專利名稱：一種利用超聲波從林蛙體中提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種林蛙抗菌肽提取方法，尤其是利用超聲波從林蛙體中提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法。其產(chǎn)品可廣泛的應(yīng)用于藥品、食品、水果及蔬菜保鮮、日用化妝品及飼料添加劑等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是對(duì)一些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視。鑒于抗菌肽天然廣譜抗菌、耐熱、無毒無藥殘、不易產(chǎn)生耐藥菌株等眾多的特點(diǎn)，抗菌肽有可能成為繼青霉素等傳統(tǒng)抗生素之后又一類重要的新型抗菌藥物。因此，抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用將是醫(yī)藥行業(yè)、食品行業(yè)、日化行業(yè)、飼料養(yǎng)殖行業(yè)等領(lǐng)域的一次革命，具有廣闊的應(yīng)用前景。 抗生素應(yīng)用的最佳時(shí)機(jī)是感染的前期，抗菌肽對(duì)感染的前、中、后期都有顯著的效果，不存在時(shí)機(jī)問題?？股貞?yīng)用有配伍禁忌，抗菌肽可以和任何藥物配伍應(yīng)用?？股卦诓煌o藥方式會(huì)產(chǎn)生不同的治療效果，抗菌肽口服和注射的效果相同，不存在用藥注意事項(xiàng)，可以按照最方便的方法給藥?？股卮嬖诓煌潭鹊母弊饔?、藥殘等問題，使用中有停藥期的規(guī)定，抗菌肽無藥殘、無毒副作用，無停藥期規(guī)定?？咕倪€有起效時(shí)間快，10分鐘內(nèi)被吸收完畢而且100%被吸收?？股卮嬖谖绽貌煌耆?，以及代謝造成的蓄積中毒危險(xiǎn)，對(duì)肝腎損傷最大，抗菌肽無積累性中毒現(xiàn)象，并有協(xié)助排毒功能，抗菌肽來自于動(dòng)植物自身免疫系統(tǒng)，是純正的綠色產(chǎn)品，其抗菌肽在各行業(yè)的應(yīng)用前景也很廣泛。根據(jù)相關(guān)資料對(duì)東北林蛙皮抗菌肽的初步研究表明，林蛙皮分泌物由多種組分組成，一只東北林娃個(gè)體可以同時(shí)在表面分泌多達(dá)12種的成熟抗菌肽。林娃皮抗菌肽是具有廣譜抗菌作用的多肽。林蛙皮抗菌肽在畜牧業(yè)中的應(yīng)用:作為飼料添加劑，使轉(zhuǎn)化率、成活率有了較大的提聞。林蛙皮抗菌肽在日化用品中的應(yīng)用:化妝品:溫和殺菌，消炎祛紅腫。衛(wèi)生用品:有洗手液，沐浴露，濕紙巾等?？咕臒o毒、無不良反應(yīng)、無殘留且無致細(xì)菌耐藥性的一類環(huán)保型制劑，與酒精或抗生素等傳統(tǒng)抗菌成分比有巨大的優(yōu)勢。林蛙皮抗菌肽在剃須膏和須后水等男士用品:劃傷皮膚防感染，促進(jìn)傷口愈合。林蛙皮抗菌肽在口腔保健品:漱口水、口腔噴劑、牙膏、含片、口香糖等。適當(dāng)添加抗菌肽達(dá)到殺菌，消炎的效果?？咕乃苄院茫糜谒卟吮ｕr可形成無色保護(hù)摸，殺死表面細(xì)菌，從而達(dá)到保鮮目的?？咕氖蔷哂猩锘钚缘亩嚯念愇镔|(zhì)，對(duì)綠膿桿菌、金黃葡萄桿菌等多種病菌和病毒都有明顯的殺滅效果。在醫(yī)藥中，林 蛙皮抗菌肽可起到消炎，抗感染，抗真菌、促進(jìn)傷口愈合的作用，如果將此液應(yīng)用于燒燙傷產(chǎn)品中，在防止皮膚感染、止痛鎮(zhèn)痛方面都有明顯的效果。應(yīng)用于日化產(chǎn)品中，對(duì)于皮膚無刺激性傷害，消炎殺菌消毒效果明顯。應(yīng)用于果蔬保鮮能明顯延長保鮮期，應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)可提高家畜免疫力，提高攔存活率。已有從林娃表皮中提取抗菌肽的方法。如《吉林工學(xué)院學(xué)報(bào)》自然科學(xué)版2002年第2期發(fā)表了邱芳萍、周杰文章“從吉林林蛙皮中提取抗菌肽”，其方法是原料蛙皮、溶脹、抽提、離心制得。再如《食品科學(xué)》2008年第10期發(fā)表了金莉莉；丁忠福；王秋雨文章“中國林蛙皮抗菌肽提取條件的優(yōu)化研究”，其方法是原料蛙皮、浸提、冷凍干燥制得。中國發(fā)明專利申請(qǐng)說明書于2009年06月17日公開了一種名稱為“林蛙抗菌肽及制備工藝和在抗病毒藥物中的應(yīng)用”，專利申請(qǐng)?zhí)?200810051423.0 申請(qǐng)日:2008.11.14。該發(fā)明公開了一種林蛙抗菌肽及其制備工藝，包括以下步驟:(I)將林蛙干蛙皮，用pH4.00.2mol / L的醋酸-醋酸鹽緩沖溶液以料液比為1:8-12 (m / v)的比例室溫浸泡20— 30小時(shí)；(2)將所得浸提液5000r.p.m離心30min，棄沉淀，留上清；將上清液再煮沸5min，冷卻，5000r.p.m離心30min，取上清過30KDa膜即得抗菌肽濾液。其缺點(diǎn)是原料直接采用林蛙皮，林蛙皮剝皮困難，并且費(fèi)工費(fèi)時(shí)，損失浪費(fèi)嚴(yán)重。按此工藝得到的抗菌肽濾液其抗菌效果不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種工藝優(yōu)化、生產(chǎn)效率高、抗菌活力顯著的生物抗菌肽生產(chǎn)工藝及其制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，采用除塵除雜除脂除卵的林蛙干體為原料制備。一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其步驟如下: (I)原料:林蛙干體；之前進(jìn)行常規(guī)除脂除卵去塵除雜處理。(2)加10-20倍于蛙體的4-8%醋酸于10_30°C溶脹0.5-1.5小時(shí)。(3)將溶脹后的蛙體及醋酸液，在功率為100-250W，頻率為20_60kHz超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行超聲提取至少一次，提取時(shí)間10 - 40分鐘(常溫)；過濾，得提取液。(4)提取液在3000-10000ρ.r.m/10-20min條件下離心,棄去沉淀,收集上清液。(5)在35°C _65°C溫度下加熱5_15min，然后降至5_10°C過濾。(6)按步驟(3)、(4)重復(fù)操作1-3次；合并上清液，再按步驟(5)進(jìn)行，得抗菌肽濾清液。或在步驟(5)后，將抗菌肽濾清液在30-60°C和-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/3-1/10體積，抗菌肽濃縮液于0-4°C條件下保存。一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其步驟如下:
(I)取林蛙干體50g，進(jìn)行去塵除雜處理。(2)加15倍于蛙體的6%醋酸750mL于15°C溶脹0.3小時(shí)。(3)溶脹后的蛙體，放入功率為150W，頻率為30kHz的超聲波中提取10分鐘；在步驟(2)、(3)同樣條件下，再提取I次。(4)合并提取液,在5000p.r.m, 15min離心，棄去沉淀，收集上清，重復(fù)操作步驟
(3)、(4)兩次。(5)合并上清液，在55°C環(huán)境下加熱IOmin后降至10°C過濾。
(6)在45°C環(huán)境下，在-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/5體積。(7)收集濃縮液于4°C條件下保存。上述方法獲得的抗菌肽具有如下特征；
(I)熱穩(wěn)性:抗菌肽60°C 6小時(shí)不失活，95°C IOmin還有活力。(2) pH值穩(wěn)定性:在口112-6范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，最適合？!1值3.5。(3)等電點(diǎn):用pH值調(diào)節(jié)采用吸光度法測定林蛙抗菌肽pi值，pi值為8.0-10.5的堿性多肽。(4)分子量:采用凝膠過濾層析法、聚丙稀酰氨垂直板電泳法及激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法，測得分子量為4KD a。超聲提取法是利用超聲波的空化作用、機(jī)械作用等加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解的方法，當(dāng)大能量的超聲波作用于介質(zhì)時(shí)，介質(zhì)被撕裂成許多小空穴，這些小空穴瞬時(shí)閉合，并產(chǎn)生高達(dá)幾千個(gè)大氣壓的瞬間壓力，使整個(gè)生物體細(xì)胞壁的破裂在瞬間完成，縮短了破碎時(shí)間，同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而顯著提高提取效率，提高有效成分析出，最終提高了林蛙抗菌肽抑菌活性。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):1、以林蛙干體為原料，直接提取，省掉人工扒皮的繁瑣工序，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度、節(jié)省原材料，降低生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，符合工業(yè)化生產(chǎn)。2、增加超聲波提取步驟，代替了以前傳統(tǒng)的藥物浸提、離心處理蛙皮提取抗菌肽的工藝制備方法，加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而顯著提高提取效率，優(yōu)化了提取工藝，最終提高了林蛙抗菌肽抑菌活性。經(jīng)試驗(yàn)，以相同質(zhì)量的林蛙干(皮)進(jìn)行提取，在提取液體積相同的條件下，超聲提取林蛙干抗菌肽，抑菌活性更高。3、所制備的林蛙抗菌肽產(chǎn)品具有廣譜殺菌作用。對(duì)假銅綠單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、傷感桿菌、白色念珠菌等都具有很強(qiáng)的抑菌作用?？蓮V泛的應(yīng)用于藥品、食品、水果及蔬菜保鮮、日用化妝品及飼料添加劑等領(lǐng)域。


圖1是林蛙抗菌肽液對(duì)綠膿桿菌抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。圖2是林蛙干多肽對(duì)綠膿桿菌抑菌活性圖。圖3是采用不同提取方法及不同林蛙體(干)多肽與浸提提取林蛙皮多肽對(duì)綠膿桿菌抑菌圈大小比較圖。圖4是采用不同提取方法及不同林蛙干(皮)多肽與浸提提取林蛙皮多肽對(duì)綠膿桿菌抑菌活性比較圖。圖5是實(shí)驗(yàn)例3多菌抑菌活性比較圖。參見圖6是實(shí)驗(yàn)例3中綠膿桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果一組圖。參見圖7是實(shí)驗(yàn)例3中大腸桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果一組圖。參見圖8是實(shí)驗(yàn)例3中金葡菌株抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果一組圖。參見圖9是實(shí)驗(yàn)例3中傷寒桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果一組圖。參見圖10是抗菌肽對(duì)溫度的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)圖。下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不限于此。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法:1、取脫脂除卵林蛙干體50g，進(jìn)行去塵除雜處理。2、加10倍于蛙體的5%醋酸500 mL于10°C溶脹0.2小時(shí)。3、將溶脹后的蛙體及10倍于蛙體的5%醋酸液，一起放入功率為100W，頻率為20kHz的超聲波中提取15分鐘。在2、3同樣條件下，再提取I次。
4、合并提取液,在3000p.r.m, 20min離心，棄去沉淀，收集上清，按3、4步驟再操作I次。5、合并上清液，在50°C環(huán)境下加熱5min后降至10°C過濾。6、在35°C環(huán)境下，在-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/3體積。7、收集濃縮液于4°C條件下保存。實(shí)施例2
一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法:1、取林蛙干體50g，進(jìn)行去塵除雜處理。2、加15倍于蛙體的6%醋酸750 mL于15°C溶脹0.3小時(shí)。3、溶脹后的蛙體，放入功率為150W，頻率為30kHz的超聲波中提取10分鐘。在2、3同樣條件下，再提取I次。4、合并提取液,在5000p.r.m, 15min離心,棄去沉淀,收集上清,可重復(fù)操作3、4步驟2次。5、合并上清液，在55°C環(huán)境下加熱IOmin后降至10°C過濾。6、在45°C環(huán)境下，在-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/5體積。
7、收集濃縮液于4°C條件下保存。實(shí)施例3
一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法:1、取林蛙干體50g，進(jìn)行去塵除雜處理。2、加20倍于蛙體的7%醋酸1000 mL于20°C溶脹0.5小時(shí)。3、溶脹后的蛙體，放入功率為200W，頻率為40kHz的超聲波中提取15分鐘。在2、3同樣條件下，再提取I次。4、合并提取液,在5000p.r.m, IOmin離心,棄去沉淀,收集上清,可重復(fù)操作3、4步驟I次。5、合并上清液，在60°C環(huán)境下加熱15min后降至10°C過濾。6、在55°C環(huán)境下,在-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/6體積。7、收集濃縮液于4°C條件下保存。實(shí)驗(yàn)例I
本發(fā)明在抑菌中的應(yīng)用:1、材料和方法1.1受試物林蛙抗菌肽液。1.2實(shí)驗(yàn)菌體假銅綠單胞桿菌(CMCC (B)IO 104)。

1.3實(shí)驗(yàn)材料直徑為5mm的新華一號(hào)定性濾紙。
1.4實(shí)驗(yàn)方法
(a)抑菌劑載體 5mm直徑圓形新華一號(hào)定性濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理后，置120 0C烤干2h，保存?zhèn)溆谩?b)抗菌肽樣片的制備:取(a)中制備的無菌并干燥的濾紙片，每片滴加抗菌肽液5 u L,備用。(c)陰性對(duì)照樣片的制備:取無菌干燥濾紙片，每片滴加相同pH醋酸液5 μ L，備用。(d)抑菌劑樣片貼放:每次試驗(yàn)貼放I個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片抗菌肽樣片，I片陰性對(duì)照樣片，共5片。用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距25mm以上，與平板的周緣相距15mm以上。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37°C恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12h觀察結(jié)果。用菌落分析儀測量抑菌環(huán)的直徑(包括貼片)并記錄。1.5測試結(jié)果:抗菌肽樣品對(duì)綠膿桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖1。圖1中間樣品為陰性對(duì)照樣片，周圍為抗菌肽樣片。實(shí)驗(yàn)例2
生理活性實(shí)驗(yàn):采用濾紙片法測定抗菌肽提取液的活性。經(jīng)測定，利用超聲波提取蛙體中的抗菌肽可抑制多種革蘭氏陽性、陰性細(xì)菌及真菌，用不同方法在林蛙皮和林蛙體中提取抗菌肽對(duì)綠濃桿菌抑菌活性情況對(duì)照。參見圖2，林蛙干多肽對(duì)綠膿桿菌抑菌活性的抑菌圈清晰并比較大，抑菌活力強(qiáng)。

參見圖3，采用不同提取方法及不同林蛙體(干)多肽與浸提提取林蛙皮多肽對(duì)綠膿桿菌抑菌圈大小比較，超聲提取林蛙干多肽的抑菌圈清晰并比較大(甚至比超聲提取林蛙皮多肽的抑菌圈更清晰，更大)，抑菌活力強(qiáng)。上面圖中間樣品為陰性對(duì)照樣片，周圍為抗菌肽樣片。參見圖4，采用不同提取方法及不同林蛙干(皮)多肽與浸提提取林蛙皮多肽對(duì)綠膿桿菌抑菌活性比較，超聲提取林蛙干多肽的抑菌圈直徑最大。綜上，從對(duì)比結(jié)果看出，以相同質(zhì)量的林蛙干(皮)進(jìn)行提取，在提取液體積相同的條件下，超聲提取林蛙干抗菌肽，抑菌活性更高。
實(shí)驗(yàn)例3
本發(fā)明提取的抗菌肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷感桿菌、綠膿桿菌等都具有很強(qiáng)的抑菌作用。本發(fā)明提取的抗菌肽生產(chǎn)制劑抑菌效果與上市的同類同功能產(chǎn)品對(duì)比，見下表格，并參見圖5。
權(quán)利要求
1.一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其特征在于采用除塵除雜除脂除卵的林蛙干體為原料制備。
2.如權(quán)利要求書I所述的一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其特征在于其步驟如下: (O原料:林蛙干體； (2)加10-20倍于蛙體的4-8%醋酸于10-30°C溶脹0.5-1.5小時(shí)； (3)將溶脹后的蛙體及醋酸液，在功率為100-250W，頻率為20-60kHz超聲波發(fā)生器內(nèi)進(jìn)行超聲提取至少一次；提取時(shí)間10 - 40分鐘，過濾，得提取液； (4)提取液,在3000-10000p.r.m/10-20min條件下離心,棄去沉淀,收集上清液； (5)在35°C_65°C溫度下加熱5-15min，然后降至5_10°C過濾，得抗菌肽濾清液。
3.如權(quán)利要求書2所述的一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其特征在于按步驟(3)、(4)重復(fù)操作I 一 3次；合并上清液，再按步驟(5)進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求書3所述的一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其特征在于在步驟(5)后，將抗菌肽濾清液在30-6(TC和-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/3-1/10體積，抗菌肽濃縮液于0-4°C條件下保存。
5.如權(quán)利要求書4所述的一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其特征在于其步驟如下: (1)取林蛙干體50g ，進(jìn)行去塵除雜處理； (2)加15倍于蛙體的6%醋酸750mL于15°C溶脹0.3小時(shí)； (3)溶脹后的蛙體，放入功率為150W，頻率為30kHz的超聲波中提取10分鐘；在步驟(2)、(3)同樣條件下，再提取I次； (4)合并提取液,在5000p.r.m, 15min離心，棄去沉淀，收集上清，重復(fù)操作步驟(3)、(4)兩次； (5)合并上清液，在55°C環(huán)境下加熱IOmin后降至10°C過濾； (6)在45°C環(huán)境下，在-0.5個(gè)大氣壓條件下濃縮至1/5體積； (7)收集濃縮液于4°C條件下保存。
6.如權(quán)利要求書5所述的一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法，其特征在于抗菌肽具有如下特征； (1)熱穩(wěn)性:抗菌肽60°C6小時(shí)不失活，95°C IOmin還有活力； (2)pH值穩(wěn)定性:在PH2-6范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，最適合pH值3.5 ; (3)等電點(diǎn):用pH值調(diào)節(jié)采用吸光度法測定林蛙抗菌肽pi值，pi值為8.0-10.5的堿性多肽； (4)分子量:采用凝膠過濾層析法、聚丙稀酰氨垂直板電泳法及激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法，測得分子量為4KDa。
全文摘要
發(fā)明涉及一種利用超聲波從林蛙體中直接提取抗菌肽的生產(chǎn)制備方法。本發(fā)明的提取生物抗菌肽工藝，是以除脂除卵的林蛙干體為原料，經(jīng)過前期清洗處理，酸化處理后，采用超聲波提取，經(jīng)離心沉淀、過濾、濃縮、收集等步驟，最后制得林蛙抗菌肽濃縮液。本發(fā)明從林蛙體中直接提取抗菌肽的新工藝，操作簡單，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)率高，廣普抗菌殺菌效率明顯等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛的應(yīng)用于藥品、食品、水果及蔬菜保鮮、日用化妝品及飼料添加劑等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C07K1/14GK103073628SQ20131004426
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者林萬君, 陸軍, 滕利榮, 孟慶繁, 逯家輝, 王娟 申請(qǐng)人:通化康元生物科技有限公司