一種新的制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新的制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法。通過在體細(xì)胞中過表達(dá)若干個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，將已經(jīng)分化的體細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成了具有功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。所述細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)肝臟基因，并獲得了多種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。所述細(xì)胞可在肝臟中增殖，并重建肝臟功能。
【專利說明】-種新的制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種新的制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟是人體最重要的器官之一，調(diào)控著多種生理功能。肝臟本身具有很強(qiáng)的再生能力，但是在罹患各種肝臟疾病，包括肝炎，肝纖維化，肝癌，肝臟代謝疾病和肝功能衰竭時(shí)，肝臟逐漸失去再生能力，從而導(dǎo)致其生理功能的下降，最終危害著人們健康和生命。由于飲食、環(huán)境和遺傳等因素的影響，中國(guó)是世界上終末期肝病和急性肝衰竭發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家。
[0003]對(duì)于終末期肝病以及急性肝衰竭的治療，目前唯一有效手段是進(jìn)行肝臟移植。但是由于肝臟供體緊缺以及術(shù)后免疫系統(tǒng)對(duì)異體器官的排斥，移植手術(shù)的發(fā)展受到了嚴(yán)重的制約。最近基于肝細(xì)胞移植的技術(shù)受到廣泛的關(guān)注。其中一個(gè)在臨床上已經(jīng)使用的方法是將供體肝臟消化后得到的肝細(xì)胞移植入病人，從而使得一個(gè)供體器官可以治療若干個(gè)病人。然而該方法仍舊依賴于捐獻(xiàn)的供體器官，并且不能改變移植后的免疫排斥。此外，體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞還是一個(gè)非常好的藥物肝臟代謝模型，被制藥公司大量使用在藥物開發(fā)早期檢測(cè)代謝毒性實(shí)驗(yàn)中。因此如何獲得穩(wěn)定而大量的肝細(xì)胞來源，成為目前最迫切的需要。隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入和新技術(shù)的突破，利用干細(xì)胞或其他細(xì)胞來分化獲得肝細(xì)胞被普遍認(rèn)為是未來的發(fā)展方向 。從干細(xì)胞獲得肝臟細(xì)胞主要有以下的一些方法:
[0004]方法一、從人胚胎干細(xì)胞(hES細(xì)胞)定向分化成肝細(xì)胞。最近的研究包括中國(guó)科學(xué)家在內(nèi)的工作已經(jīng)表明，在使用特定的培養(yǎng)基和細(xì)胞因子的條件下，hES細(xì)胞可以被定向的分化成具有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。并且利用這些分化的肝細(xì)胞，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)驗(yàn)證這些細(xì)胞在體內(nèi)可以表現(xiàn)出功能。
[0005]方法二、利用來源于臍帶中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞來獲得肝細(xì)胞?，F(xiàn)有的證據(jù)表明分離純化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外分化成非常接近肝細(xì)胞的細(xì)胞，并且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞到注射肝臟內(nèi)后可以分化表達(dá)許多肝細(xì)胞特異的功能蛋白。中國(guó)的科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以改善晚期肝硬化病人的肝功能。這些研究工作都指出臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞極有可能是在體外大量獲得肝細(xì)胞的另一個(gè)來源。
[0006]方法三、上述的方法都受到了取材的限制，特別是ES細(xì)胞的獲得存在很大的倫理道德問題。此外這些干細(xì)胞并非來自病人自身，因而由其分化而來的肝細(xì)胞還是不能避免移植后免疫排斥的問題。因此有人提出用人類iPS全能干細(xì)胞定向分化成為肝細(xì)胞。將病人自身終末分化細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS全能干細(xì)胞，再定向分化iPS全能干細(xì)胞為有肝細(xì)胞功能的細(xì)胞。目前中國(guó)和美國(guó)的科學(xué)家已經(jīng)報(bào)道成功的把人類iPS細(xì)胞定向分化成了具有肝臟功能的細(xì)胞。
[0007]但是無論由ES干細(xì)胞，iPS干細(xì)胞還是臍帶干細(xì)胞定向分化獲得細(xì)胞，都不可能達(dá)到完全分化的效率，所以總有少量的干細(xì)胞存在于分化的細(xì)胞中。這些殘存的干細(xì)胞注射入動(dòng)物體內(nèi)后可以形成畸胎瘤和腺瘤，因此嚴(yán)重影響了這些細(xì)胞的應(yīng)用。最近的研究表明，B淋巴細(xì)胞可以在體外直接轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，另外成纖維細(xì)胞可以在體外直接重編程為神經(jīng)細(xì)胞。這些實(shí)驗(yàn)證據(jù)提出了這樣一種可能性，即各種不同類型的終末分化的動(dòng)物細(xì)胞之間是可以直接轉(zhuǎn)化的。
[0008]在正常生理?xiàng)l件下，人們一般認(rèn)為動(dòng)物干細(xì)胞向終末分化細(xì)胞的分化過程是單向且不可逆的。但人們也發(fā)現(xiàn)在自然界存在少量已分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪活愋图?xì)胞的例子。最典型的例子包括蠑螈的斷肢再生和果蠅成蟲足原基轉(zhuǎn)決定為翅膀。這說明已分化細(xì)胞依然能被重編程，具有可塑性。人工誘導(dǎo)細(xì)胞重編程最早成功于上世紀(jì)的五十年代。JohnGurdon用細(xì)胞核移植的方法誘導(dǎo)爪蟾成體細(xì)胞重編程并獲得成功，從而證明脊椎動(dòng)物終末分化細(xì)胞的細(xì)胞核也能被重編程到全能狀態(tài)。2006年Shinya Yamanaga等發(fā)現(xiàn)的iPS技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了成體細(xì)胞退分化為多能干細(xì)胞，從而開創(chuàng)了細(xì)胞重編程的新領(lǐng)域。
[0009]隨著細(xì)胞核移植技術(shù)和iPS技術(shù)的發(fā)展，人們又開始關(guān)注不經(jīng)歷多能干細(xì)胞階段的成體細(xì)胞之間的相互轉(zhuǎn)化。早在上世紀(jì)八十年代，人們就發(fā)現(xiàn)小鼠的纖維細(xì)胞在用小分子化合物處理或表達(dá)某些外源基因時(shí)可轉(zhuǎn)分化為成肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。而近年來，通過過表達(dá)特定的基因，人們?cè)隗w內(nèi)和體外實(shí)現(xiàn)了親緣關(guān)系較近的細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化，如:通過在B細(xì)胞中過表達(dá)C/EBPalpha和C/EBPbeta轉(zhuǎn)錄因子將B細(xì)胞重編程為巨噬細(xì)胞。最近通過在小鼠胚胎纖維細(xì)胞中過表達(dá) Ascll、Brn2和Mytl轉(zhuǎn)錄因子將其在體外重編程為神經(jīng)細(xì)胞。這些研究說明成體細(xì)胞進(jìn)行跨胚層的轉(zhuǎn)化，即親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化是可以實(shí)現(xiàn)的。
[0010]關(guān)于從其他類型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成肝細(xì)胞的研究已有近三十年的歷史。早期人們發(fā)現(xiàn)在一些特殊的病理情況下可在胰腺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)類似肝細(xì)胞的細(xì)胞。David Tosh等人通過過表達(dá)C/EBPbeta，實(shí)現(xiàn)了將與肝細(xì)胞在發(fā)育上親緣關(guān)系非常接近的胰細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞類似細(xì)胞。然而由于該實(shí)驗(yàn)使用了永生化的胰細(xì)胞株AR42J-B13作為起始細(xì)胞，該細(xì)胞株是否在傳代過程中產(chǎn)生遺傳變化并不清楚，而且對(duì)于這些細(xì)胞的體內(nèi)功能都不明確。更為重要的是，實(shí)驗(yàn)中使用了永生化的細(xì)胞系，無法了解原代培養(yǎng)的分化成體細(xì)胞是否可以在體外重編程獲得肝細(xì)胞的功能。
[0011]本發(fā)明人的前期研究中，在抑制細(xì)胞衰老機(jī)制的前提條件下，轉(zhuǎn)入3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Foxa3、Gata4、Hnfla，成功將小鼠尾巴上的纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成了肝臟細(xì)胞。這種細(xì)胞具有和體內(nèi)肝臟細(xì)胞類似的上皮細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)譜，且獲得了肝臟細(xì)胞的功能，如肝糖原積累、乙?；兔芏戎鞍椎霓D(zhuǎn)運(yùn)、藥物代謝和吲哚綠的吸收等。將轉(zhuǎn)化型肝臟細(xì)胞在移植入模擬人類酪氨酸代謝缺陷疾病的小鼠后，可像正常肝細(xì)胞一樣，在被移植的肝臟中增殖，重建受體小鼠的肝臟。小鼠的總膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶、酪氨酸等肝功能指標(biāo)均出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，瀕臨死亡的小鼠得以存活。
[0012]盡管本發(fā)明人上述工作對(duì)于研究促進(jìn)肝臟再生的材料及方法具有重大意義，但是所采用的體細(xì)胞為小鼠尾巴的纖維細(xì)胞，不能直接應(yīng)用到人類肝癌疾病的治療中。因此，進(jìn)一步開發(fā)能使人的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為具有類似功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種新的制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的方法。[0014]在本發(fā)明的第一方面，提供一種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法(優(yōu)選體外方法)，所述方法包括:在細(xì)胞中過表達(dá)以下轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:HNF4A ;選自HNFlA或HNFlB的一個(gè)或多個(gè)；和選自F0XA1、F0XA2或F0XA3的一個(gè)或多個(gè)。
[0015]在一個(gè)優(yōu)選例中，還在細(xì)胞中過表達(dá)選自以下的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:C/EBP β、GATA4、HHEX、KLF4 或 PROXl。
[0016]在另一優(yōu)選例中，在細(xì)胞中過表達(dá)以下轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:HNF4A、HNF1A、F0XA3。
[0017]在另一優(yōu)選例中，在細(xì)胞中過表達(dá)以下轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:HNF4A、HNF1B、F0XA3。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的HNF4A或其變體是:(al)SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的多肽；或(bl)在(al)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較 佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(al)多肽功能的由(al)衍生的多肽；或(Cl)與(al)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(al)多肽功能的由(al)衍生的多肽。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的HNFlA或其變體是:(a2) SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；或(b2)在(a2)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽；或(c2)與(a2)限定的蛋白序列有90%(較佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a2)多肽功能的由(a2)衍生的多肽。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的HNFlB或其變體是:(a3) SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的多肽；或(b3)在(a3)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a3)多肽功能的由(a3)衍生的多肽；或(c3)與(a3)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a3)多肽功能的由(a3)衍生的多肽。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的FOXAl或其變體是:(a4) SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽；或(b4)在(a4)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a4)多肽功能的由(a4)衍生的多肽；或(c4)與(a4)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a4)多肽功能的由(a4)衍生的多肽。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的F0XA2或其變體是:(a5)SEQ ID N0:5所示氨基酸序列的多肽；或(b5)在(a5)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a5)多肽功能的由(a5)衍生的多肽；或(c5)與(a5)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a5)多肽功能的由(a5)衍生的多肽。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的F0XA3或其變體是:(a6)SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肽；或(b6)在(a6)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽；或(c6)與(a6)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a6)多肽功能的由(a6)衍生的多肽。[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的C/EBP β或其變體是:(a7) SEQ ID N0:7所示氨基酸序列的多肽；或(b7)在(a7)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a7)多肽功能的由(a7)衍生的多肽；或(c7)與(a7)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ；更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a7)多肽功能的由(a7)衍生的多肽。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的GATA4或其變體是:(a8)SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；或(b8)在(a8)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a8)多肽功能的由(a8)衍生的多肽；或(c8)與(a8)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a8)多肽功能的由(a8)衍生的多肽。
[0026]在另一優(yōu)選 例中，所述的HHEX或其變體是:(a9) SEQ ID N0:9所示氨基酸序列的多肽；或(b9)在(a9)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(a9)多肽功能的由(a9)衍生的多肽；或(c9)與(a9)限定的蛋白序列有90%(較佳地95% ;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(a9)多肽功能的由(a9)衍生的多肽。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的KLF4或其變體是:(alO)SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的多肽；或(blO)在(alO)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(alO)多肽功能的由(alO)衍生的多肽；或(clO)與(alO)限定的蛋白序列有90%(較佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(alO)多肽功能的由(alO)衍生的多肽。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的PR0X1或其變體是:(all) SEQ ID N0:11所示氨基酸序列的多肽；或(bll)在(all)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-30個(gè)，較佳地1-20個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳地1-5個(gè)，例如1、2、3、4或5個(gè))氨基酸且具有(all)多肽功能的由(all)衍生的多肽；或(cll)與(all)限定的蛋白序列有90%(較佳地95%;更佳地98%;更佳地99%)以上同源性且具有(all)多肽功能的由(all)衍生的多肽。
[0029]在另一優(yōu)選例中，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的細(xì)胞來源于體細(xì)胞或胚胎細(xì)胞。
[0030]在另一優(yōu)選例中，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的體細(xì)胞是:成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，血液細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，胚胎細(xì)胞，組織或器官來源的細(xì)胞。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是衰老或凋亡途徑被破壞(或抑制)的細(xì)胞(包括永生化的細(xì)胞)。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞通過過表達(dá)SV40大T抗原，使得衰老或凋亡途徑被破壞。
[0033]在另一優(yōu)選例中，在體細(xì)胞中過表達(dá)所述的轉(zhuǎn)錄因子和/或SV40大T抗原的方法是:(a)提供細(xì)胞；(b)用表達(dá)載體將所述的轉(zhuǎn)錄因子或其變異體和/或SV40大T抗原轉(zhuǎn)入(a)的細(xì)胞中；(c)培養(yǎng)(b)獲得的細(xì)胞，富集獲得轉(zhuǎn)入了所述的轉(zhuǎn)錄因子或其變異體和/或SV40大T抗原的細(xì)胞，該細(xì)胞就是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
[0034]在另一優(yōu)選例中，(a)中，先將細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)若干代，較佳地為5-9代。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是病毒。更佳地，所述的病毒是慢病毒。
[0036]在另一優(yōu)選例中，首先將細(xì)胞培養(yǎng)于I型膠原上，將轉(zhuǎn)錄因子或其變異體轉(zhuǎn)入細(xì)胞0.5-3天后，更換培養(yǎng)基為iHep培養(yǎng)基；更優(yōu)選地，所述的iHep培養(yǎng)基為外加地塞米松、TGF- a、EGF、ITS、N2、B27、OSM 和 / 或其他成分的 Block，s 培養(yǎng)基。
[0037]在另一優(yōu)選例中，首先將細(xì)胞培養(yǎng)于I型膠原上，將轉(zhuǎn)錄因子或其變異體轉(zhuǎn)入細(xì)胞0.5-2天后，將培養(yǎng)基換為含有2-巰基乙醇、MEM NEAA和bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)0.5-2天后，將培養(yǎng)基換為含有地塞米松、TGF- a、EGF和ITS的改良Block’ s培養(yǎng)基。
[0038]在另一優(yōu)選例中，將轉(zhuǎn)錄因子或其變異體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中后，在第6-20天(較佳地第8-18天，更佳地10-16天，更佳地14天左右)富集具有上皮樣形態(tài)的細(xì)胞。更佳地，用胰蛋白酶處理(每次處理2-10分鐘，每隔1-3天處理一次)細(xì)胞以去除纖維細(xì)胞。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有如下一種或多種性能:1)形成上皮樣細(xì)胞克??；2)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:ALBUMIN;3)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:CK8和CK18 ；4)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:AAT，TTR，ASGPRl，GJBl ；5)積累肝糖原；6)轉(zhuǎn)運(yùn)乙?；兔芏戎鞍?；7)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:糖代謝、藥物代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、膽汁酸代謝相關(guān)基因或蛋白、調(diào)控止血和纖維蛋白溶解的基因或蛋白、第I級(jí)和第II級(jí)異源物代謝基因、分泌性蛋白基因。
[0040]在另一優(yōu) 選例中，所述的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞；更佳地，所述的細(xì)胞是人源的細(xì)胞。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的哺乳動(dòng)物包括但不限于鼠、兔、狗、猴、豬、牛、羊、馬、人
坐寸ο
[0042]在本發(fā)明的另一方面，提供一種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，所述肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞由前面所述的方法分化誘導(dǎo)產(chǎn)生。
[0043]在本發(fā)明的另一方面，提供前面所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于制備促進(jìn)肝臟再生或治療(包括緩解)肝損傷的組合物。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的肝損傷包括(但不限于):終末期肝病、肝硬化、酒精肝、糖尿病、肥胖、急性肝衰竭、肝炎、肝纖維化、肝癌、肝臟代謝疾病或肝功能衰竭導(dǎo)致的肝損傷。
[0045]在本發(fā)明的另一方面，提供前面所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于作為體外模型，進(jìn)行肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究。
[0046]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究包括:研究藥物運(yùn)輸、藥物代謝、肝形成、肝再生；或肝毒性測(cè)試、篩選肝細(xì)胞毒性化合物、篩選調(diào)節(jié)肝細(xì)胞功能化合物。
[0047]在本發(fā)明的另一方面，提供前面所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于產(chǎn)生Albumin蛋白。
[0048]在本發(fā)明的另一方面，提供前面所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于制備肝炎病毒(包括乙肝病毒、丙肝病毒等)感染模型，所述的肝炎病毒感染模型用于篩選抗肝炎病毒的藥物。
[0049]在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，所述組合物含有:(有效量的)所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于促進(jìn)肝臟再生；或治療(包括緩解)肝損失相關(guān)疾病。
[0052]在本發(fā)明的另一方面，提供一種轉(zhuǎn)錄因子組合，包括以下轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:HNF4A ;選自HNFlA或HNFlB的一個(gè)或多個(gè)；和選自FOXAl、F0XA2或F0XA3的一個(gè)或多個(gè)。
[0053]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的轉(zhuǎn)錄因子組合的用途，用于制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
[0054]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于分化誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒中含有所述的轉(zhuǎn)錄因子組合。
[0055]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自以下的一種或多種:用于過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的表達(dá)載體(如慢病毒載體)；胰蛋白酶；細(xì)胞培養(yǎng)基(如iHep培養(yǎng)基；1型膠原)。
[0056]在本發(fā)明的另一方面，提供一種促進(jìn)肝臟再生或治療(包括緩解)肝損傷的方法，所述方法包括:給予需要治療的對(duì)象有效量的所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
[0057]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1A、人iHep細(xì)胞的制備的流程示意圖。
[0059]圖1B、過 表達(dá)8因子組合(8TF)的HFF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染12天后表達(dá)肝臟基因的情況；以及8因子減去I因子(8TF-1TF)后表達(dá)肝臟基因的情況。
[0060]圖1C、過表達(dá)6因子組合(6TF)的HFF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染12天后表達(dá)肝臟基因的情況；以及6因子減去I因子(6TF-1TF)后表達(dá)肝臟基因的情況。
[0061]圖1D、過表達(dá)5因子組合(5TF)的HFF細(xì)胞表達(dá)肝臟基因情況。
[0062]圖1E、過表達(dá)5因子組合(5TF)的HFF細(xì)胞可積累肝糖原。
[0063]圖1F、過表達(dá)5因子組合(5TF)的HFF細(xì)胞能將DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。
[0064]圖1G、過表達(dá)5因子組合(5TF)的HFF細(xì)胞可分泌Albumin到培養(yǎng)基中，以H印G2細(xì)胞為陽性對(duì)照；已過表達(dá)GFP的HFF細(xì)胞作為陰性對(duì)照。
[0065]圖2A、過表達(dá)5因子組合以及5因子減去I因子(5TF-1TF)誘導(dǎo)的HFF細(xì)胞表達(dá)肝臟基因的情況。
[0066]圖2B、將轉(zhuǎn)錄因子HNFlB替換為HNFlA后誘導(dǎo)HFF細(xì)胞表達(dá)肝臟基因的情況。
[0067]圖2C、撤除三因子F0XA3，HNF1A，HNF4A組合(3TF)中的任意一個(gè)因子后過表達(dá)誘導(dǎo)的HFF細(xì)胞表達(dá)肝臟基因的情況。
[0068]圖3A、HFF過表達(dá)3因子后，第8天即有上皮樣細(xì)胞形成。
[0069]圖3B、RT_PCR分析HFF感染慢病毒(過表達(dá)3因子)之后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況。
[0070]圖3C、ELISA分析表明hiH印細(xì)胞可分泌大量Albumin到培養(yǎng)基中。
[0071]圖3D、ELISA分析表明hiH印細(xì)胞可分泌大量AAT到培養(yǎng)基中。
[0072]圖3E、免疫熒光染色表明50%的3因子誘導(dǎo)的hiH印細(xì)胞能夠共表達(dá)Albumin與AAT。
[0073]圖3F、基因表達(dá)譜分析各種細(xì)胞之間的遠(yuǎn)近關(guān)系。[0074]圖3G、PAS染色表明hiifep細(xì)胞中有大量的可被染成紅色的糖原顆粒。
[0075]圖3H、Dil-ac-LDL吸收測(cè)試驗(yàn)證hiH印細(xì)胞可將ac_LDL從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿里。
[0076]圖31、Indocyanine green (ICG)吸收測(cè)試驗(yàn)證hiHep細(xì)胞可將ICG從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)到包漿里。
[0077]圖3J、油紅O染色驗(yàn)證hiH印細(xì)胞包漿中可以積累甘油三磷酸及脂滴。
[0078]圖3L、hiHep細(xì)胞表達(dá)介導(dǎo)膽汁排泄的轉(zhuǎn)運(yùn)分子的基因情況。
[0079]圖3K、M、hiHep細(xì)胞具有分泌排泄DPDPE、CLF、TCA等代謝功能。
[0080]圖3N、hiHep細(xì)胞能夠誘導(dǎo)表達(dá)藥物代謝相關(guān)的CYP1A2。
[0081]圖4a、全基因組表達(dá)譜分析結(jié)果表明，hiH印細(xì)胞表達(dá)了大量肝特異的分泌蛋白。
[0082]圖4b、全基因組表達(dá)譜分析結(jié)果表明，hiH印細(xì)胞表達(dá)了大量肝特異的凝血因子。
[0083]圖4c、全基因組表達(dá)譜分析結(jié)果表明，hiHep細(xì)胞表達(dá)了大量肝特異的CYP450代謝酶。
[0084]圖5a、q-PCR 分析表明另一株原代人胚胎纖維細(xì)胞HFF-2不表達(dá)胚肝特異的標(biāo)志基因。
[0085]圖5b、FACS分析表明原代人胚胎纖維細(xì)胞HFF-2不表達(dá)胚肝特異的標(biāo)志基因CD133 和 EpCAM。
[0086]圖5c、過表達(dá)3因子后，HFF-2可轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞樣的hiH印細(xì)胞。
[0087]圖5d、HFF-2來源的hiHep細(xì)胞表達(dá)大量肝特異表達(dá)基因。
[0088]圖5e、PAS染色結(jié)果表明HFF-2來源的hiH印細(xì)胞也積累肝糖原。
[0089]圖5f、HFF-2來源的hiH印細(xì)胞也能轉(zhuǎn)運(yùn)ac-LDL。
[0090]圖6A、HAF過表達(dá)3因子后，第8天有上皮樣細(xì)胞形成。
[0091]圖6B、HAF(成年人纖維細(xì)胞，Human Adult Fibroblast)細(xì)胞中肝臟基因的表達(dá)情況。以肝細(xì)胞作為陽性對(duì)照；以過表達(dá)GFP的HAF細(xì)胞作為陰性對(duì)照；以β -Actin作為內(nèi)參。
[0092]圖6C、免疫熒光染色檢測(cè)表明過表達(dá)3因子誘導(dǎo)的HAF細(xì)胞能夠共表達(dá)AlbuIiiin與 ΑΑΤ。
[0093]圖6D、PAS染色表明HAF細(xì)胞來源的hiHep細(xì)胞中有大量的可被染成紅色的糖原顆粒。
[0094]圖6E、Dil-ac-LDL吸收測(cè)試表明HAF細(xì)胞來源的hiH印細(xì)胞可將ac-LDL從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿里。
[0095]圖7A、HFF過表達(dá)3因子后會(huì)有明顯的細(xì)胞增殖阻滯和細(xì)胞死亡，而表達(dá)SV40大T抗原的IiiHepu細(xì)胞有很好的增殖能力。
[0096]圖7B、通過shRNA抑制p53，RB和p21均不能讓hiH印細(xì)胞獲得增殖能力。
[0097]圖7C、hiHepLT能夠形成同時(shí)表達(dá)上皮樣細(xì)胞標(biāo)志基因Z0_1和肝臟標(biāo)志基因ALB或ASPGRl的上皮樣細(xì)胞。
[0098]圖7D、培養(yǎng)3代hi!fepLT、培養(yǎng)10代的hiH印LT，hiH印細(xì)胞中肝臟基因的表達(dá)情況。以肝細(xì)胞作為陽性對(duì)照；以過表達(dá)GFP的HFF細(xì)胞作為陰性對(duì)照；以β -Actin作為內(nèi)參。
[0099]圖7Ε、免疫熒光染色檢測(cè)hiifepLT細(xì)胞中共表達(dá)ALB和AAT的情況。[0100]圖7F、PAS染色表明hiifepLT細(xì)胞以及培養(yǎng)10代hiifepLT細(xì)胞的中有大量的可被染成紅色的糖原顆粒。
[0101]圖7G、Dil-ac-LDL吸收測(cè)試驗(yàn)證hi!fepLT細(xì)胞以及培養(yǎng)10代hiH印LT細(xì)胞可將ac-LDL從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿里。
[0102]圖7H、ELISA分析表明hiH印LT細(xì)胞以及培養(yǎng)10代hiH印LT細(xì)胞可分泌大量Albumin到培養(yǎng)基中。
[0103]圖71、基因表達(dá)譜分析iH印、iifepM、培養(yǎng)不同時(shí)間的iifepM細(xì)胞之間的遠(yuǎn)近關(guān)系。
[0104]圖8A、由HAF誘導(dǎo)的i!fepw細(xì)胞同樣能夠形成上皮樣細(xì)胞。
[0105]圖8B、由HAF誘導(dǎo)的Ifepw細(xì)胞能夠表達(dá)肝臟功能基因。
[0106]圖8C、免疫熒光染色表明由HAF誘導(dǎo)的iifepLT細(xì)胞能夠表達(dá)Albumin (ALB)與MT。
[0107]圖8D、由HAF誘導(dǎo)的Ifepw細(xì)胞也能積累肝糖原(PAS染色為紅色)。
[0108]圖8E、由HAF誘導(dǎo)的i!fepw細(xì)胞也能轉(zhuǎn)運(yùn)ac_LDL。 [0109]圖9A、hiHepLT細(xì)胞不表達(dá)胚肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因。
[0110]圖9B、免疫熒光染色表明hiifepLT細(xì)胞不表達(dá)EpCAM。
[0111]圖9C、hiHepLT細(xì)胞不表達(dá)膽管上皮細(xì)胞相關(guān)基因。
[0112]圖9D、hiHepLT細(xì)胞經(jīng)過3D培養(yǎng)不能形成膽管。
[0113]圖10A、hiH印μ細(xì)胞經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后仍具有正常的染色體數(shù)目。
[0114]圖lOB'hiifepLT細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)不能形成腫瘤。
[0115]圖11A、移植hiH印LT細(xì)胞到FahiRagZv-(FA)小鼠的實(shí)驗(yàn)流程。
[0116]圖11B、移植或不移植hiifepu細(xì)胞的F/R小鼠的存活曲線。
[0117]圖11C、移植或不移植hiHepw細(xì)胞的F/R小鼠血清中ALT和AST的水平。
[0118]圖11D、移植或不移植hi!fepLT細(xì)胞的F/R小鼠血清中人ALBUMIN的水平。
[0119]圖11E、免疫組化染色結(jié)果表明移植hiifepu細(xì)胞的F/R小鼠肝臟切片中存在共染FAH和人AAT蛋白的細(xì)胞，而未移植IiiHepw細(xì)胞的F/R小鼠肝臟切片中則不存在。
[0120]圖11F、免疫組化染色和H&E染色結(jié)果表明移植hiHepU細(xì)胞的F/R小鼠肝臟中，共染FAH和人AAT蛋白的細(xì)胞具有正常的組織結(jié)構(gòu)。
[0121]圖11G、PCR結(jié)果分析表明移植hiifepU細(xì)胞的F/R小鼠肝臟基因組DNA中存在人特異的ALU序列。
[0122]圖11H、移植hi!fepu細(xì)胞的F/R小鼠血清中人ALBUMIN、ALT、AST和總膽紅素的水平與外源hiifepLT細(xì)胞的整合效率匹配。
[0123]圖12A、將用 alginate-poly-L-lysine-alginate 微膠囊包裹的 hiHepLT 細(xì)胞移植到ConA誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝炎導(dǎo)致急性肝衰竭小鼠模型中的實(shí)驗(yàn)流程。
[0124]圖12B、hi!fepLT 細(xì)胞包裹到 alginate-poly-L-lysine-alginate 微膠囊中的形態(tài)。
[0125]圖12C、暴發(fā)性肝炎小鼠在移植或不移植微膠囊包裹的hiifepLT細(xì)胞情況下的存活曲線。
[0126]圖12D、暴發(fā)性肝炎小鼠在移植微膠囊包裹的1?Ηθρ?Τ細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的血清中ALT和AST的水平。
[0127]圖12E、暴發(fā)性肝炎小鼠在移植微膠囊包裹的hiHepw細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的血清中人ALBUMIN的水平。[0128]圖12F、暴發(fā)性肝炎小鼠在移植微膠囊包裹的hiifepLT細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟情況。
[0129]圖12G、暴發(fā)性肝炎小鼠在移植微膠囊包裹的hiifepLT細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)的肝臟切片的H&E染色情況。
[0130]圖13A、丙肝病毒的受體 CD81、SRB1、CLDN1 和 Occludin。
[0131]圖13B、hi!fep細(xì)胞也和經(jīng)典的丙肝病毒感染模型Huh7.5.1細(xì)胞一樣，可被攜帶螢光素酶的丙肝假病毒感染。
【具體實(shí)施方式】
[0132]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，通過在體細(xì)胞(較佳地為人的體細(xì)胞)中過表達(dá)若干個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，將已經(jīng)分化的體細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成了具有功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(hiHep細(xì)胞)。所述細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，表達(dá)肝臟基因，并獲得了多種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的功能。所述細(xì)胞可在肝臟中增殖，并重建肝臟功能。
[0133]術(shù)語
[0134]如本文所用，除非另外說明，所述的“細(xì)胞”或“用于過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞”是指多種類的細(xì)胞，只要其能夠在轉(zhuǎn)入所述的轉(zhuǎn)錄因子后形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。較佳地，所述的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞或胚胎細(xì)胞；更佳地，所述的細(xì)胞是上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、血液細(xì)胞，神 經(jīng)細(xì)胞，胚胎細(xì)胞，組織或器官來源的細(xì)胞。所述的細(xì)胞可以是已經(jīng)分化或未分化的。相對(duì)于同一個(gè)體，盡管有不同的體細(xì)胞種類，但各種體細(xì)胞的基因組序列均是相同的、其主要組成部分也基本相同，因此易于理解各種體細(xì)胞均可用于本申請(qǐng)，只要其能夠在轉(zhuǎn)入所述的轉(zhuǎn)錄因子后形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
[0135]高等動(dòng)物的動(dòng)物體內(nèi)有大約300種不同的分化細(xì)胞。大部分的成體分化細(xì)胞與全能干細(xì)胞一樣，攜帶有完整的遺傳信息。造成不同分化細(xì)胞之間的主要區(qū)別是細(xì)胞的表觀遺傳修飾的不同，導(dǎo)致細(xì)胞特異基因表達(dá)的不同。成體細(xì)胞的表觀遺傳修飾是可以被修飾的，從而實(shí)現(xiàn)不同細(xì)胞間的轉(zhuǎn)化。比如成體細(xì)胞已被證明可以被重編程到全能干細(xì)胞，最近一些研究發(fā)現(xiàn)通過過表達(dá)某些基因，也可以實(shí)現(xiàn)將小鼠胚胎纖維細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)細(xì)胞。
[0136]如本文所用，所述的“肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞”是指能形成上皮樣細(xì)胞克隆，能夠表達(dá)肝臟基因(如:ALBUMIN、CK8、CK18、AAT、ASGRU CLDN2等)，并可在肝臟中增殖，具有重建肝臟功倉(cāng)泛。
[0137]如本文所用，所述的“過表達(dá)”是指細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的含量(如表達(dá)量)超過初始細(xì)胞(未轉(zhuǎn)入該外源基因的細(xì)胞)的水平；如與初始細(xì)胞相比，其含量高20%，較佳地高50% ;更佳地高100%以上，如高200%，300%...500%或更高。一種“過表達(dá)”的情形是將外源的轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中且發(fā)生表達(dá)。
[0138]如本文所用，所述的“低表達(dá)”是指細(xì)胞中某一基因含量(如表達(dá)量)顯著低于其正常水平(如與野生型細(xì)胞相比，其表達(dá)量低20%，較佳地低50% ;更佳地低100%以上，如低200%, 300%...500%或更低)，所述的低表達(dá)還包括不表達(dá)的情況。低表達(dá)可通過基因敲除、基因沉默、蛋白抑制等本領(lǐng)域熟知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。
[0139]如本文所用，所述的“哺乳動(dòng)物”是脊索動(dòng)物門(Chordata)脊椎動(dòng)物亞門(Vertebrata)哺乳綱(Ma_alia)的動(dòng)物。本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物包括人,也包括非人哺乳動(dòng)物。所述的非人哺乳動(dòng)物例如是小鼠、大鼠、兔、狗、兔、猿猴、豬、牛、羊、馬等等。不管是非人哺乳動(dòng)物還是人，在基因組的組成、個(gè)體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機(jī)制等方面都非常接近。在進(jìn)化過程中，一些關(guān)鍵的細(xì)胞功能或者調(diào)控通路在不同的物種之間是非常保守的。比如細(xì)胞增殖、凋亡的信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中基本一致。細(xì)胞的衰老途徑也是一個(gè)非常保守的調(diào)控機(jī)制。
[0140]轉(zhuǎn)錄因子及用途
[0141]本發(fā)明人選定了 9種轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)這9種轉(zhuǎn)錄因子在導(dǎo)入細(xì)胞中過表達(dá)后，可以使非肝細(xì)胞形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。所述的9種轉(zhuǎn)錄因子以及它們的GenBank登錄號(hào)如表1。
[0142]表1
[0143]
【權(quán)利要求】
1.一種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述方法包括:在細(xì)胞中過表達(dá)以下轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:
HNF4A ； 選自HNFlA或HNFlB的一個(gè)或多個(gè)；和 選自FOXAl、F0XA2或F0XA3的一個(gè)或多個(gè)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還在細(xì)胞中過表達(dá)選自以下的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:
C/EBP β、GATA4、HHEX、KLF4 或 PROXl。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的細(xì)胞來源于體細(xì)胞或胚胎細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的體細(xì)胞是:成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞，血液細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞，胚胎細(xì)胞，組織或器官來源的細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是衰老或凋亡途徑被破壞的細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞通過過表達(dá)SV40大T抗原，使得衰老或凋亡途徑被破 壞。
7.如權(quán)利要求1或6所述的方法，其特征在于，在體細(xì)胞中過表達(dá)所述的轉(zhuǎn)錄因子和/或SV40大T抗原的方法是: (a)提供細(xì)胞； (b)用表達(dá)載體將所述的轉(zhuǎn)錄因子或其變異體和/或SV40大T抗原轉(zhuǎn)入(a)的細(xì)胞中； (c)培養(yǎng)(b)獲得的細(xì)胞，富集獲得轉(zhuǎn)入了所述的轉(zhuǎn)錄因子或其變異體和/或SV40大T抗原的細(xì)胞，該細(xì)胞就是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞具有如下一種或多種性倉(cāng)泛: 1)形成上皮樣細(xì)胞克??； 2)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:ALBUMIN; 3)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:CK8和CK18; 4)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:AAT，TTR,ASGPRl，GJBl ； 5)積累肝糖原； 6)轉(zhuǎn)運(yùn)乙酰化低密度脂蛋白； 7)表達(dá)選自以下的一種或多種基因或蛋白:糖代謝、藥物代謝、脂肪酸代謝、膽固醇代謝、膽汁酸代謝相關(guān)基因或蛋白、調(diào)控止血和纖維蛋白溶解的基因或蛋白、第I級(jí)和第II級(jí)異源物代謝基因、分泌性蛋白基因。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞；更佳地，所述的細(xì)胞是人源的細(xì)胞。
10.一種肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其特征在于，所述肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞由權(quán)利要求1-9任一所述的方法分化誘導(dǎo)產(chǎn)生。
11.權(quán)利要求10所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于制備促進(jìn)肝臟再生或治療肝損傷的組合物。
12.權(quán)利要求10所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于作為體外模型，進(jìn)行肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述的肝臟相關(guān)疾病或藥物的研究包括: 研究藥物運(yùn)輸、藥物代謝、肝形成、肝再生；或 肝毒性測(cè)試、篩選肝細(xì)胞毒性化合物、篩選調(diào)節(jié)肝細(xì)胞功能化合物。
14.權(quán)利要求10所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途,用于產(chǎn)生Albumin蛋白。
15.權(quán)利要求10所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的用途，用于制備肝炎病毒感染模型，所述的肝炎病毒感染模型用于篩選抗肝炎病毒的藥物。
16.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有: 權(quán)利要求10所述的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞；以及藥學(xué)上可接受的載體。
17.一種轉(zhuǎn)錄因子組合；包括以下轉(zhuǎn)錄因子或其變異體:
HNF4A ； 選自HNFlA或HNFlB的 一個(gè)或多個(gè)；和 選自FOXAl、FOXA2或FOXA3的一個(gè)或多個(gè)。
18.權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)錄因子組合的用途，用于制備肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。
19.一種用于分化誘導(dǎo)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒中含有權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)錄因子組合。
20.如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其特征在于，還含有選自以下的一種或多種: 用于過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的細(xì)胞； 轉(zhuǎn)錄因子或其變異體的表達(dá)載體； 胰蛋白酶； 細(xì)胞培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103981147SQ201310050796
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月8日
【發(fā)明者】惠利健, 黃鵬羽, 張魯?shù)? 高義萌 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院