一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF藥物組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF藥物組合物及其制備方法。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的rhG-CSF藥物組合物包括以下組分：組分I：N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF，純度≥95.0％；組分II：選自rhG-CSF、非N-末端mono-mPEG20000-rhG-CSF、di-mPEG20000-rhG-CSF、tri-mPEG20000-rhG-CSF中的一種或幾種，0≤含量≤5.0％，且0≤rhG-CSF含量≤3.0％；組分III：mPEG20000，0≤含量≤5.0％；以及殘余量雜質(zhì)，含量＜0.5％。本發(fā)明提供的聚乙二醇修飾的rhG-CSF藥物活性組合物，各項指標均符合藥用要求，質(zhì)量均一，且體外活性、半衰期、安全性等方面均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品，能夠保證聚乙二醇修飾的rhG-CSF制劑的臨床療效及用藥安全。
【專利說明】—種聚乙二醇修飾的rhG-CSF藥物組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種聚乙二醇修飾的rhG-CSF藥物組合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]粒細胞集落刺激因子G-CSF是一種藥學上的活性蛋白，其可以促使中性粒系細胞的產(chǎn)生，增殖和分化，并激活血液中成熟中性粒細胞的功能。G-CSF可用于各種白細胞減少癥，它可以使干細胞和前體細胞從骨髓轉(zhuǎn)移，并且用于治療由于化學療法引起的粒細胞減少患者，或用作骨髓移植的前序。rhG-CSF由原核表達系統(tǒng)(E.coli)重組表達制備，由175個氨基酸殘基組成的單鏈的非糖基化多肽鏈。
[0003]蛋白治療藥物rhG-CSF的生物利用度通常受血漿半衰期的限制，并且對蛋白酶降解敏感，阻礙了最大的臨床潛能。市售rhG-CSF有短期的藥理學作用，且在白細胞減少狀態(tài)的持續(xù)期間通常必須一天給藥一次以上，這給病人帶來很大痛苦。
[0004]PEG-rhG-CSF就是用PEG (聚乙二醇)對rhG-CSF進行修飾，從而降低rhG-CSF的免疫原性并延長其半衰期。
[0005]中國專利申請CN1139932A(文獻I)公開了一種N-末端單聚乙二醇化的rhG-CSF的制品，所述制品優(yōu)選由至少90%的N-末端單聚乙二醇化的rhG-CSF及至多10%的未發(fā)生聚乙二醇化的rhG-CSF組成；更優(yōu)選由至少95%的N-末端單聚乙二醇化的rhG-CSF及至多5%的未發(fā)生聚乙二醇化的rhG-CSF組成。在該專利說明書中，當所用PEG為甲氧聚乙二醇醛(mPEG)時，未提示純化后樣品單PEG化的rhG-CSF的含量。我們參考該專利公開方法，采用mPEG20kDa對rhG-CSF進行反應，單PEG化的rhG-CSF的轉(zhuǎn)化率只有70 %左右，按照其公開的純化方法也不能得到高純度(90%以上)的單PEG化的rhG-CSF。OlafB.Kinstler等在 Pharmacutical research Vol.13Νο.71996, “Characterization and StabilityofN-terminally PEGylated rhG-CSF”(文獻 2)中公開了與 CN1139932A 類似方法。我們采用PEG20kDa對rhG-CSF進行反應，單PEG化的rhG-CSF的轉(zhuǎn)化率也只有70%左右，按照其公開的純化方法也不能得到高純度(90%以上)的單PEG化的rhG-CSF。
[0006]為了提高對rhG-CSF的N-末端單聚乙二醇化的專一性及產(chǎn)品純度，我公司進行了大量研究工作，并于2005年3月25日提交了中國專利申請CN1687106A(文獻3)，公開了一種改進的聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)α -氨基的方法，將用N-末端單mPEG-rhG-CSF的轉(zhuǎn)化率提高到95 %，經(jīng)純化后的產(chǎn)品含95 % mPEG-rhG-CSF及5 %的rh_G_CSF。用該專利公開方法可得到基本上均一的N-末端單InPEG2cicicicTrhG-CSF產(chǎn)品，但產(chǎn)品中未反應的rhG-CSF含量稍高，將對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生一定影響，并且該方法增加了對ε氨基進行保護及去除保護基步驟，操作相對繁瑣，且在生產(chǎn)上需要增加相應反應設(shè)備，增加了生產(chǎn)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明人長期致力于PEG化rhG-CSF的研究工作，通過對用現(xiàn)有技術(shù)方法制備得到的mPEG-rhG-CSF產(chǎn)品進行研究，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中主要存在以下雜質(zhì):
[0008](I)未反應完的原料，如:mPEG，rhG-CSF ；
[0009](2)其它取代位置的單(mono)取代mPEG-rhG-CSF ；
[0010](3)多取代的 mPEG-rhG-CSF，如 d1-mPEG-rhG-CSF、tr1-mPEG-rhG-CSF ；
[0011](4)其它雜質(zhì)，如外源性DNA、宿主菌蛋白等。
[0012]發(fā)明人通過大量研究發(fā)現(xiàn)，當產(chǎn)品中N末端mono-mPEG-rhG-CSF純度達到95%以上，上述(2)~(3)類雜質(zhì)總和含量≤5%，且(I)類雜質(zhì)中G-CSF含量≤3%, (4)類雜質(zhì)含量<0.5%時，產(chǎn)品質(zhì)量基本均一，且動物實驗表明產(chǎn)品安全有效。因此，發(fā)明人對用現(xiàn)有技術(shù)方法制備得到的mPEG-rhG-CSF粗品的純化方法進行了研究，終于找到一種能夠使N末端mono-mPEG-rhG-CSF純度達到95%以上，且各類雜質(zhì)能夠降到上述指標甚至更低以下，從而提高了 mPEG-rhG-CSF的質(zhì)量穩(wěn)定性，保障了其臨床用藥安全。
[0013]因此，本發(fā)明的一方面提供一種N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物，其特征在于，包括以下組分:
[0014]組分1:N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，純度≤ 95.0 % ；
[0015]組分I1:選自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF、tr1-mPEG-rhG-CSF中的一種或幾種，O≤含量≤5.0%，且O≤rhG-CSF含量≤3.0% ；
[0016]組分II1:mPEG，0 ≤含量≤ 5.0% ；
[0017]以及殘余量雜質(zhì)，含量< 0.5%。
[0018]上述藥物活性組合物中:
[0019]優(yōu)選地，組分1:純度≤96.0% ;組分I1:選自rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF中的一種或兩種，O≤含量≤4.0% ;組分II1:0≤mPEG含量≤4.0%。
[0020]更優(yōu)選地，組分1:純度≤97.0 % ;組分II選自rhG-CSF、diiPEG-rhG-CSF中的一種或兩種，且 O < d1-mPEG-rhG-CSF 含量≤ 3.0%,0 < rhG-CSF 含量≤ 2.0%，組分 III:O ( mPEG 含量≤ 3.0%。
[0021]進一步優(yōu)選地，組分1:純度≤98.0% ;組分I1:選自rhG-CSF、diiPEG-rhG-CSF中的一種或兩種，且O < d1-mPEG-rhG-CSF含量≤2.0%,0 < rhG-CSF含量≤1.0%，組分III:0 ( mPEG 含量≤ 2.0%。
[0022]進一步優(yōu)選地，組分1:純度≤99.0% ;組分I1:選自rhG-CSF、diiPEG-rhG-CSF中的一種或兩種，且O < d1-mPEG-rhG-CSF含量≤1.0%,0 < rhG-CSF含量≤0.5%，組分III:0 ( mPEG 含量≤ 1.0%。
[0023]上述任一藥物活性組合物中，所述mPEG優(yōu)選為分子量為20kDa的mPEG。
[0024]上述任一藥物活性組合物中，所述殘余量雜質(zhì)包含外源性DNA、宿主菌蛋白；優(yōu)選地，所述外源性DNA含量< IOng/劑量，所述宿主菌蛋白含量< 0.02%。
[0025]rhG-CSF序列中的5個賴氨酸為mPEG的結(jié)合位點，因此，上述藥物活性組合物中，所述mono-mPEG-rhG-CSF指的是，5個結(jié)合位點中，任一位點與PEG結(jié)合的mPEG-rhG-CSF ；非N-末端mono-mPEG-rhG-CSF指的是，除N-末端外，其它任一結(jié)合位點形成的mono-mPEG-rhG-CSF ;所述d1-mPEG-rhG-CSF指的是,5個結(jié)合位點中任意兩個位點結(jié)合mPEG的mPEG-rhG-CSF ;所述tr1-mPEG-rhG-CSF指的是，5個結(jié)合位點中任意三個位點結(jié)合mPEG 的 mPEG-rhG-CSF。[0026]本發(fā)明中所述組分I含量指的是其蛋白含量。
[0027]本發(fā)明另一方面還提供了一種上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法，包括以下步驟:
[0028](I)離子交換色譜法層析:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP離子交換色譜法層析，包括上樣、沖洗、梯度洗脫步驟；
[0029](2)分子篩層析:將離子交換層析富含N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的收集峰用Superdex 75柱進行分子篩層析，包括上樣、洗脫步驟，得N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。
[0030]上述制備方法中:離子交換色譜法層析和分子篩層析中的上樣和沖洗步驟所用緩沖液相同，為IOmM醋酸鈉-醋酸緩沖液，任選地，可加入少量表面活性劑，所述表面活性劑優(yōu)選為0.004%吐溫-80溶液，下文中將IOmM醋酸鈉-醋酸緩沖液和0.004%吐溫-80溶液組成的緩沖液簡稱為緩沖液A ;離子交換色譜法層析中的梯度洗脫步驟所用緩沖液為IOmM醋酸鈉-醋酸緩沖液與氯化鈉溶液，和/或表面活性劑的混合液，所述氯化鈉溶液濃度優(yōu)選為1M，所述表面活性劑優(yōu)選為0.004%吐溫-80溶液，下文將緩沖液A與IM氯化鈉的混合溶液簡稱緩沖液B。
[0031]進一步地,所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法,包括以下步驟:
[0032](I)離子交換色譜法層析:將N-末端-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP離子交換色譜法層析，包括:
[0033]①上樣:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A稀釋上樣；
[0034]②沖洗:以緩沖液A沖洗I~5個柱體積；
[0035]③梯度洗脫:以緩沖液A及緩沖液B梯度洗脫，收集洗脫峰1、2、3 ;
[0036](2)分子篩層析:將離子交換層析收集峰2用SuperdeX75柱進行分子篩層析，包括:
[0037]①上樣:將收集峰2用緩沖液A上樣；
[0038]②以緩沖液A洗脫，收集洗脫峰4和洗脫峰5，洗脫峰5即N-末端-mPEG-rhG-CSF。
[0039]更進一步的,所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法,包括以下步驟:
[0040](I)離子交換色譜法層析:將N-末端mono-mPEG2_Q-rhG-CSF粗品用Macro CapSP離子交換色譜法層析，包括:
[0041 ] ①上樣:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A稀釋至100~200 μ g/mL,以340mL/min± 10%的流速上樣；
[0042]②沖洗:以緩沖液A以400mL/min ± 10 %的流速沖洗3個柱體積；
[0043]③梯度洗脫:以緩沖液A及緩沖液B以90mL/min± 10%的流速梯度洗脫6個柱體積，所述梯度為O至50% ±10%，收集洗脫峰1、2、3 ;
[0044](2)分子篩層析:將離子交換層析收集峰2用SuperdeX75柱進行分子篩層析，包括:
[0045]①上樣:將收集峰I用緩沖液A以120mL/min± 10%的流速上樣，上樣體積為柱體積的
[0046]5 % ；[0047]②以緩沖液A以120mL/min±10%的流速洗脫，收集洗脫峰4和洗脫峰5，洗脫峰5即
[0048]N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF。
[0049]所述洗脫峰I~5參見附圖1和2。
[0050]本發(fā)明另一方面還提供一種上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物組合物,包含上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物及藥學上可接受的載體，通常將其制成注射制劑，優(yōu)選凍干粉針劑，這些制劑可采用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員公知的相應輔料，采用相應公知的藥物制劑的制備技術(shù)制得。
[0051]本發(fā)明另一方面還提供上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物或包含其的藥物組合物在制備用于治療以造血或免疫功能減退為特征的疾病的藥物中的應用，優(yōu)選所述疾病是由化療、放療、感染性疾病、嚴重慢性嗜中性粒細胞減少癥或白血病引起的。
[0052]本發(fā)明另一方面還提供一種采用上述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法得到的mPEG2_-rhG-CSF產(chǎn)品，體外活性≥9 X 107IU/mg，優(yōu)選為1.2~
2.5X108IU/mg。
[0053]本發(fā)明所述N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物,各項指標均符合藥用要求，質(zhì)量均一，且藥效、半衰期、安全性等方面均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品，能夠保證N-末端mono-mPEG-rhG-CSF制劑的臨床療效及用藥安全。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1:本發(fā)明實施例離子交換色譜法層析洗脫示意圖
[0055]圖2:本發(fā)明實施例分子篩層析洗脫示意圖
[0056]圖3:制備例制備的mPEG2Q(l(l(|-rhG-CSF粗品的液相圖譜
[0057]圖4:實施例1制備的InPEG2cicicicTrhG-CSF藥物活性組合物組分I和11檢測的液相圖譜
[0058]圖5:實施例2制備的mPEG2_Q-rhG-CSF藥物活性組合物組分I和11檢測的液相圖譜
[0059]圖6:實施例3制備的mPEG2_Q-rhG-CSF藥物活性組合物組分I和11檢測的液相圖譜
[0060]圖7:實施例4制備的HiPEG2cicicicTrhG-CSF藥物活性組合物組分I和11檢測的液相圖譜
[0061 ]圖8:實施例5制備的mPEG2Q(l(l(l-rhG-CSF藥物活性組合物組分I和11檢測的液相圖譜
[0062]圖9:實施例6制備的mPEG2_Q-rhG-CSF藥物活性組合物組分I和11檢測的液相圖譜【具體實施方式】
[0063]以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明所述內(nèi)容做進一步詳細的說明。
[0064] 以下制備例和實施例檢測方法如下:
[0065]1、組分I及組分II中各成分的含量檢測方法:照高效液相色譜法測定
[0066]色譜條件及測定方法:
[0067]儀器:WATERSTM600型高效液相色譜儀[0068]色譜柱:采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑
[0069]測定方法:以A相(三氟乙酸-水溶液:量取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混勻)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液:量取1.0ml三氟乙酸和99ml水加入色譜純乙腈至1000ml，充分混勻)為流動相，在室溫條件下，按下表進行梯度洗脫。上樣量應不低于10 μ g,在波長280nm處檢測。
[0070]表1組分I及組分II流動相洗脫梯度
【權(quán)利要求】
1.一種N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物，其特征在于，包括以下組分: 組分 1:N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF，純度≤ 95.0% ； 組分 I1:選自 rhG-CSF、非 N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF、tr1-mPEG-rhG-CSF中的一種或幾種，O≤含量≤5.0%，且O≤rhG-CSF含量≤3.0% ； 組分III:mPEG,0≤含量≤5.0% ； 以及殘余量雜質(zhì)，含量< 0.5%。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物活性組合物，其特征在于，組分1:純度≥96.0%;組分II:選自rhG-CSF、d1-mPEG-rhG-CSF中的一種或兩種，O≤含量≤4.0%;組分II1:0≤mPEG含量≤ 4.0%;優(yōu)選地，組分1:純度≥97.0%;組分II:0 ≤含量≤ 3.0%;組分III:0 ≤含量≤3.0% ;更優(yōu)選地，組分1:純度≥98.0% ;組分II:0 ≤含量≤ 2.0% ;組分III:0 ≤含量≤2.0% ;進一步優(yōu)選地，組分1:純度≥99.0% ;組分II:0 ≤含量≤1.0% ;組分III:O ≤mPEG 含量≤ 1.0%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物活性組合物，其特征在于，所述mPEG的分子量為20kDa。
4.如權(quán)利要求1或所述的藥物活性組合物，其特征在于，所述殘余量雜質(zhì)包含外源性DNA、宿主菌蛋白；優(yōu)選地，所述外源性DNA含量< IOng/劑量；所述宿主菌蛋白含量(0.02%。
5.一種如權(quán)利要求1所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法，包括以下步驟: (1)離子交換色譜法層析:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用MacroCap SP離子交換色譜法層析，包括上樣、沖洗、梯度洗脫步驟； (2)分子篩層析:將離子交換層析富含N-末端mono-mPEG-rhG-CSF的收集峰用Superdex 75柱進行分子篩層析，包括上樣、洗脫步驟，得N-末端mono-mPEG-rhG-CSF。
6.如權(quán)利要求5所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法，包括如下步驟， (1)離子交換色譜法層析:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用MacroCap SP離子交換色譜法層析，包括: ①上樣:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A稀釋上樣； ②沖洗:以緩沖液A沖洗I~5個柱體積； ③梯度洗脫:以緩沖液A及緩沖液B梯度洗脫，收集洗脫峰1、2、3； (2)分子篩層析:將離子交換層析收集峰2用SuperdeX75柱進行分子篩層析，包括: ①上樣:將收集峰2用緩沖液A上樣； ②以緩沖液A洗脫，收集洗脫峰4和洗脫峰5，洗脫峰5即N-末端mono-mPEG-rhG-CSF； 所述緩沖液A為IOmM醋酸鈉-醋酸緩沖液和0.004%吐溫-80溶液的混合液；所述緩沖液B為緩沖液A與IM氯化鈉的混合溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物的制備方法，包括如下步驟: (1)離子交換色譜法層析:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品用Macro Cap SP離子交換色譜法層析，包括:①上樣:將N-末端mono-mPEG-rhG-CSF粗品以緩沖液A稀釋至100~200μ g/mL,以340mL/min± 10%的流速上樣； ②沖洗:以緩沖液A以400mL/min±10%的流速沖洗3個柱體積； ③梯度洗脫:以緩沖液A及緩沖液B以90mL/min±10%的流速梯度洗脫6個柱體積，所述梯度為O至50% ±10%，收集洗脫峰1、2、3 ； (2)分子篩層析:將離子交換層析收集峰2用SuperdeX75柱進行分子篩層析，包括: ①上樣:將收集峰2用緩沖液A以120mL/min±10%的流速上樣，上樣體積為柱體積的5% ； ②以緩沖液A以120mL/min±10%的流速洗脫，收集洗脫峰4和洗脫峰5，洗脫峰5即N-末端 mono-mPEG-rhG-CSF。
8.—種藥物組合物,包含如權(quán)利要求1至4所述的任一 N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物及藥學上可接受的載體；優(yōu)選地，所述藥物組合物為注射制劑，優(yōu)選為凍干粉針劑。
9.如權(quán)利要求1至4所述的任一N-末端mono-mPEG-rhG-CSF藥物活性組合物，或權(quán)利要求8所述的藥物組合物，在制備用于治療以造血或免疫功能減退為特征的疾病的藥物中的應用；優(yōu)選地，所述疾病是由化療、放療、感染性疾病、嚴重慢性嗜中性粒細胞減少癥或白血病引起的。
10.一種采用權(quán)利要求5至7任一所述的制備方法得到的MPEG20000-rhG-CSF產(chǎn)品，體外活性> 5.0X107IU/mg，優(yōu)選為 5.8 X 1O7 ~8.3X107IU/mg。
【文檔編號】C07K1/16GK103908660SQ201310022078
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月5日
【發(fā)明者】梁關(guān)軍, 竇燕峰, 王龍山, 徐光
申請人:石藥集團百克(山東)生物制藥有限公司