據(jù)權利要求1所述的藥物制劑，其中所述B-鏈多肽包含選自SEQID NO: 4-8的氨基酸序列，且所述氨基酸序列另外包含具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的A-鏈多肽序列。
11.根據(jù)權利要求1-10中的任一項所述的藥物制劑，其包含含有在位置AS處的谷氨酸替換的胰島素A-鏈多肽序列。
12.根據(jù)權利要求1-10中的任一項所述的藥物制劑，其包含含有在位置AS處的組氨酸替換的胰島素A-鏈多肽序列。
13.一種降低患者的血糖水平的方法，所述方法包括:給所述患者施用生理學上有效量的胰島素類似物或其生理上可接受的鹽，其中所述胰島素類似物或其生理上可接受的鹽含有變體B-鏈多肽，所述變體B-鏈多肽摻入在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸和在位置BlO處的天冬氨酸或谷氨酸替換，其中所述胰島素類似物或其生理上可接受的鹽以0.6mM至3.0 mM的濃度存在。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述胰島素類似物或其生理上可接受的鹽以至少2 mM的濃度存在。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的方法，其中所述變體B-鏈多肽另外包含相對于人胰島素序列在位置B29處的非標準氨基酸替換，所述替換選自:正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、鳥氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸。
16.根據(jù)權利要求13-15中的任一項所述的方法，其中所述變體B鏈另外含有選自天冬氨酸、脯氨酸和賴氨酸的相對于人胰島素序列在位置B28處的替換。
17.一種多肽，其包含變體胰島素B-鏈多肽序列，所述多肽序列含有相對于人胰島素序列在位置B24處的鄰-單氟-苯丙氨酸替換、以及相對于人胰島素序列在位置BlO處的含有酸性側鏈的氨基酸的替換、和選自以下的相對于人胰島素序列在位置B29處的非標準氨基酸的替換:鳥氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸和氨基丙酸。
18.根據(jù)權利要求17所述的多肽，其中所述多肽是胰島素原類似物或單鏈胰島素類似物。
19.根據(jù)權利要求17或權利要求18所述的多肽，其中所述多肽另外含有選自天冬氨酸、脯氨酸和賴氨酸的相對于人胰島素序列在位置B28處的替換。
20.根據(jù)權利要求17-19中的任一項所述的多肽，其中所述多肽另外含有相對于人胰島素序列在位置B3處的賴氨酸替換。
【文檔編號】C07K14/82GK104010652SQ201280064561
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年10月29日 優(yōu)先權日:2011年10月27日
【發(fā)明者】M.魏斯 申請人:卡斯西部儲備大學