絮凝方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)流體中收獲重組蛋白的方法。所述方法利用陽(yáng)離子型聚合物、非離子型聚合物以及非離子型表面活性劑。
【專利說明】絮凝方法
[0001] 本申請(qǐng)要求2011年12月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/576, 303的權(quán)益，該美 國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種用于從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯中收獲重組蛋白的方法。所述方法 利用陽(yáng)離子型聚合物、非離子型聚合物以及非離子型表面活性劑。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 臨床制造治療性蛋白質(zhì)是一項(xiàng)成本高的大規(guī)模的嘗試。對(duì)更大量的治療性重組蛋 白的需求已驅(qū)使在產(chǎn)生顯著提高的產(chǎn)物滴度的細(xì)胞培養(yǎng)物處理方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。高 滴度細(xì)胞培養(yǎng)過程典型地是通過在更長(zhǎng)的培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間內(nèi)維持高的活細(xì)胞密度而產(chǎn)生的。 同樣還會(huì)觀測(cè)到生物質(zhì)固體（活細(xì)胞和非活細(xì)胞）以及亞微米細(xì)胞碎片顆粒相應(yīng)增多。固 體和亞微米細(xì)胞碎片顆粒的更高負(fù)荷可能對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法提出挑戰(zhàn)，會(huì)使 得收獲方法在不使產(chǎn)物產(chǎn)量大幅損失的情況下去除碎片方面的有效性較低。
[0005] 陽(yáng)離子型聚合物絮凝劑被用于以下范圍內(nèi)的多種應(yīng)用：飲用水純化、廢水處理、在 石油、采礦以及造紙行業(yè)中使用、化妝品和醫(yī)療用途，并且還已經(jīng)被用于封裝哺乳動(dòng)物細(xì)胞 和酶以及用于使微生物細(xì)胞培養(yǎng)物絮凝。然而，對(duì)于在商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞收獲方法 中使用來說，漫長(zhǎng)的絮凝沉降時(shí)間可能成問題，會(huì)使得收獲方法耗時(shí)并且與標(biāo)準(zhǔn)收獲操作 規(guī)程相比效率更低。
[0006] 持續(xù)需要對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，特別是商業(yè)規(guī)模的方法進(jìn)行改進(jìn)。任 何使得回收時(shí)間更快和/或回收率更大的改進(jìn)都可以使得與制造蛋白質(zhì)治療劑相關(guān)的成 本降低。本發(fā)明通過提供一種快速并且高效的細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法來滿足這一需要。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括將表達(dá)重組蛋白 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞 壓積為止，將陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中以引發(fā)絮凝，在絮凝 期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮凝體沉降，以及回收澄清了的上清液。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括將表達(dá)重組蛋 白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的細(xì)胞密度和/或細(xì) 胞壓積為止，將聚二烯丙基二甲基氯化銨和PEG 3, 000添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中以引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮凝體沉降，以及回收澄清了的上清液。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括
[0011] 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所 需的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止，將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3, 000以及Triton X-100(曲通X-100)添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中以引發(fā)絮凝，在絮凝期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮 凝體沉降，以及回收澄清了的上清液。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括
[0013] 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所 需的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止，將陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物添加至細(xì)胞培養(yǎng) 基中以引發(fā)絮凝，在絮凝期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降，回收初級(jí) 澄清了的上清液，對(duì)初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌，使得經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行二次 沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括
[0015] 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所 需的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止，將陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物添加至細(xì)胞培養(yǎng) 基中以引發(fā)絮凝，在絮凝期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降，回收初級(jí) 澄清了的上清液，如果在初級(jí)澄清了的上清液中的產(chǎn)物回收率小于80%，則對(duì)初級(jí)沉降的 絮凝體進(jìn)行洗滌，使得經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行二次沉降，以及回收二次澄清了的上 清液。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括
[0017] 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所 需的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止，將聚二烯丙基二甲基氯化銨和PEG 3, 000添加至細(xì)胞 培養(yǎng)基中以引發(fā)絮凝，在絮凝期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降，回收 初級(jí)澄清了的上清液，對(duì)初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌，使得經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行 二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括
[0019] 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所 需的細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止，將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3, 000以及Triton X-100添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中以引發(fā)絮凝，在絮凝期間混合細(xì)胞培養(yǎng)基，使得絮凝體沉降以進(jìn) 行初級(jí)沉降，回收初級(jí)澄清了的上清液，對(duì)初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌，使得經(jīng)過洗滌的絮 凝體沉降以進(jìn)行二次沉降，以及回收二次澄清了的上清液。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施方案中，陽(yáng)離子型聚合物是聚二烯丙基二甲基氯化銨。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，非離子型聚合物選自聚乙二醇和葡聚糖。
[0022] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，非離子型聚合物選自PEG 3, 000和PEG 6, 000。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，上文提供的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法進(jìn)一步包括將非 離子型表面活性劑添加至細(xì)胞培養(yǎng)基中。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，所述非離子型表面活 性劑是 Triton X-100。
[0024] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)添加陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物。
[0025] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)添加陽(yáng)離子型聚合物、非離子型聚合物以及非離子型 表面活性劑。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先添加陽(yáng)離子型聚合物并且混合至少30秒，繼而添加非 離子型聚合物。
[0027] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，首先添加陽(yáng)離子型聚合物并且混合至少30秒，繼而添加非 離子型聚合物和非離子型表面活性劑。
[0028] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，陽(yáng)離子型聚合物是二烯丙基二甲基氯化銨的聚合物、聚二 烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺或殼聚糖。
[0029] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，非離子型表面活性劑是Sapoin或Triton X100。
[0030] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，以等于或約20皮克/總細(xì)胞密度至等于或約90皮克/總 細(xì)胞密度的濃度添加聚二烯丙基二甲基氯化銨。
[0031] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，以等于或約25皮克/總細(xì)胞密度的濃度添加聚二烯丙基二 甲基氯化銨，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源于二倍體細(xì)胞系。
[0032] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，添加介于43皮克/總細(xì)胞密度與57皮克/總細(xì)胞密度之 間的聚二烯丙基二甲基氯化銨，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源于四倍體細(xì)胞系。
[0033] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG 3, 000的濃度是等于或約3%至等于或約4. 5%。
[0034] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，PEG 6, 000的濃度是等于或約2. 5%至等于或約3. 5%。
[0035] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，Triton X100的濃度是0· 05% (w/v)。
[0036] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯在36°C與20°C之間。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯處于或高于20°C。
[0038] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在9%蔗糖溶液中對(duì)來自初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌。
[0039] 附圖簡(jiǎn)述
[0040] 圖1提供了 PDADMAC的結(jié)構(gòu)。
[0041] 圖2A示出了由具有不同分子量的PDADMAC所實(shí)現(xiàn)的沉降時(shí)間的差異。具有 每一種分子量的PDADMAC的濃度均是57皮克/總細(xì)胞密度。實(shí)心的菱形/虛線表示 100, 000-200, 000的PDADMAC分子量。實(shí)心的正方形和虛線表示200, 000-300, 000的 PDADMAC分子量。實(shí)心的三角形和實(shí)線表示400, 000-500, 000的PDADMAC分子量。
[0042] 圖2B示出了當(dāng)使用具有不同的分子量的PDADMAC使細(xì)胞培養(yǎng)肉湯絮凝時(shí)所 實(shí)現(xiàn)的上清液澄明度。從左至右，各柱形圖表示以下的PDADMAC分子量：〈100, 000 ; 100, 000-200, 000 ;200, 000-350, 000 ;以及 400, 000-500, 000。
[0043] 圖3A示出了高分子量PDADMAC的濃度對(duì)15-20 μ m細(xì)胞的絮凝的影響。實(shí)心的菱 形/虛線表示11皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。實(shí)心的正方形和虛線表示18皮克/總細(xì) 胞密度的PDADMAC。實(shí)心的三角形和實(shí)線表示25皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。實(shí)心的圓 形和虛線表示39皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。
[0044] 圖3B示出了高分子量PDADMAC的濃度對(duì)21-24 μ m細(xì)胞的絮凝的影響。實(shí)心的菱 形/虛線表示29皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。實(shí)心的正方形和虛線表示43皮克/總細(xì) 胞密度的PDADMAC。實(shí)心的三角形和虛線表示57皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。實(shí)心的圓 形和實(shí)線表示71皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。實(shí)心的正方形和點(diǎn)線表示86皮克/總細(xì) 胞密度的H)ADMAC。
[0045] 圖4A示出了高分子量PDADMAC絮凝作用對(duì)產(chǎn)生高乳酸鹽水平的細(xì)胞培養(yǎng)物的影 響。實(shí)心菱形和實(shí)線表示未添加乳酸鹽。實(shí)心的正方形和虛線表示換入有3g/L的乳酸鹽。 實(shí)心的三角形和虛線表示換入有6g/L的乳酸鹽。實(shí)心的圓形和虛線表示換入有9g/L的乳 酸鹽。
[0046] 圖4B示出了高分子量PDADMAC絮凝作用對(duì)具有如通過細(xì)胞壓積（PCV)所測(cè)量的 高細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)物的影響。實(shí)心的菱形和虛線表示44%的PCV。實(shí)心的三角形和虛 線表示33%的PCV。實(shí)心的正方形和虛線表示22%的PCV。實(shí)心的圓形和實(shí)線表示11 %的 PCV。
[0047] 圖5示出了各種稀釋劑對(duì)于用于具有高乳酸鹽水平的細(xì)胞培養(yǎng)過程的高分子量 PDADMAC絮凝作用的影響。實(shí)心的三角形和虛線表示蔗糖。實(shí)心的正方形和虛線表示不含 稀釋劑的細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)心的菱形和虛線表示甜菜堿。實(shí)心的圓形和虛線表示PEG 1，000。 實(shí)心的三角形和實(shí)線表示PEG 6, 000。實(shí)心的三角形和虛線表示葡聚糖70和甜菜堿。
[0048] 圖6示出了 PDADMAC/PEG絮凝作用對(duì)具有43. 2%的PCV的細(xì)胞培養(yǎng)物的影響。實(shí) 心的菱形和虛線表示單獨(dú)PDADMAC。實(shí)心的正方形和虛線表示蔗糖。實(shí)心的三角形和實(shí)線 表示 PDADMAC/PEG。
[0049] 圖7示出了 PDADMAC和PEG的添加順序的影響。一次性（bolus)添加 PDADMAC和 PEG (單步法）由實(shí)心三角形和虛線示出。先添加 PDADMAC，繼而添加 PEG (兩步法）由實(shí)心 正方形和虛線示出。單獨(dú)PDADMAC由實(shí)心的菱形和實(shí)線示出。
[0050] 圖8示出了添加 Triton X-100的影響。添加 PDADMAC/PEG由實(shí)心的正方形和實(shí) 線示出。添加 PDADMAC/PEG/Trition X-100由實(shí)心的三角形和虛線示出。
[0051] 發(fā)明詳述
[0052] 本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單的收獲絮凝技術(shù)，所述技術(shù)旨在使得高細(xì)胞量的細(xì)胞培養(yǎng) 過程的回收操作達(dá)到最大限度。提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法在使 細(xì)胞培養(yǎng)肉湯絮凝時(shí)將陽(yáng)離子型聚合物與非離子型聚合物組合使用。還提供了將陽(yáng)離子型 聚合物與非離子型聚合物和非離子型表面活性劑這兩者組合使用。
[0053] 本發(fā)明是基于以下的發(fā)現(xiàn)：將非離子型聚合物或非離子型聚合物和非離子型表面 活性劑與陽(yáng)離子型聚合物組合用于使哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯絮凝會(huì)使得絮凝體沉降時(shí)間 從24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間縮短至不到1小時(shí)，在一些情況下，縮短至15分鐘，而與細(xì)胞培養(yǎng)過 程的密度（高達(dá)44%的細(xì)胞壓積）或乳酸鹽水平（10g/L)無關(guān)。使用非離子型聚合物還能 夠?qū)⑴c所需的重組產(chǎn)物共同純化的高級(jí)聚集體和宿主細(xì)胞蛋白去除。這種簡(jiǎn)單的收獲方法 使得細(xì)胞培養(yǎng)過程，特別是高細(xì)胞量的細(xì)胞培養(yǎng)商業(yè)水平過程的回收操作達(dá)到最大限度。
[0054] 絮凝是使懸浮液中的顆粒形成更大尺寸的聚集體或簇集體的過程。在絮凝中，通 過添加絮凝劑（flocculation agent/flocculent)使顆粒以絮狀物形式從懸浮液中離開。 絮凝劑可以是陰離子型聚合物或陽(yáng)離子型聚合物。存在天然絮凝劑，如藻酸鹽或殼聚糖；礦 物絮凝劑，如膠態(tài)粘土和活性二氧化硅；以及合成絮凝劑，如聚丙烯酰胺和聚二烯丙基二甲 基氯化銨。合成絮凝劑可以被制造成具有特定的分子量（基于鏈長(zhǎng)）和分子分布。
[0055] 陽(yáng)離子型聚合物與諸如有機(jī)物質(zhì)之類的帶負(fù)電荷的顆粒相互作用。在細(xì)胞培養(yǎng) 肉湯中，陽(yáng)離子型聚合物與諸如活細(xì)胞和非活細(xì)胞、細(xì)胞代謝物以及細(xì)胞碎片（如核酸、 蛋白以及脂質(zhì)體）之類的帶負(fù)電荷的顆粒相互作用。使用陽(yáng)離子型聚合物使細(xì)胞培養(yǎng)肉 湯中存在的帶負(fù)電荷的化合物絮凝是經(jīng)由以下方式發(fā)生離子相互作用而進(jìn)行的：帶負(fù)電 荷的顆粒的架橋；陽(yáng)離子型聚合物的補(bǔ)綴結(jié)合（patch binding)，從而引起絮凝；或?qū)^ 大的帶負(fù)電荷的顆粒的電荷中和，從而使得所中和的顆粒從溶液中沉降出。通過陽(yáng)離子 型聚合物對(duì)帶負(fù)電荷的顆粒的架橋作用所形成的絮狀物產(chǎn)生更大的絮狀物并且具有增加 的剪切敏感性，從而引起絮狀物破壞，進(jìn)而產(chǎn)生更高水平的更緩慢沉降的更小顆粒。在補(bǔ) 綴或電荷中和的情況下，具有高電荷密度的陽(yáng)離子型聚合物與懸浮液中的顆粒上的陰離 子補(bǔ)綴物相互作用，并且中和顆粒上的電荷或形成更大顆粒而從溶液中沉降出。以這種 方式形成的絮狀物具有更小的絮狀物顆粒體積并且更不易于由于剪切而被破壞。舉例 來說，將聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDADMAC)添加至細(xì)胞培養(yǎng)肉湯中會(huì)經(jīng)由靜電補(bǔ)綴機(jī) 制使帶負(fù)電荷的細(xì)胞和細(xì)胞碎片絮凝成更大的顆粒（Ramsden等（1998)，Biotechnology Techniques, 12(8) :599-603) oPDADMAC還使帶負(fù)電荷的亞微米顆粒絮凝以產(chǎn)生與典型的以 離心方式收獲的進(jìn)料流相比具有顯著更高的收獲過濾器組通量的進(jìn)料流。經(jīng)由離子相互作 用所實(shí)現(xiàn)的絮凝作用可以通過提高鹽濃度或改變pH值而被破壞。
[0056] 將諸如聚二烯丙基二甲基氯化銨之類的陽(yáng)離子型聚合物添加至含有或已經(jīng)含有 表達(dá)重組蛋白的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中會(huì)使得包括細(xì)胞（活細(xì)胞和非活細(xì)胞）、細(xì) 胞代謝物以及細(xì)胞碎片在內(nèi)的帶負(fù)電荷的顆粒絮凝?？梢酝ㄟ^離心或通過重力沉降將這些 大的絮凝顆粒去除。絮凝的細(xì)胞和細(xì)胞碎片沉降出所需的沉降速率或時(shí)間取決于細(xì)胞、細(xì) 胞碎片以及細(xì)胞代謝物的密度。在對(duì)于分批式細(xì)胞培養(yǎng)過程典型的低細(xì)胞密度下，絮凝的 物質(zhì)典型地在4小時(shí)至24小時(shí)，典型地約20-24小時(shí)內(nèi)的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)沉降出（無進(jìn)一步 沉降）。沉降速率在產(chǎn)生高生物質(zhì)細(xì)胞密度（>10%的細(xì)胞壓積）、亞微米細(xì)胞碎片和/或 高乳酸鹽水平（>2_3g/L)的細(xì)胞培養(yǎng)過程的情況下顯著降低。產(chǎn)生高細(xì)胞密度或具有升高 的乳酸鹽水平的細(xì)胞培養(yǎng)過程需要顯著量的細(xì)胞肉湯稀釋以使得絮狀物在24小時(shí)內(nèi)沉降 出。雖然使用諸如PDADMAC之類的陽(yáng)離子型聚合物作為傳統(tǒng)收獲方法的替代方案是非常方 便的，但是長(zhǎng)時(shí)間的沉降時(shí)間可能對(duì)于商業(yè)規(guī)模來說不太合乎需要。
[0057] 本發(fā)明提供了經(jīng)過陽(yáng)離子型聚合物絮凝的物質(zhì)的絮凝顆粒尺寸以及顆粒尺寸 的增長(zhǎng)率在非離子型聚合物和非離子型表面活性劑的存在下會(huì)得到極大地提高。在將 PDADMAC與非離子型聚合物（如聚乙二醇）和非離子型表面活性劑（如Triton X100)組合 使用時(shí)，通常觀測(cè)到少于2小時(shí)的絮狀物重力沉降時(shí)間，盡管高生物質(zhì)/細(xì)胞密度會(huì)顯著地 延長(zhǎng)單獨(dú)PDADMAC絮凝的沉降時(shí)間。在添加非離子型聚合物和非離子型表面活性劑的情況 下能夠耐受可能破壞絮狀物和/或降低絮凝速率的剪切力。在使得宿主DNA顯著減少的情 況下始終如一地實(shí)現(xiàn)80% -90%或更大的收獲物回收產(chǎn)率。添加非離子型聚合物還會(huì)減少 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和一些高分子量物質(zhì)。
[0058] 如本文所用的"陽(yáng)離子型聚合物"是與帶負(fù)電荷的懸浮顆粒結(jié)合的帶正電荷的聚 合物。陽(yáng)離子型聚合物包括但不限于二烯丙基二甲基氯化銨（DADMAC)的聚合物。在一個(gè) 優(yōu)選的實(shí)施方案中，使DADMAC聚合形成N-取代的吡咯烷結(jié)構(gòu)，S卩PDADMAC(圖1)。陽(yáng)離子 型聚合物還包括聚乙烯亞胺（PEI)、聚丙烯酰胺（PAA)以及殼聚糖。
[0059] 等于或約20皮克至等于或約90皮克的PDADMAC/總細(xì)胞密度的濃度會(huì)產(chǎn)生低的 上清液濁度和良好的絮狀物沉降作用。"總細(xì)胞密度"是如通過臺(tái)盼藍(lán)拒染（Trypan Blue exclusion)，使用Cedex細(xì)胞計(jì)數(shù)器和分析器所測(cè)量的活細(xì)胞加上非活細(xì)胞的總數(shù)。在用 于小細(xì)胞系（如二倍體細(xì)胞系）的一個(gè)實(shí)施方案中，添加等于或約25皮克/總細(xì)胞密度的 PDADMAC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于更大的細(xì)胞系，如四倍體細(xì)胞系，添加等于或約43皮 克/總細(xì)胞密度至等于或約57皮克/總細(xì)胞密度的PDADMAC。
[0060] 與更低分子量形式相比，分子量為200, 000-500, 000的PDADMAC通過提高沉降速 率和上清液澄明度來影響絮凝性能。在一個(gè)實(shí)施方案中，PDADMAC的分子量在400, 000至 500, 000的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，以22皮克/總細(xì)胞密度的最終濃度使用具有在 400, 000-500, 000范圍內(nèi)的分子量的PDADMAC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以25皮克/總細(xì)胞 密度的最終濃度使用具有在400, 000-500, 000范圍內(nèi)的分子量的PDADMAC。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，以45皮克/總細(xì)胞密度的最終濃度使用具有在400, 000-500, 000范圍內(nèi)的分子量 的 roADMAC。
[0061] 如本文所用的"沉降速率"、"重力沉降速率"以及"絮凝并且壓緊的沉降速率"可 互換使用。沉降速率可以通過本領(lǐng)域已知的以及本文所述的方法來測(cè)定。舉例來說，在lg 下進(jìn)行重力沉降。通過將絮狀物體積除以在0. 5L或1L玻璃量筒中所測(cè)量的總體積來確定 沉降速率?？傮w積是包括所有絮凝劑/沉降劑在內(nèi)的細(xì)胞肉湯體積。
[0062] "沉降時(shí)間"是絮狀物沉降所要花費(fèi)的時(shí)間。在絮狀物的沉降速率小于或等于每小 時(shí)1 %時(shí)實(shí)現(xiàn)沉降時(shí)間。本文描述了在將PDADMAC絮凝與給予非離子型聚合物或非離子型 聚合物連同非離子型表面活性劑組合的情況下沉降時(shí)間短達(dá)15分鐘。沉降時(shí)間快速，盡管 高生物質(zhì)/細(xì)胞密度會(huì)顯著地延長(zhǎng)單獨(dú)PDADMAC絮凝的沉降時(shí)間。在添加非離子型聚合物 或非離子型表面活性劑的情況下能夠耐受會(huì)破壞絮狀物和/或降低絮凝速率的剪切力。 [0063] 上清液澄明度與沉降速率無關(guān)，但是取決于陽(yáng)離子型聚合物的給予水平。諸如溫 度、細(xì)胞培養(yǎng)流體密度以及粘度之類的其它因素對(duì)沉降速率或上清液澄明度的影響非常 小。PDADMAC的給予量尤其是隨細(xì)胞體積、總細(xì)胞（活細(xì)胞和非活細(xì)胞）密度以及亞微米細(xì) 胞碎片顆粒的濃度而變的。
[0064] 如本文所用的"非離子型聚合物"指的是增強(qiáng)分子之間的相互作用，從而增強(qiáng)沉淀 作用的親水性聚合物。非離子型聚合物包括但不限于聚乙二醇（PEG)、麥芽糖糊精、淀粉、甲 基纖維素以及葡聚糖。
[0065] 在添加陽(yáng)離子型聚合物絮凝劑同時(shí)或之后將PEG或葡聚糖添加至哺乳動(dòng)物細(xì)胞 培養(yǎng)基中時(shí)會(huì)使得沉降速率有所提高。產(chǎn)物回收率取決于非離子型聚合物濃度、PEG分子 量、非離子型聚合物和PDADMAC的添加順序（同時(shí)添加或首先添加 PDADMAC，繼而添加非離 子型聚合物）以及細(xì)胞培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間或細(xì)胞培養(yǎng)肉湯中的碎片水平。
[0066] 可使用在等于或約3 %至等于或約4. 5 % (w/v)范圍內(nèi)的PEG 3, 000?？墒褂迷诘?于或約2. 5%至等于或約3.5% (w/v)范圍內(nèi)的PEG 6, 000。在一個(gè)實(shí)施方案中，以3% (w/ v)的最終濃度使用PEG 3, 000。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以15% (w/v)的最終濃度使用PEG 3, 000。在另一個(gè)實(shí)施方案中，以25% (w/v)的最終濃度使用PEG 3, 000。
[0067] 如本文所用的"非離子型表面活性劑"指的是具有兩親性的有機(jī)化合物，意指它們 含有疏水性基團(tuán)和親水性基團(tuán)，并且包括但不限于Sapoin和Triton X100。在一個(gè)實(shí)施方 案中，以0· 05% (w/v)的最終濃度使用Triton X-100。
[0068] 可以單獨(dú)添加或與非離子型表面活性劑組合添加非離子型聚合物。任一者均可以 與陽(yáng)離子型聚合物同時(shí)或在添加陽(yáng)離子型聚合物之后添加。非離子型聚合物和非離子型表 面活性劑兩者均可以在1分鐘或更短的添加時(shí)間內(nèi)快速添加。
[0069] 在絮凝體沉降（初級(jí)沉降）后，可以收獲澄清了的上清液。為了提高重組產(chǎn)物回 收率，可以將絮狀物洗滌或重懸以便移去任何殘留的重組產(chǎn)物。合適的洗滌稀釋劑包括蔗 糖、PEG、細(xì)胞培養(yǎng)基以及緩沖鹽水溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，洗滌稀釋劑是9%的蔗糖。將 絮狀物與洗滌稀釋劑混合〈1分鐘至60分鐘并且允許沉降約1小時(shí)至24小時(shí)。在絮狀物 沉降（二次沉降）后，可以收獲二次澄清了的上清液?？梢詫碜猿跫?jí)沉降的上清液與來 自二次沉降的上清液合并或單獨(dú)地純化。
[0070] 可以通過抽吸或傾析取出上清液，繼而經(jīng)由容納硅藻土的深度過濾器，繼而0. 2 μ 截留膜式過濾器過濾，或僅經(jīng)由0. 2 μ截留過濾器過濾來收獲澄清了的上清液。
[0071] 陽(yáng)離子型聚合物清除率可以通過本領(lǐng)域已知的方法，如用于監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒 性的測(cè)定法；用于測(cè)定對(duì)通過DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的DNA或RNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用的測(cè) 定法；以及測(cè)定mRNA的蛋白質(zhì)翻譯的測(cè)定法；以及本文所述的方法來監(jiān)測(cè)。舉例來說，重組 蛋白純化過程中間體的PDADMAC清除率可以通過在使用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QPCR)中對(duì) DNA擴(kuò)增的抑制作用來監(jiān)測(cè)。
[0072] 可以直接使用來自生物反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)肉湯或可以在絮凝之前將它冷卻。在一 個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)肉湯的溫度范圍是等于或約36°C至等于或約20°C。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞培養(yǎng)肉湯冷卻至20°C或冷卻至約20°C。
[0073] 本發(fā)明提供了一種從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲重組蛋白的方法。用于通過哺 乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生重組蛋白的商業(yè)過程中所使用的典型方法包括分批式培養(yǎng)法、分批 補(bǔ)料培養(yǎng)法以及灌注培養(yǎng)法。分批式培養(yǎng)法是一種不連續(xù)的方法，其中將細(xì)胞在固定體積 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)較短的一段時(shí)間，然后完全收獲。典型地在達(dá)到最高細(xì)胞密度（典型地是 5-10X10 6個(gè)細(xì)胞/毫升）時(shí)進(jìn)行收獲。分批補(bǔ)料培養(yǎng)法提供了一次性或連續(xù)的培養(yǎng)基進(jìn) 料以便補(bǔ)充已經(jīng)被消耗的那些培養(yǎng)基組分。由于分批補(bǔ)料培養(yǎng)物在整個(gè)操作期間接受額外 的營(yíng)養(yǎng)素，所以在與分批法相比時(shí)，它們有可能達(dá)到更高的細(xì)胞密度（>1〇至30X 106個(gè)細(xì) 胞/毫升）以及增加的產(chǎn)物滴度。在灌注法的情況下，典型的大規(guī)模商業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)策略力 圖達(dá)到高細(xì)胞密度，即60-90 (+) X 106個(gè)細(xì)胞/毫升，其中反應(yīng)器容積的差不多五十到超過 一半是生物質(zhì)。在灌注培養(yǎng)的情況下，已經(jīng)達(dá)到了 >1X 1〇8個(gè)細(xì)胞/毫升的極限細(xì)胞密度 并且預(yù)期達(dá)到甚至更高的密度。
[0074] 如本文所用的"肽"、"多肽"以及"蛋白質(zhì)"在全篇中可互換使用并且指的是包含 兩個(gè)或更多個(gè)彼此通過肽鍵連接的氨基酸殘基的分子。肽、多肽以及蛋白質(zhì)還包括修飾在 內(nèi)，所述修飾包括但不限于糖基化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的Y -羧化、羥基化以及 ADP-核糖基化。多肽可以具有科學(xué)或商業(yè)價(jià)值，包括基于蛋白質(zhì)的藥物在內(nèi)。多肽尤其包 括抗體、融合蛋白以及細(xì)胞因子。肽、多肽以及蛋白質(zhì)是使用細(xì)胞培養(yǎng)方法通過重組動(dòng)物細(xì) 胞系產(chǎn)生的并且可以被稱為"重組肽"、"重組多肽"以及"重組蛋白"。一種或多種所表達(dá)的 蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生或被分泌到培養(yǎng)基中，可以從所述培養(yǎng)基中回收和/或收集所述 蛋白質(zhì)。
[0075] 可以使用本發(fā)明的方法收獲的多肽的實(shí)例包括包含與以下蛋白質(zhì)中的一種的全 部或一部分相同或基本上相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)：腫瘤壞死因子（TNF)、flt3配體（W0 94/28391)、促紅細(xì)胞生成素、促血小板生成素、降|丐素、IL-2、血管生成素-2 (Maisonpierre 等（1997)，Science 277 (5322) : 55-60)、NF- κ B 的受體活化因子的配體（RANKL，TO 01/36637)、腫瘤壞死因子（TNF)相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL，W0 97/01633)、胸腺基質(zhì) 源性淋巴細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF，澳 大利亞專利No. 588819)、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（美國(guó)專利No. 6, 204, 363)、 表皮生長(zhǎng)因子、角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨核細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育因子、RANTES、人纖維蛋白原樣2 蛋白（FGL2 ;NCBI 登錄號(hào) NM_00682 :RUegg 和 Pvtela (1995), Gene 160:257-62)、生長(zhǎng)激素、 胰島素、胰島素調(diào)理素（insulinotropin)、胰島素樣生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺激素、包括α-干 擾素 、Υ -干擾素以及復(fù)合干擾素（美國(guó)專利No. 4, 695, 623和4, 897471)在內(nèi)的干擾素、神 經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、突觸結(jié)合蛋白樣蛋白（SLP 1-5)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3、胰高 血糖素、白細(xì)胞介素、集落刺激因子、淋巴細(xì)胞毒素-β、白血病抑制因子以及制瘤素-M。對(duì) 于可以根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的描述可以見于例如Human Cytokines:Handbook for Basic and Clinical Research,所有卷（Aggarwal 和 Gutterman 編著，Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998) ：Growth Factors:A Practical Approach(McKay 和 Leigh 編著，Oxford University Press Inc.，New York, 1993):以及 The Cytokine Handbook,第 1 和 2 卷（Thompson 和 Lotze 編著，Academic Press, San Diego, CA, 2003)中。
[0076] 另外，本發(fā)明的方法可用于收獲包含任何上述蛋白質(zhì)的受體、所述受體或任 何上述蛋白質(zhì)的拮抗劑和/或與這些受體或拮抗劑基本上相似的蛋白質(zhì)的氨基酸序 列的全部或一部分的蛋白質(zhì)。這些受體和拮抗劑包括：兩種形式的腫瘤壞死因子受體 (TNFR，被稱為p55和p75,美國(guó)專利No. 5, 395, 760和美國(guó)專利No. 5, 610, 279)、白細(xì)胞介 素-1 (IL-1)受體（I型和II型；歐洲專利No. 0460846、美國(guó)專利No. 4, 968, 607、以及美國(guó) 專利No. 5, 767, 064)、IL-1受體拮抗劑（美國(guó)專利No. 6, 337, 072)、IL-1拮抗劑或抑制劑 (美國(guó)專利 No. 5, 981，713、6, 096, 728 以及 5, 075, 222)、IL-2 受體、IL-4 受體（歐洲專利 No. 0367566 以及美國(guó)專利 No. 5, 856, 296)、IL-15 受體、IL-17 受體、IL-18 受體、Fc 受體、 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體、粒細(xì)胞集落刺激因子受體、制瘤素-M受體和白血病 抑制因子受體、NF-κ B的受體活化因子（RANK，W0 01/36637和美國(guó)專利No. 6, 271，349)、骨 保護(hù)素（美國(guó)專利No. 6, 015, 938)、TRAIL受體（包括TRAIL受體1、2、3以及4)、以及包含 死亡結(jié)構(gòu)域的受體，如Fas或細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)受體（AIR)。
[0077] 可以使用本發(fā)明收獲的其它蛋白質(zhì)包括包含分化抗原（被稱為CD蛋白）或它們 的配體或與這些物質(zhì)中的任一種基本上相似的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的全部或一部分的蛋 白質(zhì)° 這-些抗.原公開在 Leukocyte Typing VI (Proceedings of the Vlth International Workshop and Conference，Kishimoto，Kikutani 等編著，Kobe, Japan, 1996)中。類似的 ⑶蛋白在后續(xù)的研討會(huì)中公開。這些抗原的實(shí)例包括⑶22、⑶27、⑶30、⑶39、⑶40以及其 配體（CD27配體、CD30配體等）。多種CD抗原是TNF受體家族的成員，所述TNF受體家族 還包括41BB和0X40。所述配體通常是TNF家族的成員，41BB配體和0X40配體同樣如此。
[0078] 具有酶活性的蛋白質(zhì)或它們的配體也可以使用本發(fā)明來收獲。實(shí)例包括包含以下 蛋白質(zhì)或它們的配體或與這些物質(zhì)中的一種基本上相似的蛋白質(zhì)中的一種的全部或一部 分的蛋白質(zhì)：去整合素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域家族成員（包括TNF-α轉(zhuǎn)化酶）、各種激酶、葡 糖腦苷脂酶、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、載脂蛋白E、載脂 蛋白A-Ι、球蛋白、IL-2拮抗劑、α -1抗胰蛋白酶、任何上述酶的配體，以及許多其它酶和它 們的配體。
[0079] 除非另外說明，否則術(shù)語(yǔ)"抗體"包括提及任何同種型或子類的糖基化和非糖基化 免疫球蛋白或其與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)，包括人類抗體、人源化抗體、嵌 合抗體、多特異性抗體、單克隆抗體、多克隆抗體以及其低聚物或抗原結(jié)合片段。還包括具 有抗原結(jié)合片段或抗原結(jié)合區(qū)的蛋白質(zhì)，如Fab、Fab'、F(ab'） 2、Fv、雙功能抗體、Fd、dAb、巨 抗體（maxibody)、單鏈抗體分子、互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)片段、scFv、雙功能抗體、三功能抗體、 四功能抗體以及含有免疫球蛋白中足以賦予目標(biāo)多肽以特異性抗原結(jié)合作用的至少一部 分的多肽。術(shù)語(yǔ)"抗體"包括但不限于通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的那些抗體，如 從經(jīng)過轉(zhuǎn)染以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞中分離的抗體。
[0080] 抗體的實(shí)例包括但不限于識(shí)別包括但不限于上述蛋白質(zhì)和/或以下抗原的蛋白 質(zhì)中的任一種或組合的那些抗體：⑶2、⑶3、⑶4、⑶8、⑶11a、⑶14、⑶18、⑶20、⑶22、⑶23、 CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7. 1)、CD86(B7. 2)、CD147、IL-1a、IL-1β、IL-2、IL-3、 IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-2 受體、IL-4 受體、IL-6 受體、IL-13 受體、IL-18 受體亞 單位、FGL2、PDGF-0 及其類似物（參見美國(guó)專利 No. 5, 272, 064 和 5, 149, 792)、VEGF、TGF、 TGF-β 2、TGF-β 1、EGF受體（參見美國(guó)專利No. 6, 235, 883)、VEGF受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 骨保護(hù)素配體、干擾素 Y、B淋巴細(xì)胞刺激因子（BlyS，也被稱為BAFF、THANK、TALL-1以及 zTNF4 ;參見 Do 和 Chen-Kiang (2002)，Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1) : 19-25)、C5 補(bǔ) 體、IgE、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG (其是所表達(dá)的與肺癌有關(guān)的基因 產(chǎn)物）、HER-2、HER-3、腫瘤相關(guān)糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、在患有結(jié)腸癌和/或胰腺癌的患 者血清中以升高的水平存在的腫瘤相關(guān)表位、乳腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、胰腺 癌、肺癌和/或腎癌細(xì)胞上和/或黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞、腫瘤的壞死 核心上表達(dá)的癌癥相關(guān)表位或蛋白質(zhì)、整合素 α 4β 7、整合素 VLA-4、B2整合素、TRAIL受體 1、2、3以及4、RANK、RANK配體、TNF-α、粘附分子VAP-1、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM)、細(xì)胞間 粘附分子-3(ICAM-3)、白細(xì)胞整合素、粘附素、血小板糖蛋白gp Ilb/IIIa、心臟肌球蛋白重 鏈、甲狀旁腺激素、rNAPc2(其是因子Vila-組織因子的抑制劑）、MHC I、癌胚抗原（CEA)、甲 胎蛋白（AFP)、腫瘤壞死因子（TNF)、CTLA-4(其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原）、Fc-y-1 受體、HLA-DR 10β、HLA-DR抗原、硬化蛋白、L-選擇素、呼吸道合胞病毒、人類免疫缺陷病 毒（HIV)、乙型肝炎病毒（HBV)、變形鏈球菌（Streptococcus mutans)以及金黃色葡萄球 菌（Staphlycoccus aureus)?？梢允褂帽景l(fā)明的方法產(chǎn)生的已知抗體的具體實(shí)例包括但 不限于阿達(dá)木單抗（adalimumab)、貝伐單抗（bevacizumab)、英夫利昔單抗（infliximab)、 阿昔單抗（abciximab)、阿侖單抗（alemtuzumab)、巴匹珠單抗（bapineuzumab)、巴利 昔單抗（basiliximab)、貝利單抗（belimumab)、布雷奴單抗（briakinumab)、卡那單 抗（canakinumab)、賽妥珠單抗（certolizumab pegol)、西妥昔單抗（cetuximab)、可 那木單抗（conatumumab)、地諾單抗（denosumab)、伊庫(kù)珠單抗（eculizumab)、吉妥 珠單抗奧唑米星（gemtuzumab ozogamicin)、戈利木單抗（golimumab)、替伊莫單抗 (ibritumomab tiuxetan)、拉貝珠單抗（labetuzumab)、馬帕木單抗（mapatumumab)、 馬妥珠單抗（matuzumab)、美泊利單抗（mepolizumab)、莫維珠單抗（motavizumab)、莫 羅單抗（muromonab) -0)3、那他珠單抗（natalizumab)、尼妥珠單抗（nimotuzumab)、 奧法木單抗（ofatumumab)、奧馬珠單抗（omalizumab)、奧戈伏單抗（oregovomab)、帕 利珠單抗（palivizumab)、帕尼單抗（panitumumab)、培圖莫單抗（pemtumomab)、帕妥 珠單抗（pertuzumab)、雷珠單抗（ranibizumab)、利妥昔單抗（rituximab)、羅維珠單 抗（rovelizumab)、托珠單抗（tocilizumab)、托西莫單抗（tositumomab)、曲妥珠單抗 (trastuzumab)、優(yōu)特克單抗（ustekinumab)、維多珠單抗（vedolizomab)、扎魯木單抗 (zalutumumab)以及扎木單抗（zanolimumab) 〇
[0081] 本發(fā)明還可以用于收獲包含例如任何上述蛋白質(zhì)的重組融合蛋白。舉例來說， 包含上述蛋白質(zhì)中的一種加上多聚化結(jié)構(gòu)域，如亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、免疫球蛋白的 Fc部分或基本上類似的蛋白質(zhì)的重組融合蛋白可以使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生。參見例如 W094/10308 ;Lovejoy 等(1993). Science 259:1288-1293 ;Harbury 等(1993). Science 262:1401-05 ;Harbury 等(1994), Nature 371:80-83 ; H&kanss〇n 等(1999), Structure 7:255-64。在這些重組融合蛋白中特別包括的是受體的一部分與抗體的Fc部分融合的蛋 白質(zhì)，如依那西普（etanercept) (p75TNFR:Fc)和貝拉西普（belatacept) (CTLA4:Fc)。
[0082] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，細(xì)胞培養(yǎng)基是在體外細(xì)胞培養(yǎng)中適于動(dòng)物細(xì)胞，如哺乳 動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基制劑是本領(lǐng)域熟知的。典型地，細(xì)胞培養(yǎng)基包含緩沖 齊IJ、鹽、碳水化合物、氨基酸、維生素以及痕量的必需元素。細(xì)胞培養(yǎng)基可以含有或可以不 含血清、蛋白胨和/或蛋白質(zhì)。包括無血清培養(yǎng)基和成分明確培養(yǎng)基在內(nèi)的各種組織培 養(yǎng)基是可商購(gòu)獲得的，例如尤其可以使用以下細(xì)胞培養(yǎng)基中的任一種或組合：RPMI-1640 培養(yǎng)基、RPMI-1641培養(yǎng)基、杜氏改良伊格氏培養(yǎng)基（Dulbecco' s Modified Eagle's Medium，DMEM)、伊格氏最低必需培養(yǎng)基（Minimum Essential Medium Eagle)、F_12K 培 養(yǎng)基、漢姆氏F12培養(yǎng)基（Ham's F12 Medium)、伊斯科夫改良杜氏培養(yǎng)基（Iscove's Modified Dulbecco' s Medium)、麥考伊氏 5A 培養(yǎng)基（McCoy，s 5A Medium)、萊氏 L-15 培養(yǎng)基（Leibovitz's L-15 Medium)，以及無血清培養(yǎng)基，如EX-CELL? 300系列（JRH Biosciences, Lenexa, Kansas)。細(xì)胞培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有另外的組分或增加濃度的組分，如 氨基酸、鹽、糖、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、緩沖劑、抗生素、脂質(zhì)、痕量元素等，這取決于所要 培養(yǎng)的細(xì)胞的需要和/或所需的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。
[0083] 細(xì)胞培養(yǎng)基可以是無血清、無蛋白質(zhì)和/或無蛋白胨的。"無血清"適用于不含動(dòng) 物血清，如胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。"無蛋白質(zhì)"適用于不含外源添加的蛋白質(zhì)，如轉(zhuǎn)鐵蛋 白、蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子IGF-1或胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)基。無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基可以含有或可以不含 蛋白胨。"無蛋白胨"適用于不含外源性蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，如動(dòng)物和/或植物蛋白水解產(chǎn)物 的細(xì)胞培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)肉湯或類似術(shù)語(yǔ)指的是尤其含有活哺乳動(dòng)物細(xì)胞和非活哺乳動(dòng)物 細(xì)胞、細(xì)胞代謝物以及細(xì)胞碎片（如核酸、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)體）的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0084] 細(xì)胞培養(yǎng)或"培養(yǎng)"的意思是使細(xì)胞在多細(xì)胞生物體或組織外部生長(zhǎng)和繁殖。適用 于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。參見例如Animal cell culture:A Practical Approach, D.Rickwood 編著，Oxford University Press, New York (1992)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞 可以懸浮培養(yǎng)或在貼壁于固體基質(zhì)上時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。具有或不具有微載體并且以分批、分批 補(bǔ)料、連續(xù)、半連續(xù)或灌注模式操作的流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、滾瓶、搖瓶 或攪拌釜式生物反應(yīng)器可供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)使用。
[0085] 可以在小規(guī)模培養(yǎng)，例如像100ml至大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，如具有成千和上萬毫升的 培養(yǎng)尺寸的系統(tǒng)中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如CH0細(xì)胞），以便在臨床和商業(yè)上制造蛋白質(zhì)治療 劑。
[0086] 對(duì)細(xì)胞系（也被稱為"宿主細(xì)胞"）進(jìn)行遺傳工程化以使其表達(dá)具有商業(yè)或科學(xué) 價(jià)值的多肽。細(xì)胞系典型地源自于由原代培養(yǎng)物所產(chǎn)生的譜系，所述原代培養(yǎng)物可以在培 養(yǎng)中維持無限的時(shí)間。對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行遺傳工程化包括使用重組多核苷酸分子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn) 染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)，和/或以另外的方式發(fā)生改變（例如通過使重組細(xì)胞與非重組細(xì)胞進(jìn)行同 源重組和基因活化或融合）以便產(chǎn)生表達(dá)所需重組多肽的宿主細(xì)胞。用于對(duì)細(xì)胞和/或 細(xì)胞系進(jìn)行遺傳工程化以使其表達(dá)所關(guān)注的多肽的方法和載體是為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 失口白勺:例如，各種技術(shù)說明于Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編著 (町167&3〇118，他￥￥〇^，1988 以及每季更新的內(nèi)容）；3&1]1131'〇〇1^等，]\1〇16(3111&1'〇1〇11；[1^:八 Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory Press, 1989) ；Kaufman, R. J. , Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990，第 15-69 頁(yè)。
[0087] 適于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的多種多樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心（American Type Culture Collection) (Manassas，Va.)和商業(yè)供應(yīng)商。常用于工業(yè) 中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的實(shí)例包括VERO、BHK、HeLa、CV1 (包括Cos)、1?0(、293、3了3、骨髓瘤 細(xì)胞系（例如呢0、呢1)、？(：12、1138細(xì)胞以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（010)細(xì)胞。010細(xì)胞被廣 泛用于產(chǎn)生復(fù)雜的重組蛋白，例如細(xì)胞因子、凝血因子以及抗體（Brasel等(1996), Blood 88:2004-2012 ;Kaufman 等(1988). T. Biol Chem 263:6352-6362 ;McKinnon 等（1991)，J Mol Endocrinol 6:231-239 ;Wood 等(1990). T. Immunol. 145:3011-3016)。二氫葉酸還原 酶（DHFR)缺陷型突變細(xì)胞系（Urlaub 等(1980). Proc Natl Acad Sci USA 77:4216-4220)、 DXB11以及DG-44是合乎需要的CH0宿主細(xì)胞系，這是因?yàn)楦咝У腄HFR選擇和可擴(kuò)增基 因表達(dá)系統(tǒng)允許在這些細(xì)胞中進(jìn)行高水平的重組蛋白表達(dá)（Kaufman R.J. (1990). Meth Enzymol 185:537-566)。另外，這些細(xì)胞作為貼壁或懸浮培養(yǎng)物是易于操作的并且展現(xiàn)出 相對(duì)良好的遺傳穩(wěn)定性。CH0細(xì)胞和在它們當(dāng)中重組表達(dá)的蛋白質(zhì)已被廣泛地表征并且已 由監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床商業(yè)制造。
[0088] 雖然本申請(qǐng)中所用的術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域內(nèi)是標(biāo)準(zhǔn)的，但是本文提供了某些術(shù)語(yǔ)的定義 以確保權(quán)利要求書的含義的清晰性和明確性。單位、前綴以及符號(hào)可以它們?yōu)镾I所接受的 形式表示。本文所陳述的數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字，并且包括并支持所限定的范圍 內(nèi)的每一個(gè)整數(shù)。除非另外指出，否則術(shù)語(yǔ)"一個(gè)（種）（a) "或"一個(gè)（種）（an) "應(yīng)被視為意 指"至少一個(gè)（種）"。本文所用的章節(jié)標(biāo)題僅用于組織目的而不應(yīng)被視為限制所述的主題。 除非另外指明，否則本文所述的方法和技術(shù)一般根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，所述常規(guī)方法是本領(lǐng) 域熟知的并且如在整個(gè)本說明書中所引用和論述的各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)中所述。 參見例如 Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001);以及 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992);以及 Harlow 和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。本申請(qǐng)中所引用的所有文獻(xiàn)或文獻(xiàn)的部分（包括但不限于專 利、專利申請(qǐng)、文章、書籍以及論文）特此以引用的方式明確并入。
[0089] 本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實(shí)施方案的限制，所述具體實(shí)施方案僅旨在對(duì) 本發(fā)明的單個(gè)方面進(jìn)行說明，并且功能上等同的方法和組分處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上， 根據(jù)上述描述和附圖，除了本文所示和所描述的那些改動(dòng)之外，對(duì)本發(fā)明的各種改動(dòng)對(duì)于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也將變得顯而易見。這些改動(dòng)旨在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。 實(shí)施例
[0090] 實(shí)施例1
[0091] 該實(shí)驗(yàn)對(duì)二烯丙基二甲基氯化銨（PDADMAC)的不同分子量制備物進(jìn)行比較，使用 這些制備物使哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯絮凝并且比較它們的沉降時(shí)間。
[0092] 以分批補(bǔ)料培養(yǎng)法將表達(dá)重組單克隆抗體的CH0細(xì)胞在2, 000L的生物反應(yīng)器中 培養(yǎng)15天。在測(cè)試之前將細(xì)胞培養(yǎng)肉湯冷卻至10°C。設(shè)置一系列旋轉(zhuǎn)燒瓶，其中每一個(gè)燒 瓶中存在1L的細(xì)胞培養(yǎng)肉湯。PDADMAC以20% (w/v)液體的形式提供（Sigma Aldrich，St. Louis，MO)，并且通過用純水稀釋至10% (w/v)來制備所有這些實(shí)驗(yàn)中所用的操作儲(chǔ)備溶 液。將分子量為 1〇〇, 000-200, 〇〇〇、200, 000-350, 000 以及 400, 000-500, 000 的 PDADMAC 添 加至每一個(gè)燒瓶中達(dá)到介于29皮克至86皮克的PDADMAC/總細(xì)胞密度之間的最終濃度。將 PDADMAC溶液連續(xù)添加約1分鐘并且在以70rpm-80rpm攪拌下在10°C下孵育15分鐘。使 絮狀物在環(huán)境溫度下沉降。將這一物質(zhì)用于沉降時(shí)間測(cè)定。
[0093] 在1，000L -次性反應(yīng)器中培養(yǎng)第二批分批補(bǔ)料培養(yǎng)物，持續(xù)15天。將細(xì)胞培養(yǎng)肉 湯維持在約36°C下。設(shè)置一系列旋轉(zhuǎn)燒瓶，其中每一個(gè)燒瓶中存在1L的細(xì)胞培養(yǎng)肉湯。將 分子量為〈100, 〇〇〇、100, 000-200, 000、200, 000-350, 000 以及 400, 000-500, 000 的 PDADMAC 添加至每一個(gè)燒瓶中達(dá)到介于25皮克至76皮克的PDADMAC/總細(xì)胞密度之間的最終濃度。 將PDADMAC溶液連續(xù)添加約1分鐘并且在以70rpm-80rpm攪拌下在約36°C下孵育15分鐘。 使絮狀物在環(huán)境溫度下沉降。將這一物質(zhì)用于濁度測(cè)定。
[0094] 通過將如使用Cedex細(xì)胞計(jì)數(shù)器和分析器（Roche Innovatis AG，Indianapolis，IN)由臺(tái)盼藍(lán)拒染所測(cè)量的活細(xì)胞總數(shù)與非活細(xì)胞總數(shù)相加來確定總細(xì) 胞密度。然后將絮凝了的溶液轉(zhuǎn)移到1L玻璃量筒中以測(cè)定絮凝并且壓緊的沉降速率。以 15分鐘的時(shí)間間隔獲得讀數(shù)，持續(xù)90分鐘并且將相對(duì)絮凝體積計(jì)算為沉降了的絮狀物體 積/總體積。
[0095] 通過傾析，繼而通過0.2 μ過濾器將上清液從沉降并且絮凝了的細(xì)胞物質(zhì)中取 出。使用2100Ρ濁度計(jì)（Hach，Loveland，C0)測(cè)量濁度。
[0096] 圖2A和2B示出了與平均分子量小于200, 000的PDADMAC相比，使用具有大于 200, 000但是小于500, 000的平均分子量的PDADMAC進(jìn)行絮凝會(huì)產(chǎn)生最佳的沉降時(shí)間和澄 明度。
[0097] 實(shí)施例2
[0098] 該實(shí)驗(yàn)比較使由小細(xì)胞系（如二倍體細(xì)胞系）與大細(xì)胞系（如四倍體細(xì)胞系）表 達(dá)重組抗體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯絮凝所需的PDADMAC的量。
[0099] 如上文所述培養(yǎng)二倍體細(xì)胞系和四倍體細(xì)胞系。設(shè)置一系列旋轉(zhuǎn)燒瓶，其中每一 個(gè)燒瓶中存在1L來自二倍體培養(yǎng)物和四倍體培養(yǎng)物中的每一種的細(xì)胞培養(yǎng)肉湯。在該實(shí) 驗(yàn)和以下所有實(shí)驗(yàn)中，除非另外指出，否則使用具有400, 000至500, 000的平均分子量的 PDADMAC。將PDADMAC添加至每一個(gè)燒瓶中達(dá)到如表2中所示的最終濃度。如上文所述測(cè) 定總細(xì)胞密度。表2 :用于二倍體培養(yǎng)物和四倍體培養(yǎng)物的PDADMAC的最終濃度 [0100]
【權(quán)利要求】
1. 一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降，以及 回收澄清了的上清液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述陽(yáng)離子型聚合物是 聚二烯丙基二甲基氯化銨。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述非離子型聚合物選 自聚乙二醇和葡聚糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述非離子型聚合物選 自 PEG 3, 000 和 PEG 6, 000。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法進(jìn)一步包括將非離 子型表面活性劑添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述非離子型表面活性 劑是 Triton X-100。
7. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將聚二烯丙基二甲基氯化銨和PEG 3, 000添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降，以及 回收澄清了的上清液。
8. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3, 000以及Triton X-100添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基 中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降，以及 回收澄清了的上清液。
9. 一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降， 回收初級(jí)澄清了的上清液， 對(duì)所述初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌， 使所述經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
10. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將陽(yáng)離子型聚合物和非離子型聚合物添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降， 回收初級(jí)澄清了的上清液， 如果所述初級(jí)澄清了的上清液中的產(chǎn)物回收率小于80%，則對(duì)所述初級(jí)沉降的絮凝體 進(jìn)行洗滌， 使所述經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述陽(yáng)離子型聚 合物是聚二烯丙基二甲基氯化銨。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述非離子型聚 合物選自聚乙二醇和葡聚糖。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述非離子型聚 合物選自 PEG 3, 000 和 PEG 6, 000。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法進(jìn)一步包括 將非離子型表面活性劑添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，其中所述非離子型表面活 性劑是 Triton X-100。
16. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將聚二烯丙基二甲基氯化銨和PEG 3, 000添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降， 回收初級(jí)澄清了的上清液， 對(duì)所述初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌， 使所述經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
17. -種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物收獲方法，所述方法包括 將表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間或直到達(dá)到所需的 細(xì)胞密度和/或細(xì)胞壓積為止， 將聚二烯丙基二甲基氯化銨、PEG 3, 000以及Triton X-100添加至所述細(xì)胞培養(yǎng)基 中，從而引發(fā)絮凝， 在絮凝期間混合所述細(xì)胞培養(yǎng)基， 使絮凝體沉降以進(jìn)行初級(jí)沉降， 回收初級(jí)澄清了的上清液， 對(duì)所述初級(jí)沉降的絮凝體進(jìn)行洗滌， 使所述經(jīng)過洗滌的絮凝體沉降以進(jìn)行二次沉降，以及 回收所述二次澄清了的上清液。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中同時(shí)添加所述陽(yáng)離子型聚合物和所 述非離子型聚合物。
19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中首先添加所述陽(yáng)離子型聚合物并且 混合至少30秒，繼而添加所述非離子型聚合物。
20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中同時(shí)添加所述陽(yáng)離子型聚合物、所述 非離子型聚合物以及非離子型表面活性劑。
21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中首先添加所述陽(yáng)離子型聚合物并且 混合至少30秒，繼而添加所述非離子型聚合物和非離子型表面活性劑。
22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述陽(yáng)離子型聚合物是二烯丙基二 甲基氯化銨的聚合物、聚二烯丙基二甲基氯化銨、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺或殼聚糖。
23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非離子型聚合物是聚乙二醇或 葡聚糖。
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述非離子型表面活性劑是Sapoin 或 Triton X100。
25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中以等于或約20皮克/總細(xì)胞密度至 等于或約90皮克/總細(xì)胞密度的濃度添加所述聚二烯丙基二甲基氯化銨。
26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中以等于或約25皮克/總細(xì)胞密度的 濃度添加所述聚二烯丙基二甲基氯化銨，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源于二倍體細(xì)胞系。
27. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中添加介于43皮克/總細(xì)胞密度與57 皮克/總細(xì)胞密度之間的所述聚二烯丙基二甲基氯化銨，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源于四 倍體細(xì)胞系。
28. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中TOG 3, 000的濃度是等于或約3%至 等于或約4. 5%。
29. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中PEG 6, 000的濃度是等于或約2. 5% 至等于或約3. 5 %。
30. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中Triton X100的濃度是0.05% (w/ v)。
31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯在36°C 與20°C之間。
32. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)肉湯處于 20°C或高于20°C。
33. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在9%蔗糖溶液中對(duì)來自所述初級(jí) 沉降的所述絮凝體進(jìn)行洗滌。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK104245922SQ201280069842
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月15日
【發(fā)明者】M. 麥克納尼 T., 佩蒂 K., C. 托馬斯 A., 趙曉陽(yáng) 申請(qǐng)人:安姆根有限公司