人源化il-6和il-6受體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種內(nèi)源性小鼠IL-6和/或IL-6受體基因被取代的小鼠，及建立和使用所述所述小鼠的方法。本發(fā)明提供了在內(nèi)源性IL-6Rα基因座用人源胞外域編碼序列取代小鼠胞外域編碼序列的小鼠。本發(fā)明還提供了包含受小鼠IL-6調(diào)控元件的調(diào)控的人源IL-6基因的小鼠，其中包括在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座用人源IL-6編碼序列取代小鼠IL-6編碼序列的小鼠。
【專利說明】人源化IL-6和IL-6受體
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明提供了內(nèi)源性IL-6和/或IL-6受體基因被取代的非人動(dòng)物。所述非人動(dòng)物的IL-6和/或IL-6受體基因在內(nèi)源性非人基因座被含有人源序列的人源IL-6和/或人源化IL-6受體基因取代。帶有人源IL-6和/或人源化IL-6受體基因的非人動(dòng)物，其中所述非人動(dòng)物不表現(xiàn)轉(zhuǎn)入了人源IL-6基因后的非人動(dòng)物表征的一種或多種病理癥狀。
【背景技術(shù)】
[0002]在本領(lǐng)域中包含人源IL-6基因的轉(zhuǎn)基因小鼠是已知存在的。然而，人源IL-6轉(zhuǎn)基因在小鼠基因組中的隨機(jī)插入導(dǎo)致了所述人源IL-6的蛋白表達(dá)調(diào)控性較差，表現(xiàn)在這類轉(zhuǎn)基因小鼠的很多病理癥狀，包括但不限于，漿細(xì)胞增生和腎小球腎炎。因此，這些小鼠的應(yīng)用有局限性。
[0003]人們需要表達(dá)人源或人源化IL-6和/或人源或人源化IL-6受體的非人動(dòng)物，如小鼠和大鼠。人們需要這類不表現(xiàn)hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中存在的一種或多種病理癥狀的人源化小鼠。
[0004]發(fā)明簡沭
[0005]一方面，本發(fā)明提供了基因修飾的非人動(dòng)物，其包含在內(nèi)源性IL-6和/或IL-6受體基因座用編碼人源或人源化IL-6和/或IL-6受體的基因取代編碼內(nèi)源性IL-6和/或IL-6受體的基因。本發(fā)明提供了鼠類動(dòng)物，其包含在內(nèi)源性鼠類IL-6基因座用人源IL-6基因取代內(nèi)源性IL-6基因；和/或包含用人源IL-6受體基因(或編碼所述受體基因胞外域的核苷酸序列)取代內(nèi)源性IL-6受體基因(或編碼所述受體基因胞外域的核苷酸序列)。
[0006]一方面，本發(fā)明提供了基因修飾的鼠類動(dòng)物，其在內(nèi)源性鼠類IL-6基因座受內(nèi)源性鼠類啟動(dòng)子和/或內(nèi)源性鼠類調(diào)控元件的調(diào)控表達(dá)人源IL-6基因。
[0007]—方面，本發(fā)明提供了基因修飾的鼠類動(dòng)物，其在內(nèi)源性鼠類IL-6受體基因座受內(nèi)源性鼠類啟動(dòng)子和/或內(nèi)源性鼠類調(diào)控元件的調(diào)控表達(dá)人源IL-6受體基因(或編碼人源胞外域及小鼠跨膜和胞內(nèi)域的基因)。
[0008]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的動(dòng)物(如:鼠類動(dòng)物，如小鼠或大鼠)，其表達(dá)人源IL-6蛋白，其中所述非人動(dòng)物不表現(xiàn)選自以下組的病理癥狀:漿細(xì)胞增生、腎小球腎炎、腎小球硬化癥、系膜增生性腎小球腎炎、腸道淋巴瘤、腎淋巴瘤、脾腫大、淋巴結(jié)腫大、肝腫大、骨髓巨核細(xì)胞、致密異常性漿細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤到肺或肝或腎、腎系膜細(xì)胞增生、大腦過量表達(dá)IL-6、白質(zhì)分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞、大腦反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、腎衰竭、脾巨核細(xì)胞升高、肌肉萎縮(如:腓腸肌萎縮)、肌肉組織蛋白酶B和B+L升高(如:約20倍和6倍)以及這些病理癥狀的組合。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物包含正常的B細(xì)胞種群。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述正常B細(xì)胞種群在數(shù)量和免疫分型上與野生型動(dòng)物，如野生型小鼠，大致相同，。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述非人動(dòng)物是鼠類(如:小鼠或大鼠)，且在血清中以低于約 800pg/mL、低于約 700、600、500、400、300、*200pg/mL 的水平表達(dá)人源 IL-6 (hIL-6)。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述鼠類動(dòng)物在血清中以約為50到約不多于200pg/mL，在另一個(gè)實(shí)施方式中以約為75-125pg/mL，在另一實(shí)施方式中以約為100pg/mL的水平表達(dá)hIL_6。
[0011]—方面,本發(fā)明提供了一種非人的動(dòng)物,其表達(dá)hIL-6和/或hIL_6R,其中所述非人動(dòng)物在內(nèi)源性非人IL-6基因座和/或內(nèi)源性非人hIL-6R基因座表達(dá)hIL-6和/或hIL-6R。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述非人動(dòng)物是鼠類(如:小鼠或大鼠)。
[0012]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座表達(dá)hIL-6，其中所述內(nèi)源性小鼠IL-6基因已被hIL-6基因取代。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠含有表達(dá)IL-6受體(IL-6R)的細(xì)胞,所述受體包含在細(xì)胞表面的人源胞外域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為淋巴細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述淋巴細(xì)胞為B細(xì)胞。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方式中，在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座約6.8kb長的，包括外顯子I到5和3’末端非翻譯序列被刪除并被約4.Skb長的人源IL-6基因中包括外顯子I到5的人源IL-6基因序列取代。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述人源IL-6基因包含人源BAC CTD-2369M23上人源IL-6基因的外顯子I到5。
[0015]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其表達(dá)來自人源IL-6基因的IL-6，其中所述小鼠在血清中表達(dá)人源IL-6。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠血清中人源IL-6的血清濃度達(dá)到從約25到約300pg/mL、從 50 到約 250pg/mL、從 75 到約 200pg/mL、或從 100 到約 150pg/mL。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述小鼠血清中人源IL-6水平約為100pg/mL。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠骨髓中泛B細(xì)胞特異性標(biāo)記物水平與野生型小鼠大致相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠脾臟中泛B細(xì)胞特異性標(biāo)記物水平與野生型小鼠大致相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述泛B細(xì)胞特異性標(biāo)記物選自B220，⑶19，⑶20，⑶22，CD79a, CD79b, L26，和 Pax-5 (BSAP)。
[0018]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其表達(dá)hIL-6，其中所述小鼠不具有選自下組的特征之一:漿細(xì)胞增生、脾腫大、淋巴結(jié)腫大、致密異常性漿細(xì)胞及這些特征的組合。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含與野生型小鼠脾臟重量大致相同(單位體重)的脾臟。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的淋巴結(jié)與野生型小鼠淋巴結(jié)重量大致相同(單位體重)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的漿細(xì)胞不具有過量表達(dá)人源IL-6的小鼠所具有的漿細(xì)胞增多的表征。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠不具有腎小球腎炎。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的系膜細(xì)胞水平與野生型小鼠的系膜細(xì)胞水平相當(dāng)。
[0022] 一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座表達(dá)hIL-6，其中內(nèi)源性小鼠IL-6基因被取代為hIL-6基因，其中所述小鼠不具有選自下組的特征之一:形態(tài)學(xué)上可檢出的神經(jīng)病態(tài)、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及這些特征的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含與野生型小鼠大腦無形態(tài)學(xué)明顯差異的大腦。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水平不高于野生型小鼠大腦組織中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水平的大腦組織。[0023]在一個(gè)實(shí)施方式中,所述小鼠在神經(jīng)兀中不表達(dá)人源IL-6。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述小鼠中包含與野生型小鼠中活化星形膠質(zhì)細(xì)胞水平相當(dāng)?shù)幕罨切文z質(zhì)細(xì)胞水平。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠在其白質(zhì)中包含分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞，其中所述分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量與野生型小鼠分支狀小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相等。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠不具有反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠白質(zhì)在形態(tài)學(xué)上與野生型小鼠白質(zhì)無明顯差異。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠白質(zhì)在反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞組織化學(xué)染色上與野生型小鼠白質(zhì)無明顯組織學(xué)差異。
[0026]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠大腦與野生型小鼠大腦無明顯形態(tài)學(xué)差異。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠腦組織中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水平不高于野生型小鼠腦組織中反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生水平。
[0027]—方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其特征在于，所述小鼠在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座表達(dá)hIL-6，其中 所述內(nèi)源性小鼠IL-6基因被hIL_6基因取代，其中所述小鼠不具有選自下組的特征之一:壽命降低約50%或更多、腎衰竭、高丙種球蛋白血癥、脾巨核細(xì)胞升高、骨髓巨核細(xì)胞升高、脾漿細(xì)胞增生、胸腺漿細(xì)胞增生、淋巴結(jié)漿細(xì)胞增生、腎小球腎炎、腎小球硬化癥及這些特征的組合。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的壽命超過了 20周。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的壽命超過了 30周、40周或50周。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的壽命與同品系野生型小鼠的壽命大致相同。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠脾臟巨核細(xì)胞水平不高于野生型小鼠皮巨核細(xì)胞水平。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠的淋巴器官基本沒有異常和致密排列的類漿細(xì)胞。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠血清中丙種球蛋白水平與野生型小鼠血清中丙種球蛋白水平持平。在一個(gè)實(shí)施例中，所述小鼠血清α?-和β_球蛋白水平與同品系野生型小鼠血清α 1-和β_球蛋白水平持平。
[0032]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座表達(dá)人源IL-6，其中內(nèi)源性小鼠IL-6基因被hIL-6基因取代，其中所述小鼠不具有選自下組的特征之一:肌肉萎縮、與同品系野生型小鼠相比有升高的組織蛋白酶B水平、與同品系野生型小鼠相比有升高的組織蛋白酶A+B水平、與同品系野生型小鼠相比有增加的肝臟重量及這些特征的組合。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠肝臟重量在12周大時(shí)約為800_900mg。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠在整個(gè)生命周期中表現(xiàn)出不高于野生型小鼠觀察水平的組織蛋白酶B水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠具有在整個(gè)生命周期中不高于野生型小鼠觀察的水平的組織蛋白酶A+B水平。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠成年時(shí)表現(xiàn)出同品系野生型小鼠腓腸肌重量10 %的腓腸肌重量。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠成年時(shí)表現(xiàn)出與同品系野生型小鼠腓腸肌重量大致相同的腓腸肌重量。
[0036]一方面，本發(fā)明提供了一種小鼠，其包含編碼人源IL-6蛋白的核苷酸序列，其中所述編碼人源IL-6蛋白的核苷酸序列取代了整個(gè)或部分編碼內(nèi)源性小鼠IL-6蛋白的內(nèi)源性核苷酸序列。[0037]—方面，本發(fā)明提供了一種小鼠，其在內(nèi)源性小鼠IL-6受體基因座用人源IL-6RQ的胞外域序列取代小鼠IL-6Ra胞外域序列以形成人源/小鼠IL_6R α嵌合體基因。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合體IL-6Ra基因在內(nèi)源性小鼠IL-6Rα基因座受小鼠啟動(dòng)子和/或小鼠調(diào)控元件的調(diào)控。
[0039]在一個(gè)實(shí)施方式中，約35.4kb的小鼠IL_6Ra胞外域編碼序列被約45.5kb的人源IL-6R胞外域編碼序列取代。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源IL-6R胞外域編碼序列是從外顯子I的第一個(gè)密碼子(ATG)到外顯子8。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述被取代的小鼠IL-6Ra序列包含連續(xù)的序列，所述連續(xù)序列包含外顯子I到8。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，外顯子I到8及部分第8內(nèi)含子被刪除。
[0042]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座用編碼人源IL-6的人源基因取代編碼IL-6的小鼠基因，其中所述編碼人源IL-6的人源基因在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座受內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件的調(diào)控。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述編碼人源IL-6的人源基因是BAC ID為CTD-2369M23的人源IL-6基因。
[0044]在一個(gè)實(shí)施 方式中,所述小鼠表達(dá)小鼠IL_6Ra。在一個(gè)實(shí)施方式中,所述小鼠表達(dá)人源IL-6Ra。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化的IL-6Ra含有人源胞外域。在一個(gè)實(shí)施方式中，人源化的IL-6Ra含有小鼠跨膜域和小鼠胞質(zhì)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠表達(dá)的人源化的IL-6Rci包含胞外域的人源化，但不包含跨膜域和/或胞質(zhì)域的人源化。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠不具有選自下組的特征之一:漿細(xì)胞增生、腎小球硬化癥、腎小球腎炎、腎衰竭、高丙種球蛋白血癥、脾巨核細(xì)胞升高、骨髓巨核細(xì)胞升高、脾腫大、淋巴結(jié)腫大、致密異常性漿細(xì)胞及這些特征的組合。
[0046]—方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其包含內(nèi)源性小鼠IL-6Ra基因的人源化，其中所述人源化是用人源IL-6Ra胞外域編碼序列取代內(nèi)源性小鼠IL-6Ra基因座的小鼠IL-6Ra胞外域編碼序列。
[0047]在一個(gè)實(shí)施方式中，用編碼人源IL-6Ra胞外域的人源IL_6Ra序列的連續(xù)基因組片段取代包含小鼠外顯子I到8的連續(xù)小鼠序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述編碼胞外域的人源IL-6Ra序列的連續(xù)基因組片段來自BACCTD-2192J23。
[0048]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠進(jìn)一步包含人源化的IL-6基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠包含在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座用人源IL-6基因取代小鼠IL-6基因。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化IL-6基因受內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件的調(diào)控。
[0049]一方面，本發(fā)明提供了一種建立人源化小鼠的方法，包括用編碼人源IL-6的人源基因取代編碼小鼠IL-6的小鼠基因序列。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述取代發(fā)生在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座，且編碼人源IL-6的人源基因與內(nèi)源性小鼠調(diào)控序列被可操作的連接。
[0051]一方面，本發(fā)明提供了一種建立人源化小鼠的方法，包括用編碼人源IL-6Ra胞外域序列的人源基因組片段取代編碼小鼠IL-6Ra胞外域序列的小鼠外顯子，以形成人源化的IL_6Ra基因。[0052]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述取代發(fā)生在內(nèi)源性小鼠IL-6Rci基因座，且人源化的IL-6Ra基因與內(nèi)源性小鼠調(diào)控序列被可操作的連接。
[0053]一方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的小鼠，其包含的人源化IL-6RCI基因是用人源胞外域序列取代小鼠胞外域編碼序列，其中人源化的IL-6Ra基因含有小鼠跨膜序列和小鼠胞質(zhì)序列；其中所述小鼠還包含編碼人源IL-6的基因，其中所述編碼人源IL-6的基因受內(nèi)源性小鼠IL-6調(diào)控元件的調(diào)控。
[0054]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠無法表達(dá)完整的小鼠IL-6Rci，且無法表達(dá)小鼠IL-6。
[0055]在很多方面，本發(fā)明所述的基因修飾的小鼠在所述小鼠品系中包含基因修飾。
[0056]一方面，本發(fā)明提供了如前所述的小鼠的組織、細(xì)胞或細(xì)胞膜片段。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的組織或細(xì)胞來自于表達(dá)人源IL-6蛋白的小鼠，但所述小鼠不表達(dá)小鼠IL-6蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的組織或細(xì)胞來自于表達(dá)人源化IL-6Ra蛋白的小鼠，但所述小鼠不表達(dá)小鼠IL-6Ra蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述人源化IL-6Ra蛋白包含人源胞外域及小鼠跨膜域和小鼠胞質(zhì)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的組織或細(xì)胞來自表達(dá)人源IL-6、人源化IL-6R α的小鼠，但所述小鼠不表達(dá)小鼠IL-6，也不表達(dá)含有小鼠胞外域的IL-6Ra。
[0058]一方面，本發(fā)明提供了一種小鼠細(xì)胞的體外復(fù)合物，其包含人源化IL-6Ra (人源胞外域和小鼠跨膜域及小鼠胞質(zhì)域)和人源IL-6。
[0059]一方面，本發(fā)明提供了一種包含如前所述的基因修飾的小鼠胚胎。
[0060]一方面，本發(fā)明提供了一種小鼠宿主胚胎，其特征在于，所述胚胎包含如前所述的帶有基因修飾的供體細(xì)胞。
[0061]一方面，本發(fā)明提供了一種包含所述基因修飾的多能性或全能性的非人動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為鼠類細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
[0062]一方面，本發(fā)明提供了一種小鼠卵子，其中所述小鼠卵子包含異位小鼠染色體，其中所述異位小鼠染色體含有如前所述的基因修飾。
[0063]一方面，所述包含人源IL-6基因或人源或人源化IL-6Rci基因的基因修飾小鼠、胚胎、卵子或細(xì)胞來自C57BL品系小鼠，所述品系選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/01a。在另一實(shí)施方式中，所述小鼠是129品系，所述品系選自組成所述群體的品系:129P1、129P2、129P3、129X1、129S1 (如 129S1/SV、129Sl/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(見如:Festing et al.(1999)Revised nomenclature for strainl29mice, Mammalian GenomelO:836,以及 Auerbach et al (2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/ScEv-andC57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述基因修飾小鼠是以上提到的129品系和以上提到的C57BL/6品系的混合。在另一【具體實(shí)施方式】中，所述小鼠是以上提到的129品系內(nèi)的混合，或以上提到的BL/6品系內(nèi)的混合。在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一實(shí)施方式中，所述小鼠是BALB品系，如BALB/c品系。又在另一實(shí)施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一個(gè)以上提到的品系的混合。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠是Swiss或Swiss Webster小鼠。
[0064]本發(fā)明所述的各個(gè)方面和實(shí)施方式能夠一起使用，除非明確或清楚地排除在所述實(shí)施例或方面的內(nèi)容以外。
[0065]附圖簡沭
[0066]圖1提供了人(上)和小鼠(下)IL-6基因組基因座的未按比例縮放的示意圖，。圖中右側(cè)閉合方塊表示外顯子1、I1、II1、IV和V(在人和小鼠中都有)。圖中左側(cè)開放式方塊表示選定的推斷的調(diào)控區(qū)域。
[0067]圖2顯示了野生型小鼠、人源化胞外域IL-6R小鼠和具有人源化IL-6和IL-6R基因的小鼠中在含有和不含有松節(jié)油的情況下的急性時(shí)相反應(yīng)(mSAA水平)。
[0068]圖3顯示了在不含有或含有抗小鼠IL-6R抗體的情況下野生型小鼠的松節(jié)油依賴性急性時(shí)相反應(yīng)(SAA)(左圖)；及不含有或含有抗人源IL-6R抗體的人源化IL-6/IL-6R小鼠中松節(jié)油依賴性急性時(shí)相反應(yīng)(右圖)。
[0069]圖4顯示了野生型和人源化IL-6小鼠脾臟B細(xì)胞流式細(xì)胞分析；泛B細(xì)胞標(biāo)記物。
[0070]圖5顯示了野生型和人源化IL-6小鼠脾臟T細(xì)胞流式細(xì)胞分析；輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0071]圖6顯示了野生型和人源化IL-6小鼠脾臟細(xì)胞流式細(xì)胞分析；Ly6G/C (Grl)。
[0072]圖7顯示了野生型和人源化IL-6小鼠脾臟細(xì)胞流式細(xì)胞分析；自然殺傷(NK)細(xì)胞和粒性白血球(Ly6Ghi+/CDllbhi+)。
[0073]圖8顯示了野生型和人源化IL-6小鼠血液B細(xì)胞流式細(xì)胞分析；泛B細(xì)胞標(biāo)記物。
[0074]圖9顯示了野生型和人源化IL-6小鼠血液T細(xì)胞流式細(xì)胞分析；輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
[0075]圖10顯示了野生型和人源化IL-6小鼠血液髓樣細(xì)胞流式細(xì)胞分析；Grl+細(xì)胞。
[0076]圖11顯示了野生型和人源化IL-6小鼠血液髓樣細(xì)胞流式細(xì)胞分析ADllb對(duì)Ly6G/C(Grl)。
[0077]圖12表示野生型和人源化IL-6小鼠血液髓樣細(xì)胞流式細(xì)胞分析；0乂5對(duì)^1113細(xì)胞。
[0078]圖13顯示了野生型和人源化IL-6小鼠骨髓IgM/⑶24/B220流式細(xì)胞分析。上:骨髓正常進(jìn)程。下:野生型、hIL-6雜合子、和hIL-6純合子(IgM染色)流式細(xì)胞分析。
[0079]圖14顯示了野生型和人源化IL-6小鼠骨髓IgM/⑶24/B220流式細(xì)胞分析。上:骨髓正常進(jìn)程。下:野生型、hIL-6雜合子、和hIL-6純合子(⑶24染色)流式細(xì)胞分析。
[0080]圖15顯示了野生型和人源化IL-6小鼠骨髓⑶43和B220流式細(xì)胞分析。上:骨髓正常進(jìn)程。下:野生型、hIL-6雜合子、和hIL-6純合子(⑶43染色)流式細(xì)胞分析。
[0081]發(fā)明詳描
[0082]IL-6 和 IL-6R
[0083] IL-6受體(IL-6R)很長時(shí)間以來被表征為B細(xì)胞刺激因子(BSF-2，或B細(xì)胞刺激因子2 ;及BCDF，或B細(xì)胞分化因子)受體，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)B細(xì)胞以合成免疫球蛋白(Yamasakiet al.(1998)Cloning and Express1n of the Human Interleukin-6 (BSF-2/IFN β 2)Receptor, Science241:825-828)。IL-6最早被描述為干擾素-β 2，這是由于IL-6是在通過用雙鏈RNA聚肌胞苷酸(dSRNAp0ly(I)p0ly(C))處理人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)抗病毒性的反應(yīng)，以尋找被稱為干擾素-β的病毒誘導(dǎo)的蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)的(Weissenbach et al.(1980)Two interferon mRNAs in human fibroblasts:In vitro translat1n and Escherichiacoli cloning studies，Proc.Natl Acad.Sc1.USA77 (12):7152-7156 ；Keller et al.(1996)Molecular and Cellular B1logy of Interleukin_6and Its Receptor， Frontiers inB1sciencel:d340_357)。
[0084]人cDNA編碼一種468個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含一段19肽的信號(hào)序列和約82個(gè)氨基酸的缺少酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)域(見同上)。所述蛋白質(zhì)的N末端(胞外域)含有約90個(gè)氨基酸的免疫球蛋白(Ig)超家族結(jié)構(gòu)域，250個(gè)氨基酸的在免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞膜之間的結(jié)構(gòu)域，和約28個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)(見同上)。所述受體的胞外域與所述受體配體IL-6結(jié)合，IL-6觸發(fā)了所述受體與細(xì)胞膜上的人糖蛋白130(gpl30)的結(jié)合且由這個(gè)復(fù)合物進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；據(jù)報(bào)道所述胞質(zhì)域不轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)(Tagaet al.(1989) Interleukin-6Triggers the Associat1n of Its Receptor with a PossibleSignal Transducer，gpl30，Cell58:573-581)。的確，缺少胞質(zhì)域的IL-6R的可溶性形式可以在細(xì)胞表面上與IL-6相關(guān)聯(lián)并結(jié)合gpl30且有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)(同上)。
[0085]hIL-6R和mIL-6R在蛋白水平的同源性僅有約54% ;跨膜域同源性約79%，而胞質(zhì)域同源性約 54% (Sugito et al.(1990))。
[0086]所述IL-6R的天然配體IL-6，最早是從培養(yǎng)的HTLV-1-轉(zhuǎn)化T細(xì)胞中分離得到的(見 Hirano et al.(1985) Purificat1n to homogeneity and characterizat1n ofhuman B cell differentiat1n factor (BCDF or BSFp-2)，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:5490-5494)。編碼IL -6基因的人cDNA被至少克隆過兩次，一次作為BSF_2(見Hiranoet al.(1086)Complemetary DNA fro a novel human interleukin (BSF-2)that induces Blymphocytes to produce immunoglobulin, Nature324:73-76)，一次作為干擾素(IFN)β 2 (見Zilberstein et al.(1986) Structure and express1n of cDNA and genes for humaninterferon-beta—2，a distinct species inducible by growth-stimulatory cytokines,EMB05:2529-2537)，盡管從那之后重組人源IL-6被證明不具有可檢出的干擾素活性。
[0087]人源IL-6是一種包含184個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其與小鼠IL-6僅有約42%的同源性，盡管人和小鼠基因的基因組結(jié)構(gòu)基本相同，且人和小鼠基因的啟動(dòng)子區(qū)域都有一段 400bp 高度保守的片段(見 Tanabe et al.(1988)Genomic Structure of the MurineIL_6Gene:High Degree Conservat1n of Potential Regulatory Sequences between Mouseand Human，J.1mmunol.141 (11):3875-3881)。
[0088]所述人源IL-6 基因約 5kb 長(Yasukawa et al.(1987) Structure and express1nofhuman B cell stimulatory factor-2(BSC-2/IL-6)gene, EMBO J.6(10):2939-2945)，而所述小鼠 IL-6 基因約 7 kb 長(Tanabe et al.(1988) Genomic Structure of the MurineIL_6Gene:High Degree Conservat1n of Potential Regulatory Sequences between Mouseand Human，J.1mmunol.141 (11):3875-3881)。據(jù)報(bào)道小鼠和人源IL-6基因都有對(duì)調(diào)控很重要的高度保守的5’端側(cè)翼序列。圖1為人源和小鼠IL-6基因組基因座的示意圖(未按比例縮放)。外顯子1、I1、II1、IV和V(在人和小鼠中都有)在圖中右側(cè)顯示為閉合方塊。選定的推斷調(diào)控區(qū)域在圖中左側(cè)顯示為開放性方塊。人類的推斷調(diào)控區(qū)域從左到右為-557到-552的糖皮質(zhì)激素元件；_472到-468的干擾素增強(qiáng)子核心序列；_466到-461的糖皮質(zhì)激素元件；_395到-334的AT富集區(qū)；_383到-277的共有的轉(zhuǎn)錄激活因子(AP)-1結(jié)合位點(diǎn)；-253到-248的IFN增強(qiáng)子核心序列「205到-192的含有GGAAA的二級(jí)結(jié)構(gòu)「169到-82的c-fos血清反應(yīng)元件(SRE)同源序列，所述序列含有干擾素(IFN)增強(qiáng)子核心序列、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件、GGAAA 二級(jí)結(jié)構(gòu)、CCAAT盒和GC富集區(qū)；_61到-55的轉(zhuǎn)錄激活因子(AP)-1結(jié)合位點(diǎn)以及-34到-30的CCAAT盒。小鼠的推斷調(diào)控區(qū)域從左到右為-553到-536的GC富集區(qū)、-521到-516和-500到-495的糖皮質(zhì)激素元件；_447到-396的Z-DNA片段；-227到-288的與干擾素(IFN)增強(qiáng)子核心序列重疊的轉(zhuǎn)錄激活因子(AP)-1結(jié)合位點(diǎn)、-210到-195的與干擾素(IFN)增強(qiáng)子核心序列重疊的GGAAA 二級(jí)結(jié)構(gòu)；_171到-82的c-fos血清反應(yīng)元件(SRE)同源區(qū)，含有環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件、與干擾素(IFN)增強(qiáng)子核心序列重疊的GGAAA 二級(jí)結(jié)構(gòu)和GC富集區(qū)；以及-61到-55的轉(zhuǎn)錄激活因子(AP)-1結(jié)合位點(diǎn)。小鼠密碼子I到V長度分別為:19、185、114、150和165。小鼠內(nèi)含子長度為:1到II之間162bp ；II到III之間1253bp ；III到IV之間2981bp ；IV到V之間1281bp。人類密碼子I到V長度為:19、191、114、147和165。人類內(nèi)含子長度為:1到II之間154 ；11到III之間1047 ；111到IV之間706 ；IV到V之間1737?；蚪M結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來自 Tanabe et al.(1988),和 Yasukawa et al.(1987) Structure and express1n ofhuman Bcell stimulatory factor-2 (BSC-2/IL-6) ge ne, EMBO J.9 (10):2939_2945。
[0089]以下的假設(shè)也許是合理的:基于小鼠和人源IL-6基因5’端側(cè)翼序列的相似性，對(duì)小鼠和人源IL-6基因的調(diào)控作用似乎是相似的。多種細(xì)胞類型在對(duì)白介素(IL)-l、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、干擾素(IFN) β、血清、聚肌胞苷酸(poly (I)poly (C))和放線菌酮發(fā)生應(yīng)答的情況下表現(xiàn)出升高的IL-6表達(dá)(見Tanabe et al.(1988)。人體中IL-6介導(dǎo)急性時(shí)相反應(yīng)、造血、B細(xì)胞分化、T細(xì)胞活化、生長和/或分化和/或活化多種細(xì)胞類型(如肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、垂體細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞等等)(見綜述，如Heinrichet al.(1990), Kishimoto et al.(1989)和 Keller et al.(1996) ；Sugita et al.(1990)Funct1nal Murine Interleukin Receptor with Intracisternal A Particle Gene Productat its Cytoplasmic Domain, J.Exp.Med.171:2001-2009)。
[0090]然而在實(shí)踐中，人源IL-6轉(zhuǎn)基因小鼠具有諸多的嚴(yán)重并致弱的(a panoply ofsubstantial and debilitating)病理癥狀，反映出顯著的IL_6基因多效性。含有包含所述人源IL-6基因和μ增強(qiáng)子(Εμ)的6.6kb片段的轉(zhuǎn)基因小鼠，所述小鼠產(chǎn)生高濃度hIL-6和極高水平的IgGl (高出野生型小鼠120到400倍)，反映出伴有漿細(xì)胞增生、系膜增生性腎小球腎炎以及高水平骨髓巨核細(xì)胞的IL-6的異常(Suematsu et al.(1989)IgGlplasmacytosis in interIeukin6transgenic mice, Proc.Natl Acad.Sc1.USA86:7547-7551)。IL_6和/或IL-6R的異常調(diào)控作用是與骨髓瘤、漿細(xì)胞瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、卡斯特萊曼病(Castleman' s disease)、系膜增生性腎小球腎炎、心臟粘液瘤、楽;細(xì)胞瘤(plams cell neoplasias)、銀屑病以及其他病癥相關(guān)聯(lián)的(見Kishimoto, T.(1989)The B1logy of Interleukin-6, Blood74 (I):1-10 ；Sugita et al.(1990);還有 Hirano etal.(1990)B1logical and clinical aspects of interleukin6, Immunology Todayll (12):443-449))。IL-6還牽涉到維持通過旁分泌和/或自分泌機(jī)制進(jìn)行的雄激素剝奪治療的前列腺癌病人的內(nèi)前列腺雄激素水平，IL-6潛在地為去勢(shì)難治性前列腺腫瘤的生長提供支持(Chun et al.(2009) Interleukin-6 Regulates Androgen Synthesis in Prostate CancerCells, Clin.Cancer Res.15:4815-4822)。
[0091 ] 所述人源蛋白是含212個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，成熟的形式是剪切掉28個(gè)氨基酸信號(hào)序列而形成的含184個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)含有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和兩個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，在一些細(xì)胞中人源IL-6被磷酸化。所述小鼠蛋白是含211個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，成熟的形式是剪切掉23個(gè)氨基酸信號(hào)序列而形成的含187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。小鼠蛋白含有O-糖基化位點(diǎn)，而不含N-糖基化位點(diǎn)(見關(guān)于IL-6的綜述，如Heinrich et al.(1990)Interleukin_6and the acute phase response, B1chem.J.265:621-636)。
[0092]IL-6功能是多效性的。在活化的B細(xì)胞上含有IL-6受體，而據(jù)報(bào)道休眠B細(xì)胞上不含有IL-6受體。相比之下，IL-6R存在于休眠T細(xì)胞上且據(jù)報(bào)道可以促進(jìn)T細(xì)胞分化、活化和增殖，包括T細(xì)胞在有IL-2的情況下分化成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
[0093]人源化IL-6/IL-6R胞外域小鼠和IL_6介導(dǎo)的急性時(shí)相反應(yīng)
[0094]在人體中，IL-6誘導(dǎo)了急性時(shí)相反應(yīng)。早期對(duì)人肝細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)IL-6誘導(dǎo)的急性時(shí)相蛋白包括:如劑量和時(shí)間依賴性的C反應(yīng)蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)(綜述 Heinrich et al.(1990) Interleukin_6and the acute phase response, B1chem.J.265:621-636)。由此含有人源化IL-6和IL-6R基因的非人動(dòng)物如小鼠和大鼠對(duì)檢測(cè)人源IL-6介導(dǎo)的急性時(shí)相反應(yīng)是很有用處的系統(tǒng)。這些動(dòng)物還對(duì)判斷一種物質(zhì)是否誘導(dǎo)了由IL-6介導(dǎo)的急性時(shí)相反應(yīng)有幫助，通過將本發(fā)明所述的人源化IL-6/IL-6R動(dòng)物暴露于所述物質(zhì)，檢測(cè)一種或多種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白(或RNA)水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，將人源化動(dòng)物在含有人源IL-6R的阻斷劑情況下暴露于所述物質(zhì)，并測(cè)量一種或多種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白(或RNA)水平，其中在含有人源IL-6R阻斷劑情況下急性時(shí)相反應(yīng)蛋白(或RNA)水平的下降說明了人源IL-6R介導(dǎo)的急性時(shí)相反應(yīng)。
[0095]人源IL-6與人源IL-6R和小鼠IL-6R都可以結(jié)合；小鼠IL-6與小鼠IL-6R結(jié)合但不能與人源IL-6R結(jié)合(檢測(cè)不到mIL-6與hIL_6R的結(jié)合，而hIL_6可與mIL_6競(jìng)爭性結(jié)合到 mIL_6R 上；Coulie et al.(1989)High-and low-affinity receptors for murineinterleukin6.Distinct distribut1n on B and T cells, Eur.J.Tmmunol.19:2107-211)；又見如 Peters et al.(1996) The Funct1n of the Soluble Interleukin6 (IL-6) ReceptorIn Vivo:Sensitizat1n of Human Soluble IL-6Receptor Transgenic Mice TowardsIL-6and Prolongat1n of the Plasma Half-life of IL-6, J.Exp.Med.183:1399-1406)。因此，小鼠體內(nèi)帶有hIL-6R的人源細(xì)胞(如在異種移植中)不可以依靠內(nèi)源性mIL-6發(fā)揮IL-6介導(dǎo)的功能，所述功能包括但不限于IL-6對(duì)血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞發(fā)育的作用(如造血功能、B細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化等)。
[0096]在含有野生型小鼠IL-6基因和人源IL-6R基因(但無小鼠IL-6R基因)的混合的活體內(nèi)，急性時(shí)相反應(yīng)誘導(dǎo)因子不一定會(huì)誘導(dǎo)出可測(cè)得的顯示急性時(shí)相反應(yīng)的急性時(shí)相蛋白水平。然而，本發(fā)明所述的包含人源化IL-6基因和包含帶人源化胞外域序列的IL-6R基因的人源化小鼠卻能夠?qū)毙詴r(shí)相反應(yīng)誘導(dǎo)因子做出反應(yīng)并在血清中表達(dá)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。針對(duì)IL-6/IL-6R為野生型的小鼠被用來測(cè)試在含有或不含有急性期誘導(dǎo)因子松節(jié)油的情況下的急性時(shí)相蛋白的表達(dá)，所述小鼠顯示了松節(jié)油依賴性的急性時(shí)相蛋白升高。帶有人源化IL-6而非IL-6R基因的小鼠，在含有松節(jié)油情況下不表現(xiàn)急性時(shí)相反應(yīng)。但是同時(shí)帶有人源IL-6基因和人源化胞外域的IL-6R基因的小鼠，則表現(xiàn)出強(qiáng)烈的急性時(shí)相反應(yīng)(圖2)。由IL-6介導(dǎo)的急性時(shí)相反應(yīng)在野生型小鼠(圖3，上)和人源化IL-6/IL-6R胞外域小鼠(圖3，下)中都是IL-6依賴性的，這從合適的抗IL-6R抗體在有足夠高的抗體劑量時(shí)能消除急性時(shí)相反應(yīng)的能力中可以看出。因此，IL-6和IL-6R的雙重人源化重演了針對(duì)血清急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的野生型IL-6介導(dǎo)的急性時(shí)相反應(yīng)。
[0097]基因修飾的小鼠
[0098]本發(fā)明提供了基因修飾的小鼠，其特征在于，所述小鼠在內(nèi)源性小鼠基因座表達(dá)人源IL-6和/或人源化IL-6受體，其中內(nèi)源性小鼠IL-6基因和/或內(nèi)源性小鼠IL-6受體基因被帶有編碼人源IL-6受體胞外域序列的人源IL-6基因和/或人源序列取代。所述基因修飾小鼠表達(dá)的人源IL-6和/或人源化IL-6受體來自人源化內(nèi)源性基因座，所述基因座受小鼠啟動(dòng)子和/或小鼠調(diào)控元件的調(diào)控。在內(nèi)源性小鼠基因座上發(fā)生的取代使得表達(dá)有人源IL-6和人源化IL-6受體的非人動(dòng)物不具有在現(xiàn)有已知的IL-6轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到的繁多的實(shí)質(zhì)性病理癥狀。
[0099]在本領(lǐng)域中表達(dá)人源IL-6的轉(zhuǎn)基因小鼠是已知存在的。然而，所述小鼠通常帶有顯著的病理癥狀，使得所述小鼠用途嚴(yán)重受限。本發(fā)明所述的人源化小鼠在內(nèi)源性小鼠IL-6和IL-6R α基因座表達(dá)受內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件調(diào)控的人源IL-6和/或人源化IL-6受體。這些小鼠中這些基因的表達(dá)模式反而不同于已知的轉(zhuǎn)基因小鼠。
[0100]在內(nèi)源性非人的基因座用同源或直系同源的人源基因或人源序列取代非人動(dòng)物中的非人基因，并受內(nèi)源性啟動(dòng)子和/或調(diào)控元件的調(diào)控，可以得到也許非常不同于典型的敲除加轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物的品質(zhì)和特征的非人動(dòng)物。在典型的敲除加轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物中，內(nèi)源性基因座被移除或破壞后一整段人源轉(zhuǎn)基因被插入到動(dòng)物的基因組中，所述人源轉(zhuǎn)基因可能隨機(jī)整合到動(dòng)物基因組中。通常，整合過的轉(zhuǎn)基因的位置是未知的；人源蛋白質(zhì)的表達(dá)是通過對(duì)人源基因的轉(zhuǎn)錄和/或蛋白質(zhì)檢測(cè)和/或功能性檢測(cè)來測(cè)定。將人源基因上游和/或下游包含進(jìn)人源序列顯然是假定無論所述轉(zhuǎn)基因插入動(dòng)物基因組的什么位置都足以給轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或調(diào)控提供適宜的支持。但是在很多情況下，帶有人源調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)模式是生理上不健全的或不能令人滿意的，且可以對(duì)動(dòng)物造成傷害。相比之下，
【發(fā)明者】證明了在受內(nèi)源性調(diào)控元件調(diào)控的內(nèi)源性基因座用人源序列進(jìn)行取代后得到了生理上健全的表達(dá)模式和水平，從而獲得了有用處的人源化動(dòng)物，該動(dòng)物的生理機(jī)能就被取代的基因而言是對(duì)人源化動(dòng)物的生理環(huán)境有意義并健全的。
[0101]據(jù)報(bào)道將一種含有主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類啟動(dòng)子H2和β-球蛋白內(nèi)含子并驅(qū)動(dòng)695bp的小鼠IL-6基因的表達(dá)的載體結(jié)構(gòu)注射進(jìn)入小鼠受精卵中，由此產(chǎn)生的小鼠可持續(xù)性地表達(dá)相對(duì)高水平的小鼠IL-6 (與野生型小鼠比較)(見Woodrofeet al.(1992)Long-Term Consequences of Interleukin_60verexpress1n in TransgenicMice, DNA and Cell B1logyll (8):587-592)。但這些小鼠更容易發(fā)展出與腸道、淋巴結(jié)、腎以及脾淀粉樣蛋白沉積相關(guān)聯(lián)的淋巴瘤。這些小鼠也會(huì)表現(xiàn)出異常的B細(xì)胞成熟(見Woodrofe et al., Id.),由此對(duì)B細(xì)胞功能的研究也受到影響。相比之下,本發(fā)明所述的在小鼠IL-6基因座用人源IL-6基因取代小鼠IL-6基因的小鼠不易發(fā)展出這類淋巴瘤，且所述小鼠表現(xiàn)出明顯正常的B細(xì)胞種群。
[0102]據(jù)報(bào)道hIL-6轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6)的產(chǎn)生是由于6.6kb (BamHl-Pvu II片段)長的含有與IgM增強(qiáng)子相連的hIL-6基因的人源DNA的隨機(jī)插入(見Suematsu et al.(1989)IgGl plasmocytosis in interIeukin6transgenic mice.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:7547-7551)。所述小鼠在血清中表達(dá)的hIL_6在800pg/mL和20，000pg/mL之間，而野生型小鼠一般僅表達(dá)約100pg/mL的IL-6。所述小鼠隨著衰老表現(xiàn)出升高的血清免疫球蛋白(高出野生型小鼠120-400倍)和降低的白蛋白。所述小鼠患有大規(guī)模的漿細(xì)胞增生，表現(xiàn)出脾腫大和淋巴結(jié)腫大，以及骨髓中出現(xiàn)漿細(xì)胞和增多的巨核細(xì)胞。據(jù)檢測(cè)，疑似腫大的淋巴結(jié)實(shí)際上是大量致密異常性漿細(xì)胞。所述小鼠脾臟和胸腺都表現(xiàn)出漿細(xì)胞大量增生，并浸潤入部分肺、肝臟和腎臟。這些小鼠的腎臟也表現(xiàn)出IL-6刺激產(chǎn)生的系膜增生性腎小球腎炎中典型的系膜細(xì)胞增生。類似地，由小鼠H-2Ld啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的修整過的hIL-6cDNA被隨機(jī)地插入基因組而獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠(BALB/c)也表現(xiàn)出嚴(yán)重的漿細(xì)胞增生(見Suematsu etal.(1992) Generat1n of plasmacytomas with the chromosomal translocat1n t (12 ； 15)in interleukin6transgenic mice, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:232-235)。盡管過量表達(dá)hIL-6的C57BL/6小鼠不發(fā)展出移植性漿細(xì)胞瘤(所述小鼠具有漿細(xì)胞增生)，但是據(jù)報(bào)道回交成BALB/c小鼠的轉(zhuǎn)基因BL/6小鼠卻發(fā)展出了移植性漿細(xì)胞瘤。
[0103]據(jù)報(bào)道由神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hIL_6cDNA的隨機(jī)轉(zhuǎn)基因?qū)е铝诵∈笾袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中hIL-6的過量表達(dá)，這種隨機(jī)轉(zhuǎn)基因也引起了很多顯著的病理癥狀(見 Campbell et al.(1993)Neurologic disease induced in transgenic mice bycerebral overexpress1n of interleukin6，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:10061-10065)。這些小鼠具有在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)IL-6所引起的廣泛的神經(jīng)病理和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，這是由IL-6轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合到明顯是中樞神經(jīng)系統(tǒng)允許的轉(zhuǎn)錄基因座而導(dǎo)致的失控引起的。盡管將hIL-6cDNA連接到β球蛋白3’非翻譯區(qū)，用神經(jīng)元特異的烯醇酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并將所述hIL-6cDNA顯微注射進(jìn)小鼠受精卵(FlC57BL/6x BALB/c)中，所述hIL-6cDNA表達(dá)產(chǎn)生的小鼠擁有正常的壽命，也沒有由于僅在神經(jīng)元中而非其他地方表達(dá)hIL_6 而導(dǎo)致的明顯的神經(jīng)性缺陷(見 Fattor et al.(1994) IL_6Express1n in Neuronsof Transgenic Mice Causes Reactive Astrocytosis and Increase in Ramified MicroglialCells But No Neuronal Damage, Eur.J.Neuroscience7:2441-2449)，但是所述小鼠具有在整個(gè)大腦中伴隨增加的高水平的(高于野生型20到30倍)活化和增大的星形膠質(zhì)細(xì)胞，且白質(zhì)中的分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞增加了 10到15倍。因此，報(bào)道的腦部IL-6的表達(dá)引起的癥狀范圍從反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生到明顯且嚴(yán)重的(frank and profound)神經(jīng)病理。
[0104] 據(jù)報(bào)道將一段與β球蛋白3’非翻譯區(qū)和小鼠金屬硫蛋白(MT)-1啟動(dòng)子連接的639bp的hIL-6cDNA顯微注射進(jìn)入C57BL/6x"DBAII”的Fl雜交小鼠的受精卵中而獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠，所述小鼠由于hIL-6基因的隨機(jī)整合而呈虛弱狀和病態(tài)，且所述小鼠因腎衰竭而早死(見 Fattori et al.(1994) Blood, Development of Progressive Kidney Damage andMyeloma Kidney in Interleukin-6Transgenic Mice, Blood63 (9):2570-2579)。轉(zhuǎn)基因小鼠在12-20周死亡并表現(xiàn)出升高的漿細(xì)胞α I和β-球蛋白水平、高丙種球蛋白血癥、升高的脾(高出野生型3倍)和骨髓巨核細(xì)胞、以異常和致密排列的類漿細(xì)胞為特征的淋巴器官(脾、胸腺和淋巴結(jié))漿細(xì)胞增生癥以及導(dǎo)致類似多發(fā)性骨髓瘤的腎小球硬化癥的腎小球腎炎。
[0105]將H-2Ld驅(qū)動(dòng)的hIL-6cDNA顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中引起了小鼠IL-6依賴性的肌肉萎縮，其部分特征是與同等體重對(duì)照組相比的轉(zhuǎn)基因小鼠中腓腸肌重量顯著偏低，這種差異在用IL-6阻斷劑處理后有所改善(見Tsuiinaka et al.(1996)Interleukin6Receptor Antibody Inhibits Muscle Atrophy and Modulates ProteolyticSystem in Interleukin6Transgenic Mice, J.Clin.1nvest.97 (I):244-249)。這些小鼠在12周大時(shí)表現(xiàn)出血清hIL-6水平高于600000pg/mL。轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟重量約為1242mg，相比之下對(duì)照組肝臟約862mg。用IL-6阻斷劑處理的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟重量約888mg。轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉組織蛋白酶B和B+L顯著高于(20倍和6.2倍)對(duì)照組，而這種現(xiàn)象在用IL-6阻斷劑處理后的轉(zhuǎn)基因小鼠中消失了。組織蛋白酶B和L mRNA估計(jì)分別約為野生型小鼠的277%和257% ;所述差異在用IL-6拮抗劑處理后顯著降低。
[0106]包含由小鼠MHC I類H_2Ld啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hIL-6迷你基因和由雞β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hIL-6R迷你基因以及一個(gè)gpl30基因的小鼠具有hIL_6轉(zhuǎn)基因小鼠典型的病理癥狀(如高丙種球蛋白血癥、脾腫大、細(xì)胞增生性腎小球腎炎、肺部淋巴細(xì)胞浸潤)和心室肥厚(Hirota et al.(1995) Continuous activat1n of gpl30, asignal-transducing receptor component for interleukin6-related cytokines, causesmyocardial hypertrophy in mice, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:4862-4866)。心室肥大被認(rèn)為是由gpl30連續(xù)活化介導(dǎo)的(Id.)。據(jù)報(bào)道IL-6的作用是幫助加強(qiáng)細(xì)胞因子受體復(fù)合物并誘導(dǎo)gpl30的二聚化作用，其中g(shù)pl30是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-6信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組成成分(Panoessa et al.(1995)Two distinct and independent sites on IL_6triggergpl30dimer format1n and signaling, EMBO J.14(9):1942-1951)?；罨膹?fù)合物被認(rèn)為是六聚體，由兩個(gè)IL-6，每個(gè)IL-6聯(lián)結(jié)一個(gè)IL-6Ra和兩個(gè)gpl30(每個(gè)IL-6含有兩個(gè)獨(dú)立的gpl30聯(lián)結(jié) 位點(diǎn))而組成，形成2:2:2的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，其中g(shù)pl30的二聚化引起JAK-Tyk酪氨酸激酶的活化、gpl30和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)家族轉(zhuǎn)錄因子以及其他胞內(nèi)物質(zhì)的磷酸化(Id.；Stahl, N.(1994)Associat1n and Activat1nofJak-Tyk Kinases by CNTF-LIF-0SM-1L-6 β Receptor Component, Science263:92-95),所述過程與細(xì)胞因子受體復(fù)合物形成的通用模型一致(見Stahl, N.和Yancopoulos,G.(1993)The Alphas, Betas, and Kinases of Cytokine Receptor Complexes, Cell74:587-590 ；Davis et al.(1993) LIFRβ and gpl30as Heterodimerizing Signal Transducersof the Tripartite CNTF Receptor, Science260: 1805-1808 ；Murakami et al.(1993)IL-6-1nduced Homodimerizat1n of gpl30and Associated Activat1n ofa TyrosineKinase, Science260:1808-1810)。
[0107]據(jù)報(bào)道包含由大鼠磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧激酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人SIL-6R和由小鼠金屬硫蛋白-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人源IL-6的轉(zhuǎn)基因小鼠明顯小于只包含人源IL-6或只包含人 sIL_6R 的轉(zhuǎn)基因小鼠(Peters et al.(1997) Extramedullary Expans1n ofHematopoietic Progenitor Cells in Interleukin(IL_)-6_sIL_6R Double TransgenicMice, J.Exp.Med.185(4):755-766)，所述現(xiàn)象反映在減少的體脂肪和降低的體重(20_25g對(duì)40g)上。與報(bào)道的單轉(zhuǎn)基因小鼠正常器官重量相比，報(bào)道的雙轉(zhuǎn)基因小鼠還具有脾腫大(5倍)和肝腫大(2倍)，這明顯是源于脾和肝而非骨髓的造血細(xì)胞的髓外增殖，以及脾巨核細(xì)胞升高和漿細(xì)胞浸潤到所有實(shí)質(zhì)器官中(同上)。與單轉(zhuǎn)基因小鼠相比，雙轉(zhuǎn)基因小鼠在肝臟中還具有升高約200到約300倍的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、祖細(xì)胞和B細(xì)胞；相比之下，IL-6單轉(zhuǎn)基因小鼠具有少量的巨噬細(xì)胞(15倍)升高和B細(xì)胞(45倍)升高(同上)。這種不尋常的發(fā)現(xiàn)可能是由于激活gpl30信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致的對(duì)造血祖細(xì)胞生長和分化的刺激(同上)。
[0108]進(jìn)一步地，有報(bào)道雙轉(zhuǎn)基因小鼠(小鼠金屬硫蛋白-1驅(qū)動(dòng)的hIL-6/大鼠磷酸烯醇丙酮酸羧激酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人hIL-6R)具有的肝細(xì)胞增生與伴有持續(xù)性肝細(xì)胞增殖的人結(jié)節(jié)性再生性增生完全相同，強(qiáng)烈提示IL-6可能導(dǎo)致肝細(xì)胞增殖和致病性肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化的發(fā)生(Ma1ne et al.(1998) Coexpress1n of IL_6and soluble IL-6R causes nodularregenerative hyperplasia and adenomas ofthe liver, EMBO J.17 (19):5588-5597)。據(jù)報(bào)道由于在hIL-6單轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有觀察到肝細(xì)胞增生，且hIL-6可以與mIL-6R結(jié)合，因此這個(gè)發(fā)現(xiàn)看似矛盾，直到考慮到雙轉(zhuǎn)基因小鼠可能產(chǎn)生更高水平的復(fù)合物狀的hIL-6，對(duì)可溶性IL-6R(這里是可溶性hIL-6R)來說，所述復(fù)合物與單獨(dú)的IL-6相比是更有效的拮抗劑(同上)。
[0109]與人源IL-6轉(zhuǎn)基因小鼠相比，在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座存在保留有小鼠調(diào)控元件但卻包含IL-6編碼序列的人源化的取代的人源化IL-6小鼠，不具有已知小鼠的嚴(yán)重病理癥狀。雜合或純合的hIL-6基因修飾小鼠都非常正常。
[0110]對(duì)在實(shí)施例中所述的帶有人源化IL-6基因(MAID760)的小鼠進(jìn)行免疫分型檢測(cè)并在脾臟B細(xì)胞流式細(xì)胞分析(淋巴細(xì)胞門控)中通過使用泛B細(xì)胞標(biāo)記物(⑶445R(B220))發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞數(shù)量正常(圖4)。在脾臟中，野生型小鼠具有63%的B細(xì)胞；雜合hIL-6小鼠具有63 %的B細(xì)胞；內(nèi)源性小鼠基因座的純合hIL-6小鼠具有63 %的B細(xì)胞。用TNP-KLH免疫過的純合hIL-6小鼠中B細(xì)胞數(shù)量也正常(野生型小鼠有65%，hIL_6純合子小鼠有61% )。
[0111]脾臟T細(xì)胞數(shù)量也與野生型小鼠大致相同(圖5)。輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞的脾臟T細(xì)胞百分比為野生型20% /40% (比例為1.4:1);雜合hIL-6小鼠23%/14% (比例為1.6:1);純合hIL-6小鼠21% /15% (比例為1.4:1)(標(biāo)記物為CD8a_APC ；⑶4-FITC)。用TNP-KLH免疫過的純合hIL_6小鼠具有與野生型小鼠類似的脾臟T細(xì)胞數(shù)量，如輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞為22% /20% (比例為1.1:1)，相比之下野生型小鼠為21% /19% (比例也是1.1:1)。
[0112]在細(xì)胞流式分析(⑶IIb和DX5)中人源化IL-6小鼠也具有大約正常水平的脾臟自然殺傷細(xì)胞(圖7)。hIL-6雜合子具有2.2%的自然殺傷細(xì)胞，hIL-6純合子具有1.8%的自然殺傷細(xì)胞，而野生型小鼠具有2.4%的自然殺傷細(xì)胞。用TNP-KLH免疫過后，純合小鼠具有1.6%的脾臟自然殺傷細(xì)胞，而野生型小鼠具有2.1 %的脾臟自然殺傷細(xì)胞。
[0113]人源化IL-6小鼠也具有正常水平的脾Ly6G/C(Grl)細(xì)胞(圖6)。hIL_6雜合子具有7.0%的GRl+細(xì)胞(1.3% Grlhi);純合子具有6.8%的Grl+細(xì)胞(0.9% Grlhi)，而野生型小鼠具有8.0 %的Grl+細(xì)胞(1.8+Gr Ihi)。經(jīng)免疫的IL-6純合子(用TNP-KLH免疫)具有11%的Grl+細(xì)胞(4.0% Grlhi),而野生型小鼠具有10%的Grl+細(xì)胞(3.0% Grlhi)。
[0114]在流式細(xì)胞分析中人源化IL-6小鼠還具有正常的血液B細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)量(圖8和圖9)，使用泛B細(xì)胞標(biāo)記物(CD445R(B220))的流式細(xì)胞分析顯示了純合hIL_6小鼠具有52%的B細(xì)胞，相比之下野生型具有53% ;雜合小鼠具有38% (29%和47%的兩個(gè)不同染色的平均值)。用TNP-KLH免疫過的純合hIL-6小鼠也給出類似的B細(xì)胞數(shù)量(43%，相比之下野生型小鼠為45%)。
[0115]在使用⑶8a和⑶4染色檢測(cè)的細(xì)胞流式分析中人源化的IL_6小鼠具有正常的血液T細(xì)胞數(shù)量。雜合hIL-6小鼠具有的輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量為39% /26%(比例為1.5:1);純合hIL-6小鼠具有的輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量為24% /20%(比例為1.2:1)，而野生型小鼠具有的輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量為26% /20%(比例為1.3:1)。用TNP-KLH免疫的純合hIL-6小鼠的輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量為29% /21% (比例為1.4:1)，而野生型免疫小鼠的輔助性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量為28% /23% (比例為1.2:1)。
[0116]對(duì)未經(jīng)免疫和經(jīng)免疫的小鼠使用Ly6G/C(Grl)和⑶11b，以及⑶Ilb和DX5進(jìn)行血液染色的流式細(xì)胞分析測(cè)定人源化IL-6小鼠具有的血液骨髓細(xì)胞數(shù)量也與野生型小鼠類似(圖10、圖11和圖12)。雜合hIL-6小鼠具有的Gr+細(xì)胞百分比為10.8%，純合子為6.9%,而野生型小鼠為9.7%。經(jīng)免疫的hIL-6純合子具有的Ml (101-104的Ly6G/C (Gr)) /M2 (102-103的Ly6G/C (Gr)染色)數(shù)量為43%/34%，而野生型小鼠數(shù)量為45%/38%。經(jīng)免疫的純合hIL-6小鼠的CDllb(豎軸)對(duì)Ly6G/C(橫軸)的流式細(xì)胞圖表顯示在各象限細(xì)胞百分比(左上/右上/右下)為16% /8% /3%，與經(jīng)免疫的野生型小鼠象限數(shù)字相同。
[0117]純合的用TNP-KLH免疫過的人源化IL-6小鼠具有的⑶Ilb對(duì)DX5(自然殺傷細(xì)胞)染色的流式細(xì)胞圖表與經(jīng)免疫的野生型小鼠類似。血液流式細(xì)胞圖表象限分析(CDllb豎軸，DX5(自然殺傷細(xì)胞)橫軸)顯示左上/右上/右下數(shù)字為1111^-6純合子9.5(% /17%/10%，野生型小鼠 6.5% /17.3% /14%。 [0118]人源化小鼠具有的同型反應(yīng)與觀察的野生型小鼠基本相同。早期和末期IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgE和IgM水平與在野生型小鼠中觀察的大致相同。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，末期IgM在人源化小鼠中稍高；末期IgG3在人源化小鼠中也有所升高。
[0119]基于對(duì)骨髓IgM/⑶24/B220染色的流式細(xì)胞分析，在未經(jīng)免疫的hIL_6小鼠中B細(xì)胞發(fā)育與野生型小鼠中B細(xì)胞發(fā)育基本難以區(qū)別(圖13)。經(jīng)免疫的小鼠的免疫分型檢測(cè)顯示在B細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程中各種細(xì)胞類型的標(biāo)記物種群在hIL-6小鼠中基本正常。造血干細(xì)胞、共同淋巴祖細(xì)胞、祖B細(xì)胞、B前體細(xì)胞、未成熟和成熟B細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)程在hIL-6小鼠中都正常(圖14和圖15)。
實(shí)施例
[0120]實(shí)施例1:hIL_6基因取代內(nèi)源性小鼠IL-6基因
[0121]含有人源IL-6基因外顯子I到4的4.8kb的人源IL_6基因取代了鼠類IL_6基因的基因座上的6.8kb的片段。
[0122]在單一靶向步驟中的用人源IL-6的取代小鼠基因的靶向構(gòu)建體是通過使用VELOC丨GENE? 遺傳工程技術(shù)構(gòu)建的(見 Valenzuela et al.(2003)High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolut1n express1n analysis,Natrue B1tech，21 (6):652-659)。小鼠和人源IL-6DNA分別來自細(xì)菌人工染色體(BAC)RPC1-23克隆368C3，和BAC CTD克隆2369M23。簡言之，一個(gè)通過缺口修復(fù)克隆獲得的NotI線性化靶向構(gòu)建體通過電穿孔方法導(dǎo)入到F1H4小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞中(C57BL/6xl29Fl雜交)，所述構(gòu)建體含有小鼠IL-6上游和下游同源臂并在其兩翼之間連接有4.8kb的從外顯子I的ATG延伸到外顯子5并帶有3’端下游序列的16個(gè)核苷酸(基因組坐標(biāo):NCBIh37.1:ch7:22, 766，882到22，771，637)的人源IL-6序列和被1xP位點(diǎn)包圍的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)選擇標(biāo)記盒。正確靶向的ES細(xì)胞(MAID790)通過電穿孔方法進(jìn)一步導(dǎo)入一個(gè)瞬時(shí)Cre表達(dá)載體以移除藥物選擇標(biāo)記盒。通過VELOOMOUSE+i)方法將不
含藥物標(biāo)記盒的靶向的ES細(xì)胞克隆(MAID1428)導(dǎo)入進(jìn)8細(xì)胞期的小鼠胚胎(見美國專利號(hào) 7, 294, 754, 7, 576, 259, 7, 659, 442 和 Poueymirou et al.(2007)FOgenerat1n micethat are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowingimmediate phenotypic analyses, Nature B1tech.25(1):91-99)。帶有人源化 IL-6 基因的VELOOMICE?小鼠(H)小鼠整體源自供體ES細(xì)胞)是通過使用改進(jìn)的等位基因檢測(cè)方法對(duì)小鼠等位基因的丟失和人源等位基因的獲得進(jìn)行基因型檢測(cè)識(shí)別的。
[0123]正確靶向的ES細(xì)胞克隆通過天然等位基因的丟失(LONA)的檢測(cè)方法(Valenzuela et al.2003)得以被識(shí)別,在所述檢測(cè)方法中，對(duì)天然的未經(jīng)修飾的IL_6基因拷貝數(shù)的測(cè)定是通過用兩個(gè)特異性針對(duì)小鼠IL-6基因中被靶向敲除序列的TaqMan?定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCRs)來實(shí)現(xiàn)的。所述qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)包含下組引物探針(5’到3’書寫順序):上游正向引物，TTGCCGGTTT TCCCTTTTCT C (SEQ ID NO:1);上游反向引物，AGGGAAGGCCGTGGTTGTC (SEQ ID NO:2);上游探針，F(xiàn)AM-CCAGCATCAG TCCCAAGAAG GCAACT-BHQ (SEQ ID NO:3);下游正向引物，TCAGAGTGTG GGCGAACAAA G(SEQ ID NO:4);下游反向引物，GTGGCAAAAGCAGCCTTAGC(SEQ ID NO:5);下游探針，F(xiàn)AM-TCATTCCAGG CCCTTCTTAT TGCATCTG-BHQ(SEQIDNO:6);其中FAM代表5-羧基熒光素?zé)晒馓结?，BHQ代表黑洞淬滅劑類型的熒光淬滅劑(B1search Technologies)。從獲得祀向載體并整合進(jìn)該細(xì)胞基因組的ES細(xì)胞克隆中提純的DNA與TaqMan?Ge ne Express1n Master Mix探針法基因表達(dá)預(yù)混液(LifeTechnologies)依照生產(chǎn)商說明在一個(gè)384-孔PCR板(MicroAmpTM光學(xué)384-孔反應(yīng)板，Life Technologies)中混合并在一個(gè) Applied B1system Prism7900HT 序列檢測(cè)系統(tǒng)中循環(huán)反應(yīng)，所述系統(tǒng)在PCR過程中收集熒光數(shù)據(jù)并設(shè)定一個(gè)閾值循環(huán)(Ct)，其為累積的熒光達(dá)到預(yù)設(shè)閾值時(shí)經(jīng)歷的PCR循環(huán)數(shù)。每個(gè)DNA樣品都進(jìn)行上下游IL-6特異性qPCR和兩個(gè)非靶向的參考基因qPCR檢測(cè)。將每個(gè)IL-6特異性qPCR與每個(gè)參考基因qPCR之間Ct值的差值(ACt)進(jìn)行計(jì)算，然后將每個(gè)ACt與所有檢測(cè)樣品的中位數(shù)ACt之間的差值進(jìn)行計(jì)算得到每個(gè)樣品的△ ACt值。每個(gè)樣品的IL-6基因拷貝數(shù)通過以下公式計(jì)算:拷貝數(shù)=2.丟失了一個(gè)天然拷貝的正確靶向的克隆的IL-6基因拷貝數(shù)將等于I。在人源化等位基因上人源IL-6基因序列對(duì)敲除的小鼠IL-6基因序列取代的確定是通過TaqMan?qPCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)完成的，所述檢測(cè)實(shí)驗(yàn)包含以下引物探針(5’到3’書寫順序):人正向引物，CCCCACTCCACTGGAATTTG(SEQ ID NO:7);人反向引物，GTTCAACCACAGCCAGGAAAG(SEQID NO:8);人源探針，F(xiàn)AM-AGCTACAACTCATTGGCATCCTGGCAA-BHQ(SEQ ID NO:9)。
[0124]同樣的LONA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)還用于檢測(cè)來自靶向的ES細(xì)胞生成的小鼠的鼠尾活組織提純的DNA以確定其IL-6基因型并確認(rèn)人源化IL-6等位基因已被傳遞進(jìn)所述品系中。將兩個(gè)帶有雜合取代基因的幼鼠交配以獲得由人源IL-6基因取代內(nèi)源性小鼠IL-6基因的純合小鼠。帶有純合取代基因的幼鼠被用來進(jìn)行表型檢測(cè)。
[0125]所述鼠類基因座的上游接頭和含有hIL-6基因的序列被設(shè)計(jì)在以下序列之內(nèi):5’ -AATTAGAGAG TTGACTCCTA ATAAATATGA GACTGGGGAT GTCTGTAGCT CATTCTGCTC TGGAGCCCACCAAGAACGAT AGTCAATTCC AGAAACCGCT ATGAACTCCT TCTCCACAAG TAAGTGCAGG AAATCCTTAGCCCTGGAACT GCCAGCGGCG GTCGAGCCCT GTGTGAGGGA GGGGTGTGTG GCCCAGG (SEQ ID NO:10)，其中在所述人源基因第一個(gè)核苷酸之前的最后一個(gè)小鼠核苷酸是CCGCT中的”T”，人源序列第一個(gè)核苷酸是ATGAA中的第一個(gè)”A”。含有hIL-6基因和鼠類基因座序列的下游接頭被設(shè)計(jì)在以下序列之內(nèi):5’ -TTTTAAAGAA ATATTTATAT TGTATTTATA TAATGTATAA ATGGTTTTTATACCAATAAA TGGCATTTTA AAAAATTCAG CAACTTTGAG TGTGTCACGC TCCCGGGCTC GATAACTATAACGGTCCTAA GGTAGCGACT CGAGATAACT T-3’ ( SEQ ID NO: 11)，其中所述人源序列最后一個(gè)核苷酸是TCACG中的”G”，小鼠序列的第一個(gè)核苷酸是CTCCC中的第一個(gè)”C” ;下游接頭在3’末端還含有1xP位點(diǎn)(已顯示所述3’末端起始序列)以用來敲除被所述1xP位點(diǎn)包圍的泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)標(biāo)記盒。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)標(biāo)記盒與小鼠IL-6基因座接頭被設(shè)計(jì)在以下序列之內(nèi):5’ -TATACGAAGT TATCCTAGGT TGGAGCTCCTAAGTTACATC CAAACATCCT CCCCCAAATC AATAATTAAG CACTTTTTAT GACATGTAAA GTTAAATAAGAAGTGAAAGC TGCAGATGGT GAGTGAGA (SEQ ID NO:12)，AGCTC 中的最后一個(gè)” C” 是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)標(biāo)記盒的最后一個(gè)核苷酸；在所述標(biāo)記盒之后的小鼠基因組第一個(gè)核苷酸是CTAAG中的起始” C”。
[0126]實(shí)施例2:未經(jīng)免疫和經(jīng)免疫的hIL-6小鼠的免疫分型檢測(cè):B細(xì)胞
[0127]針對(duì)hIL-6基因取代為純合的小鼠進(jìn)行B細(xì)胞(DC445R(B220))分析。將來自未經(jīng)免疫和經(jīng)免疫(TNP-KLH)的hIL-6小鼠脾細(xì)胞制備液中的淋巴細(xì)胞門控組分染色并通過流式細(xì)胞檢測(cè)免疫分型。流式細(xì)胞分析表明通過CD45R(B220)-FITC染色檢測(cè)的脾細(xì)胞制備液中的B細(xì)胞百分比與在未經(jīng)免疫的野生型、hIL-6雜合和hIL-6純合小鼠制備液中大致相同(細(xì)胞數(shù)量的63%)。對(duì)于經(jīng)免疫的小鼠，B細(xì)胞約達(dá)到野生型小鼠脾細(xì)胞制備液的細(xì)胞總量的65%、以及達(dá)到hIL-6純合子中細(xì)胞總量的61%。hIL-6小鼠脾臟(包括未經(jīng)免疫和經(jīng)免疫的)含有的B細(xì)胞群體數(shù)量與野生型小鼠脾臟B細(xì)胞群體數(shù)量大致相同。
[0128]使用B細(xì)胞標(biāo)記物(CD45R (B220) -APC、CD24 (HSA) -PE或CD43共軛結(jié)合到染料和/或IgM(IgM-FITC)上)對(duì)野生型、hIL-6雜合和hIL_6純合小鼠的骨髓染色。正常小鼠骨髓中B細(xì)胞的發(fā)育隨著細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程會(huì)反映在表面標(biāo)記物上，細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程從干細(xì)胞到早期祖B細(xì)胞到晚期祖B細(xì)胞，從大的B前體細(xì)胞到小的B前體細(xì)胞到未成熟B細(xì)胞直到最后的成熟B細(xì)胞。共同淋巴細(xì)胞祖原B細(xì)胞會(huì)表達(dá)CD45R，在后期階段的未成熟和之后成熟B細(xì)胞階段會(huì)表達(dá)IgM。因此，⑶45R染色和抗IgM染色的B細(xì)胞應(yīng)所述反映出B細(xì)胞發(fā)育特征性的模式。hIL-6雜合子和hIL-6純合子的骨髓的⑶45R(B220)-APC和抗IgM-FITC染色的模式與野生型小鼠骨髓的基本無法區(qū)分，顯示出了對(duì)CD45R(B220)和IgM染色，或?qū)为?dú)的⑶45R(B220)染色呈陽性的B細(xì)胞群體。流式細(xì)胞染色顯示的hIL_6小鼠骨髓中B細(xì)胞亞群與野生型小鼠中的類似(表1 ;也見圖13)。
[0129]
【權(quán)利要求】
1.一種基因修飾的小鼠，所述小鼠包含在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座用編碼人源IL-6的人源基因取代編碼IL-6的小鼠基因，其中所述編碼人源IL-6的人源基因受內(nèi)源性小鼠IL-6基因座的內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件的調(diào)控。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾的小鼠，其中所述編碼人源IL-6的人源基因是BACID CTD-2369M23中的人源IL-6基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾的小鼠，其中所述小鼠表達(dá)小鼠IL-6Ra。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾的小鼠，其中所述小鼠表達(dá)人源化IL-6Ra。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾的小鼠，其中所述小鼠表達(dá)人源化IL-6Ra。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因修飾的小鼠，其中所述小鼠不具有選自以下組的特征之一:漿細(xì)胞增生、腎小球硬化癥、腎小球腎炎、腎衰竭、高丙種球蛋白血癥、脾巨核細(xì)胞升高、骨髓巨核細(xì)胞升高、脾腫大、淋巴結(jié)腫大、致密異常性漿細(xì)胞以及這些特征的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因修飾的小鼠，其中所述人源化的IL-6Ra包含人源胞外域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因修飾的小鼠，其中所述人源化的IL-6Ra包含小鼠跨膜域和小鼠胞質(zhì)域。
9.一種基因修 飾的小鼠，所述小鼠包含內(nèi)源性小鼠IL-6Ra基因的人源化，其中所述人源化包含在內(nèi)源性小鼠IL-6Rci基因座用人源IL-6Rci胞外域編碼序列取代小鼠IL-6R α胞外域編碼序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因修飾的小鼠，其中用編碼人源IL-6Ra胞外域的人源IL-6Ra序列的連續(xù)基因組片段取代包含小鼠外顯子I到8的連續(xù)小鼠序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的基因修飾的小鼠，其中所述編碼胞外域的人源IL-6Ra序列的連續(xù)基因組片段來自BAC CTD-2192J23。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因修飾的小鼠，進(jìn)一步包含人源化的IL-6基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的基因修飾的小鼠，其中所述小鼠包含在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座用人源IL-6基因取代小鼠IL-6基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的基因修飾的小鼠，其中所述人源化的IL-6基因受內(nèi)源性小鼠調(diào)控元件的調(diào)控。
15.一種建立人源化小鼠的方法，所述方法包含用編碼人源IL-6的人源基因取代編碼小鼠IL-6的小鼠基因序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述取代發(fā)生在內(nèi)源性小鼠IL-6基因座，并且編碼人源IL-6的人源基因與內(nèi)源性小鼠調(diào)控序列可操作的連接。
17.一種建立人源化小鼠的方法，所述方法包含用編碼人源IL-6Ra胞外域序列的人源基因組片段取代編碼小鼠IL-6Ra胞外域序列的小鼠外顯子，以形成人源化的IL-6Ra基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述取代發(fā)生在內(nèi)源性小鼠IL-6Ra基因座，且人源化的IL-6Ra基因與內(nèi)源性小鼠調(diào)控序列可操作的連接。
19.一種包含人源化IL-6Ra基因的基因修飾的小鼠，其特征在于所述小鼠包含用人源胞外域編碼序列取代小鼠胞外域編碼序列，其中所述人源化的IL-6Ra基因包含小鼠跨膜序列和小鼠胞質(zhì)序列；其中所述小鼠進(jìn)一步包含編碼人源IL-6的基因，其中所述編碼人源IL-6的基因受內(nèi)源性小鼠IL-6調(diào)控元件的調(diào)控。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的基因修飾的小鼠，其中所述小鼠無法表達(dá)完整的小鼠IL-6Ra，且無法表 達(dá)小鼠IL-6。
【文檔編號(hào)】C07K14/715GK104039821SQ201280065013
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】L·王, A·T·多雷二世, S·史蒂文斯, A·J·莫菲 申請(qǐng)人:瑞澤恩制藥公司