一種海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】一種海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理，滅菌處理后對海帶進行研磨，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37℃的條件下恒溫培養(yǎng)5~7天；挑取單菌落反復劃線培養(yǎng)至純菌株；得到海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌HSN2，以其抑菌活性為標準篩選菌株，菌株在pH為5的蔗糖含量50g/L，蛋白胨含量6g/L的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25℃發(fā)酵6天；8000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為85%，4℃靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥。本發(fā)明方法操作簡單、成本低廉。
【專利說明】一種海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法及其應
用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域中抗腫瘤蛋白的制備方法，特別是一種海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海帶QMmirmria Japonica Aresch)是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物。它生長于水溫較低的海中，分布于我國北部沿海及朝鮮、日本和蘇聯(lián)太平洋地區(qū)沿岸，在我國北部及東南沿海有大量養(yǎng)殖。海帶主要是自然生長，也有人工養(yǎng)殖，多以干制品行銷于市，質(zhì)量以色褐、體短、質(zhì)細而肥厚者為佳。海帶有“長壽菜”、“海上之蔬” “含碘冠軍”的美譽。 [0003]海帶作為一種重要的海洋資源，其食用與藥用價值早為世人所知。從海帶中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗HIV和增強免疫功能，對治療心腦血管疾病和中、早期慢性腎衰等均有一定的作用。海帶中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有在抗腫瘤方面被充分利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、成本低廉的海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，使海帶在抗腫瘤方面得以廣泛應用。
[0005]本發(fā)明的一種海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，步驟如下:
a.取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理，所述的滅菌處理是用75%的酒精和1%的氯化汞對海帶的表面進行滅菌處理；
滅菌處理后對海帶進行研磨，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37°C的條件下恒溫培養(yǎng)5~7天；
b.挑取單菌落反復劃線培養(yǎng)至純菌株；得多粘芽孢桿菌Bacilluspolymyxa ;該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.7081 ；
c.以其抑菌活性為標準篩選菌株，菌株在pH為5的蔗糖含量50g/L，蛋白胨含量6 g/L的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25°C發(fā)酵6天；
d.8000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為85%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得到海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白。
[0006]本發(fā)明的海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白在抗腫瘤方面的應用。
[0007]本發(fā)明的方法操作簡單、成本低廉，從海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌菌株HSN2的發(fā)酵液中所提取的抗腫瘤活性蛋白抗腫瘤活性強，對海蝦無節(jié)幼體具有一定毒性，對白血病k562細胞株、人肝癌IfepG2，乳腺癌MDA-MB-231均有明顯的抑制活性，可應用于抗腫瘤藥品制備，具有產(chǎn)業(yè)價值。
[0008]本發(fā)明中的海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.7081。
【具體實施方式】
[0009]本發(fā)明實施例依次按如下步驟進行:
a.將剛打撈的新鮮海帶，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，再用75%酒精漂洗30-90s (30s 一個梯度)，無菌水沖洗；0.1%氯化汞漂洗6-18s (6s 一個梯度)，無菌水沖洗多次。將不同滅菌時間梯度的海帶片都分成兩份，一份用滅菌研缽研碎后接種到培養(yǎng)皿上作為實驗組，另一份直接放入空白培養(yǎng)基做對照組。倒置于37°C溫室中培養(yǎng)5~14天，觀察選取較好的實驗條件，即選擇實驗組中內(nèi)生菌生長良好，而對照組中無菌落長出的滅菌時間梯度作為海帶表面滅菌條件。海帶表面滅菌充分研磨后，將200 PL研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)5~7天。
[0010]b.挑取單個形態(tài)各異的菌落反復劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性作為初步篩選標準 。
[0011]通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結(jié)晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為多粘芽孢桿菌，該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.7081。
[0012]c.以抑菌圈平均直徑為標準，優(yōu)化次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的最佳條件，在pH 9的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25°C發(fā)酵6天，所述蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比分別為5%和6% ；
d.8000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為85%，4°C靜置過夜，過濾，將沉淀用蒸餾水溶解后，再用至少3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥；SDS-PAGE電泳結(jié)果表明沉淀物為蛋白質(zhì)。
[0013]e.海蝦毒性實驗:取本發(fā)明的蛋白樣品(8 mg/mL) 0.05mL加到3個帶刻度的試管中，再在每試管中加入約4 mL海水和10只健康的海奸無節(jié)幼體,最后用海水加至5 mL ；取3只試管，也加入10只健康的海蝦無節(jié)幼體，再用海水加至5 mL，作為空白對照。24°C置日光燈下，24 h后計數(shù)存活海蝦。每個實驗重復三次。實驗結(jié)果表明小蝦存活率為5%，而空白對照無一死亡，因此該蛋白具有一定的海蝦毒性活性。海蝦幼蟲曾被許多活性測試系統(tǒng)應用，有研究發(fā)現(xiàn)海蝦毒性法和9KB (人鼻咽癌)細胞毒性實驗呈現(xiàn)很好的相關(guān)性(P =01036，kappa = 0156)。細胞毒的ED50 —般是海蝦毒LD50的I/ 10，可用海蝦毒性法代替昂貴而繁雜的體內(nèi)體外抗腫瘤實驗，指導對具細胞毒和3PS ( P388，體內(nèi)老鼠白血病)活性提取物的分離。海蝦毒性法具快速(24h)、便宜和簡單(如不需無菌操作)等優(yōu)點，實驗結(jié)果表明:本發(fā)明實施例所制備的蛋白質(zhì)有抗腫瘤活性，可應用于抗腫瘤藥物的制備。
[0014]f.取凍干樣品用DMEM溶解，培養(yǎng)腫瘤細胞(肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231和白血病細胞K562，樣品設定濃度梯度，用MTT法測蛋白作用后腫瘤細胞存活率。具體操作如下:抗腫瘤活性的檢測:首先培養(yǎng)腫瘤細胞，將肝癌細胞HePG2、乳腺癌細胞MDA-MB-231和白血病細胞K562復蘇到20%的血清培養(yǎng)集中，培養(yǎng)4飛天，接種到六孔板中，換成10%培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞密度達到2*106后接種到96孔板中，每空100 μL,過夜；將蛋白用 DMEM 溶液溶解，然后用 DMEM 做梯度稀釋(10、20、30、40、60、80、100、150、200、300 μδ/mL)，將96孔板中培養(yǎng)基棄掉加入蛋白樣品孵育6小時，空白對照只加DMEM。配制MTT，6小時后每空加入10 μL ΜΤΤ，孵育4小時，然后將孔內(nèi)液體棄掉，每空加入100 μL DMSO溶解紫色結(jié)晶，37°C水浴保持20分鐘。然后用酶標儀在490nm下測吸光度值進而處理數(shù)據(jù)計算細胞存活率。結(jié)果表明300 Pg/mL蛋白對肝癌細胞HePG2抑制率66.8%，白血病細胞K562的抑制率92.65%，對乳腺癌細胞MDA-MB-231的抑制率88.49%。而且自10 μδ/ mL開始就出現(xiàn)了抑制活性， 呈現(xiàn)劑量效應。因此進一步證明，該菌株蛋白可作為粉劑或針劑用于抗腫瘤藥物的制備。
【權(quán)利要求】
1.一種海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，其特征在于:步驟如下: a.取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理，所述的滅菌處理是用75%的酒精和1%的氯化汞對海帶的表面進行滅菌處理； 滅菌處理后對海帶進行研磨，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37°C的條件下恒溫培養(yǎng)5~7天； b.挑取單菌落反復劃線培養(yǎng)至純菌株；得多粘芽孢桿菌Bacilluspolymyxa, 該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC N0.7081 ； c.以其抑菌活性為標準篩選菌株，菌株在pH為5的蔗糖含量50g/L,蛋 白胨含量6 g/L的蔗糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中25°C發(fā)酵6天； d.8000r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為85%，4°C靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥。
2.一種根據(jù)權(quán) 利要求1所述的海帶內(nèi)生多粘芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的應用。
【文檔編號】C07K1/36GK103966288SQ201310034693
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月30日
【發(fā)明者】張付云, 徐鳳, 楊陽, 蒼桂璐, 祁艷霞 申請人:大連海洋大學, 張付云