專利名稱：核桃降血壓活性肽及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核桃降血壓活性肽及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
核桃為胡桃科胡桃屬植物，是世界四大干果之一。核桃油中飽和脂肪酸總量一般小于10%，不飽和脂肪酸主要有油酸、亞油酸和亞麻酸，總量約90%，為人體必需的脂肪酸，對調(diào)節(jié)生理機(jī)能有重要作用。核桃仁中蛋白的含量約為15%，其中含有18種氨基酸，8種人體必需氨基酸，且含量合理，接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，是一種很好的木本植物蛋白。核桃制油剩余的核桃柏占核桃仁重量的40%-60%，其中蛋白含量在30%以上，多被用作動物飼料原料，造成資源浪費(fèi)。因此對核桃進(jìn)行深加工，通過提取核桃蛋白對其進(jìn)行再利用，既可提高核桃加工的附加值，又可以充分利用核桃蛋白資源。核桃多肽一般由3-20個氨基酸組成，采用適當(dāng)?shù)牡鞍酌笇颂业鞍走M(jìn)行水解，可獲得具有一定生物活性的核桃蛋白肽，其活性主要包括抗氧化、提高免疫力、降血壓活性等。已有發(fā)明專利涉及酶解核桃蛋白制備核桃肽的技術(shù)，但對核桃肽的具體生物活性未作明確界定。制備小分子多肽的方法主要包括化學(xué)水解法和生物酶解法。生物酶解法與化學(xué)水解法制備核桃肽相比，具有反應(yīng)條件溫和，氨基酸受損較少，可以獲得特定肽段的優(yōu)勢，但同時存在水解時間較長，短肽得率較低等缺點(diǎn)。酶解之后得到核桃混合多肽，多具有較重的苦味，影響了在食品加工中的應(yīng)用。根據(jù)前面述及的核桃蛋白肽制備中存在的問題，選用合適的蛋白酶和酶解工藝，結(jié)合輔助方式提高核桃肽得率，脫除核桃肽的苦味，提高核桃肽的生物活性，對核桃產(chǎn)品多樣化和保健食品及藥品的開發(fā)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種核桃降血壓活性肽及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的核桃降血壓活性肽的制備方法，包括如下步驟:將核桃蛋白變性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；將所述核桃肽經(jīng)分子量分級后脫苦，獲得核桃降血壓活性肽；為了提高酶解效率和短肽得率，所述變性按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述核桃蛋白配制成濃度為30— 80g/L(如30、50或80g/L)的水溶液，得到核桃蛋白液；將所述核桃蛋白液依次進(jìn)行微波處理和超聲波處理；在所述微波處理中，微波的頻率為2450MHz，功率為每升所述核桃蛋白液100-1000W (如100,500或1000W)，處理時間為10-15分鐘(如
10、12或15分鐘);在所述超聲波處理中，超聲波的頻率為40— 60kHz (如40、50或60kHz)，處理時間為20— 50分鐘(如20、30或50分鐘)；所述核桃蛋白液在進(jìn)行所述微波處理時的起始溫度為25°C。在上述方法中，為了較少地引入鹽離子，所述蛋白酶為中性蛋白酶，具體可為枯草芽孢桿菌中性蛋白酶；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000— 2000U (如1000、1500或2000U)的所述蛋白酶進(jìn)行；所述酶解的溫度為45°C—55°C (如45、48或55°C);所述酶解的pH值為6.0—6.8 (如6.0,6.4或6.8);所述酶解的時間為2—4小時(如2、3或4小時)；所述酶解的pH值使用Imo I/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。在上述方法中，所述分子量分級按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述核桃肽依次通過0.45 i! m微濾膜、SkD超濾膜和IkD超濾膜，收集透過所述IkD超濾膜的核桃肽；所述超濾膜具體可為再生纖維素膜。在上述方法中，所述脫苦按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:45°C—60°C (如45、50或60°C)條件下，將所述透過所述IkD超濾膜的核桃肽與P -環(huán)狀糊精以100: (16—20)(如100:16、100:18或100:20)的質(zhì)量比混合包埋處理10—20分鐘(如10、15或20分鐘)。所述透過所述IkD超濾膜的核桃肽在所述混合包埋的體系中的濃度為20—80g/L(如 20、50 或 80g/L)。所述脫苦后的產(chǎn)物可通過真空冷凍干燥，制成核桃肽粉，以方便儲運(yùn)、用作其他劑型和相關(guān)廣品的加工；所述真空冷凍干燥按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述脫苦后的產(chǎn)物于-50°C -45°C條件下預(yù)凍5小時后，于物料隔板溫度10°C，真空度為5 — 30Pa條件下進(jìn)行真空冷凍干燥，直至物料溫度升至5°C 10°C，得到粉狀的所述核桃降血壓活性肽，包裝后得到成品。在上述方法中，所述核桃蛋白可通過商業(yè)途徑購買，也可按照包括如下步驟的方法制備:取質(zhì)量比為(5—10): 100 (如5:100、8:100或10:100)的核桃柏和水混合，浸泡30分鐘后打漿，用 0.1—0.9mol/L(如 0.1、0.8 或 0.9mol/L)的 NaOH 溶液調(diào) pH 值至 7.5—8.4(如7.5、8.0或8.4)，于55°C下攪拌1.5—2小時(即進(jìn)行堿溶)，離心，去油層，取上清液，用3mol/L檸檬酸溶液將所述上清液的pH值調(diào)至4.6—6.5 (如4.6、5.0或6.5)，離心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白； 將所述沉淀用水溶解后，進(jìn)行冷凍干燥，得到核桃蛋白粉。本發(fā)明保護(hù)上述任一所述方法制備得到的核桃降血壓活性肽。本發(fā)明保護(hù)所述核桃降血壓活性肽在制備降血壓產(chǎn)品(或藥物)中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的核桃降血壓活性肽為淺黃色粉末，分子量在300-1200Da之間，精氨酸的摩爾百分比為14.72%，谷氨酸摩爾百分比為17.29%。該活性肽具有良好的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性和體內(nèi)降血壓活性。在核桃降血壓活性肽濃度為1.0mg/mL時，ACE抑制率為84.26%，一次給藥劑量為150— 300mg/kg即對SHR(原發(fā)性高血壓大鼠)有顯著降血壓效果，且對SHR的心率無影響；多次給藥劑量以每天150mg/kg、300mg/kg、900mg/kg劑量喂養(yǎng)的SHR大鼠在9天后，SBP (尾動脈收縮壓)與空白對照組相比有極顯著降低，300mg/kg以上劑量喂養(yǎng)的SHR大鼠在21天后，SBP與空白對照組相比有顯著降低。本發(fā)明所提供的核桃降血壓活性肽制備方法與其他方法相比，采用了微波結(jié)合超聲波預(yù)處理方式，使核桃蛋白適度變性，提高了核桃蛋白水解程度，增加了核桃肽得率，提高了制備效率。通過超濾分級，使降血壓活性較高的肽段得到富集，使該分子量肽段比例顯著增加，純度提高。本發(fā)明方法制備核桃肽具有顯著的體內(nèi)、體外降血壓活性，容易吸收，感官品質(zhì)良好，可廣泛地應(yīng)用到功能食品、保健品、食品添加劑中。


圖1為本發(fā)明核桃降血壓肽的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的結(jié)果如無特別說明，均為三次重復(fù)的平均值。下述實(shí)施例中的核桃柏為核桃制油后的剩余物，其蛋白含量為70% — 75%，購自北京綠湖工貿(mào)公司，也可用螺旋榨油機(jī)榨油后收集。實(shí)施例1、核桃降血壓肽的制備 將核桃蛋白變性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；將所述核桃肽經(jīng)超濾分級后脫苦，獲得核桃降血壓肽；具體步驟如下:1、核桃蛋白的制備取質(zhì)量比為5:100的核桃柏和水混合，浸泡30分鐘后打漿，用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)PH值至7.5，于55°C下攪拌1.5小時(即進(jìn)行堿溶)，離心，去油層，取上清液，用3mol/L檸檬酸溶液將所述上清液的PH值調(diào)至6.5，離心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白；將所述沉淀用水溶解后，進(jìn)行冷凍干燥，得到核桃蛋白粉。2、核桃蛋白的變性(酶解預(yù)處理)將步驟I得到的所述核桃蛋白或核桃蛋白粉配制成濃度為30g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；將所述核桃蛋白液依次進(jìn)行微波處理和超聲波處理；在所述微波處理中，微波的頻率為2450MHz，功率為每升所述核桃蛋白液100W，處理時間為15分鐘；在所述超聲波處理中，超聲波的頻率為40kHz，處理時間為50分鐘；所述核桃蛋白液在進(jìn)行所述微波處理時的起始溫度為25°C。3、核桃蛋白的酶解將經(jīng)步驟2預(yù)處理的核桃蛋白液用枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(購自北京奧博興生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄編號:01-080)進(jìn)行酶解；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000U的所述中性蛋白酶進(jìn)行；所述酶解的溫度為45°C;所述酶解的pH值為6.0 ;所述酶解的時間為2小時；所述酶解的pH值使用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。經(jīng)上述酶解后的酶解液升溫至90°C滅酶10分鐘，冷卻，調(diào)pH至4.5，離心去掉未分解蛋白及雜質(zhì)，取上清液，即核桃肽液。4、核桃肽的分子量分級將步驟3得到的核桃肽液依次通過0.45 U m微濾膜、SkD再生纖維素膜和IkD再生纖維素膜，收集透過所述IkD再生纖維素膜的核桃肽液，真空冷凍干燥，得到分子量在IkD左右及以下的核桃肽粉。5、核桃肽的脫苦將步驟4獲得的核桃肽粉配成50g/L的溶液，加入核桃肽粉質(zhì)量16%的P -環(huán)狀糊精，45°C下攪拌均勻，包埋處理IOmin。6、核桃降血壓肽產(chǎn)品的獲得將經(jīng)步驟5脫苦的核桃肽于_50°C _45°C冷阱中預(yù)凍5小時，于物料隔板溫度10°c，真空度為5 — 30Pa的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥，直至物料溫度升至5 10°C，得到核桃降血壓肽粉，真空包裝得到核桃降血壓肽產(chǎn)品。結(jié)果:在本實(shí)施例條件下，微波加熱及超聲波處理后酶解核桃肽得率為65.83% ；在核桃肽濃度為1.0mg/mL時，步驟4獲得的透過IkD超濾膜的核桃肽的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制率由步驟3獲得的未分級核桃肽的62.04%提高到77.19%, ACE抑制活性顯著提高；步驟4獲得的透過IkD超濾膜的核桃肽經(jīng)步驟5的包埋后，苦味值由未包埋的5降低到2，ACE抑制率與未包埋的相比降低了 2.8%。上述核桃肽得率的測定方法為三氯乙酸可溶性氮(TCA-NSI)法，具體如下:取步驟3的核桃肽液20ml，與10 %三氯乙酸(TCA)溶液震蕩混合均勻，靜置IOmin, 4000rmp/min下離心20min,取上清液進(jìn)行消化處理，即將液體樣品移入干燥的專用消煮管中，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20ml硫酸，稍搖勻后于管口放一小漏斗，放置在下有電加熱的石棉網(wǎng)上加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入IOOml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻，用全自動凱氏定氮儀測定在10% TCA中可溶性氮的含量(記為NI);取酶解前的核桃蛋白液20ml，進(jìn)行消化處理，消化方法、步驟同前所述，用全自動凱氏定氮儀測定原料中的總氮含量(記為NO)，根據(jù)公式TCA-NSI = (N1/N0) X 100%，計(jì)算得到核桃肽得率。上述血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制率的測定方法如下:取步驟4獲得的透過IkD超濾膜的核桃肽冷凍干燥，用超純水配制成一定濃度，旋渦振蕩混勻后作為待測液進(jìn)行ACE抑制率的測定；或取步驟3獲得的酶解液作為待測液進(jìn)行ACE抑制率的測定:I)將HHL溶解于含0.3mol/L氯化鈉的硼酸鹽緩沖液(0.1mol / L，pH8.3)中，得到濃度為5mmol/L的HHL溶液；2)在2mL刻度離心管中依次加入80 y L的5mmol/L的HHL溶液、IOOy L去離子水和10 ii L待測液，將此混合液放入37°C恒溫水浴中保溫3min，然后加入10 uL(0.lU/mL)ACE酶液，開始反應(yīng)。恒溫保持30min，加入0.2mL的HCl (lmol/L)，中止反應(yīng)，再加入1.2mL冷(_20°C )的乙酸乙酯,均勻混合大約15s,萃取被ACE所釋放的馬尿酸,3500r/min離心5min，將乙酸乙酯轉(zhuǎn)入另一刻度試管中，在120°C的烘箱中烘干，重新溶于去離子水中，在228nm處測定吸光值。空白對照管除在反應(yīng)前先加入0.2mL的HCl (lmol/L)中止反應(yīng)外，其余操作相同。抑制率計(jì)算公式如下:
權(quán)利要求
1.一種核桃降血壓活性肽的制備方法，包括如下步驟: 將核桃蛋白變性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；將所述核桃肽經(jīng)分子量分級后脫苦，獲得核桃降血壓活性肽； 所述變性按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述核桃蛋白配制成濃度為30— 80g/L的水溶液，得到核桃蛋白液；將所述核桃蛋白液依次進(jìn)行微波處理和超聲波處理；在所述微波處理中，微波的頻率為2450MHz，功率為每升所述核桃蛋白液100— 1000W，處理時間為10—15分鐘；在所述超聲波處理中，超聲波的頻率為40— 60kHz，處理時間為20— 50分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述蛋白酶為中性蛋白酶；所述酶解按每克所述核桃蛋白使用1000— 2000U的所述蛋白酶進(jìn)行；所述酶解的溫度為45°C—55°C;所述酶解的pH值為6.0 — 6.8 ;所述酶解的時間為2— 4小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述中性蛋白酶為枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一所述的方法，其特征在于: 所述分子量分級按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述核桃肽依次通過0.45 y m微濾膜、SkD超濾膜和IkD超濾膜，收集透過所述IkD超濾膜的核桃肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1一4中任一所述的方法，其特征在于:所述脫苦按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:45°C—60°C條件下，將所述透過所述IkD超濾膜的核桃肽與￠-環(huán)狀糊精以100: (16—20)的質(zhì)量比混合包埋處理10 — 20分鐘；所述混合包埋的體系中所述透過所述IkD超濾膜的核桃肽的濃度為20— 80g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1一5中任一所述的方法，其特征在于:所述核桃蛋白按照包括如下步驟的方法制備:取質(zhì)量比為(5—10): 100的核桃柏和水混合，浸泡30分鐘后打漿，用0.1—0.9mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.5—8.4，于55°C下攪拌1.5—2小時，離心，去油層，取上清液，用3mol/L檸檬酸溶液將所述上清液的pH值調(diào)至4.6-6.5，離心后收集沉淀，得到所述核桃蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1一6中任一所述的方法，其特征在于:所述脫苦后還包括將所述脫苦后的產(chǎn)物進(jìn)行真空冷凍干燥的步驟； 所述真空冷凍干燥按照包括如下步驟的方法進(jìn)行:將所述脫苦后的產(chǎn)物于-50°C _45°C條件下預(yù)凍5小時后，于物料隔板溫度10°C，真空度為5 — 30Pa條件下進(jìn)行真空冷凍干燥，直至物料溫度升至5°C 10°C，得到粉狀的所述核桃降血壓活性肽。
8.權(quán)利要求1-7中任一所述方法制備得到的核桃降血壓活性肽。
9.權(quán)利要求8所述核桃降血壓活性肽在制備降血壓產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了核桃降血壓活性肽及其制備方法與應(yīng)用。所述方法包括將核桃蛋白變性后用蛋白酶酶解，收集核桃肽；將所述核桃肽經(jīng)分子量分級后脫苦，獲得核桃降血壓活性肽；所述變性采用微波結(jié)合超聲波的處理方式，使核桃蛋白適度變性，提高了核桃蛋白水解程度，增加了核桃肽得率，提高了制備效率；所述脫苦是在分子量分級后進(jìn)行的，使降血壓活性較高的肽段得到富集。本發(fā)明方法獲得的核桃肽具有明確的體內(nèi)和體外降血壓活性，并用β-環(huán)狀糊精有效掩蓋了苦味，容易吸收，感官品質(zhì)良好，可廣泛地應(yīng)用到功能食品、保健品、食品添加劑中。
文檔編號C07K1/34GK103103244SQ20131005620
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者郝艷賓, 陳永浩, 齊建勛, 吳春林, 董寧光 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院