專利名稱：公斤級合成pna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種合成PNA的方法，具體涉及一種公斤級合成PNA的方法。
背景技術：
寡核苷酸在治療用藥物、分子生物學研究工具及診斷試劑上應用廣泛。寡核苷酸應用的主要制約在于它容易 被核酸酶所降解、雜交后熱穩(wěn)定性差以及會與蛋白等非特異性結合等。為改造寡核苷酸的理化和生物學特性，許多寡核苷酸類似物被研究出來。肽核酸是寡核苷酸模擬物中的較為重要的一種。1991年Nielsen等報道了用N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架代替糖-磷酸酯骨架作為重復結構單元，合成了以肽鍵連接的寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸(Peptide nucleic acid, PNA)。盡管PNA在結構上相對寡核苷酸有了顯著的改變，但PNA與互補核酸之間的結合仍遵循堿基互補配對原則，甚至比天然核苷酸具有更高的親和性，有較強的抗核酸酶和蛋白水解酶降解的能力。科研人員設計合成了各種結構的PNA，以優(yōu)化其生物學穩(wěn)定性和利用度、靶結合特性以及藥代動力學特性，并將PNA應用于診斷和治療等方面，從而開創(chuàng)了一個新的研究領域。各種各樣的構建模塊被用于合成PNA及其類似物，包括骨架結構、在N- (2-氨基乙基)甘氨酸上連接手性和非手性的基團、堿基的類型等。經典的PNA的骨架單體是N-(2-氨基乙基)甘氨酸，在甘氨酸的氮上連接堿基的衍生物。通常先合成端基N有保護基的氨基乙基甘氨酸酯，然后再將堿基衍生物連在未受保護的氮上。常用的方法有:烷基化反應、席夫堿的還原反應、Mitsunobu反應。四種堿基都是經胺的烷基化反應形成堿基乙酸衍生物，再采用通常的多肽合成的方法，聯(lián)結堿基乙酸和骨架上的未受保護的氮。胸腺嘧啶的烷基化反應通常不需要使用保護基團，因此當與溴乙酸酯反應再經皂化或直接與溴乙酸反應即可得胸腺嘧啶乙酸。其余三種堿基上都有活潑基團，需先加以保護。胞嘧啶上的活潑基團為4位上的氨基，可選擇的保護基有:節(jié)氧羰基(benzyloxycarbonyl, Cbz)、對叔丁基苯甲酰基(4-tert-butylbenzoyl,4-t_BuBz)、苯甲酸基(benzoyl, Bz)以及 Mmt 等，再與溴乙酸酯進行烷基化反應，然后皂化即得胞嘧啶乙酸的衍生物。腺嘌呤的保護過程與胞嘧啶基本相同，可用的保護基有Cbz, Mmt,對甲氧基苯基(anisoly, An)。鳥嘌呤的保護比較復雜,需要在N9的烷基化的過程中避免N7烷基化的副反應干擾。一種常用的方法是在烷基化中用2-氨基-6-氯嘌呤，烷基化后再在酸性或堿性條件下回流，將氯水解轉化為羰基，或是直接烷基化N2連有保護基的腺嘌呤，色譜分離N7/N9兩種烷基化產物，然后皂化得鳥嘌呤乙酸的衍生物。目前國內已經有部分公司可以定制合成PNA系列產品，但是他們的合成規(guī)模很小，一般在毫克級別，這種局面大大制約了 PNA這種化合物的應用以及研究工作。

發(fā)明內容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種公斤級合成PNA的方法，不通過柱層析的方法，大量生產高純度的PNA。為實現(xiàn)上述技術目的，達到上述技術效果，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn):公斤級合成PNA的方法，包括以下步驟:步驟I) I升三口瓶裝入500毫升乙二胺，冰浴冷卻至10度，將75克氯乙酸分批加入控制溫度在10度以下，每批加完后，觀察完全消耗掉之后再加下一批，加料完畢后，室溫過夜反應，將乙二胺旋干，回收乙二胺可以循環(huán)使用，用油泵將乙二胺盡可能去除干凈，用DMSO重結晶得到白色粉末狀晶體，為N-(2-氨乙基)甘氨酸；步驟2)將50克N-(2-氨乙基)甘氨酸溶于850毫升二氯甲烷和50毫升DMF的混合溶液中，加入134毫升(1.05mol)三甲基氯硅烷，反應混合物室溫攪拌40分鐘，然后冷卻至5度，將134克Fmoc-OSu加入上面混合物中，在5度下滴加NMM186毫升，30分鐘滴完，在此溫度下攪拌2小時，然后加入100毫升甲醇，再攪拌20分鐘，加入I升乙酸乙酯，20分鐘后過濾固體，用乙酸乙酯洗滌，產品粉末旋干，產品水中打漿洗滌，過濾水洗，干燥得到純品，為N- (2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸；步驟3)將12克N-(2-Fm0C-氨乙基)甘氨酸溶于100毫升的無水甲醇中，7.72毫升二氯亞砜在冰浴下滴入，滴完后此溫度下繼續(xù)反應15分鐘，然后回流2小時，除掉溶劑，用9/1的乙醚和甲醇溶解，O度析晶，過濾，乙醚洗滌，干燥，得到純品，為N- (2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽；步驟4)將389克干燥的腺嘌呤懸浮于6升的DMF中，加入40克的氫化鈉，反應液攪拌，有氫氣溢出，攪拌15分鐘后，再加入42克氫化鈉，攪拌I小時后,有大量固體析出，攪拌困難，再加入1.5升的DMF，繼續(xù)攪拌3小時，351毫升的溴乙酸乙酯在半個小時內滴加完畢，此過程中有冰浴保持溫度在20-30度范圍內，然后室溫攪拌過夜，蒸除容積，加入3升水，攪拌一小時，過濾固體，水洗三次，固體懸浮于2升乙醇中，攪拌回流45分鐘，冷到室溫，攪拌過夜，抽濾，得固體 ，乙醇洗滌，干燥，得純品，為9-乙酸乙酯腺嘌呤；步驟5)將433克9-乙酸乙酯腺嘌呤和478克羰基二咪唑懸浮于4升的DMF中，反應液緩慢加熱至105度，然后在此溫度下攪拌2小時，將溫度降到95度，加入541克二苯甲醇，撤掉加熱，反應液攪拌過夜，2.5倍的水加入反應液，快速攪拌I小時，固體析出，過濾，水洗三次，甲醇重結晶，得到純品，為6-N-(二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸乙酯，淡黃綠色；步驟6)將300克的6-N_( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤_9_乙酸乙酯懸浮于1.5升乙醇和1.5升乙腈的混合溶劑，加熱至溶解，加入I升水,有固體析出，冷至10度以下，將294克氫氧化鋰溶于2.5升水中，加入上面的懸濁液，溫度上升至20度，繼續(xù)攪拌6分鐘，溫度升至25度，把按1346克檸檬酸加水3升的比例配制好的檸檬酸溶液加入反應液，攪拌10分鐘，加入I升水，冰鹽浴冷卻，直到大量固體析出，繼續(xù)攪拌半個小時，過濾，水洗，得到純品，為6_N_( 二苯甲氧擬基)腺嘌呤-9-乙酸；步驟7) 2克6-N_( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸溶于5毫升乙腈和5毫升DMF的混合溶劑中，加入1.9克苯并三氮-N，N，N，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽，反應液冷至O度，在此溫度下滴加1.6毫升N-甲基嗎啉，攪拌反應一下小時后，O度下將1.896克的C 一次加入反應液，此反應液室溫攪拌一個小時，后室溫反應兩個小時，冷卻至O度，加水產物分層，分液水洗三次，取有機相，旋干有機溶劑得到粗產品3.7克Fmoc-PNA-A (Bhoc)-OMe ；
步驟8)將3.7克的粗產品Fmoc-PNA-A(Bhoc) -OMe溶于25毫升的四氫呋喃中，冷至零度，將10毫升濃度為5mol/l的氫氧化鋰水溶液，劇烈攪拌緩慢滴加入反應液中，溫度控制在零度左右，有固體析出，此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，TLC跟蹤為準，反應完畢，力口入事先按6克檸檬酸加10毫升水的比例配好的檸檬酸水溶液，冷至零下析晶，攪拌半個小時后過濾，水洗三次，得到的固體干燥后用乙醚打漿洗掉低極性雜質，過濾干燥，得到純品Fmoc-PNA-A(Bhoc)-OH,純度為 95% ；過程如下:
權利要求
1.公斤級合成PNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I) I升三口瓶裝入500毫升乙二胺，冰浴冷卻至10度，將75克氯乙酸分批加入控制溫度在10度以下，每批加完后，觀察完全消耗掉之后再加下一批，加料完畢后，室溫過夜反應，將乙二胺旋干，回收乙二胺可以循環(huán)使用，用油泵將乙二胺盡可能去除干凈，用DMSO重結晶得到白色粉末狀晶體，為N-(2-氨乙基)甘氨酸； 步驟2)將50克N-(2-氨乙基)甘氨酸溶于850毫升二氯甲烷和50毫升DMF的混合溶液中，加入134毫升(1.05mol)三甲基氯硅烷，反應混合物室溫攪拌40分鐘，然后冷卻至5度，將134克Fmoc-OSu加入上面混合物中，在5度下滴加NMM186毫升，30分鐘滴完，在此溫度下攪拌2小時，然后加入100毫升甲醇，再攪拌20分鐘，加入I升乙酸乙酯，20分鐘后過濾固體，用乙酸乙酯洗滌，產品粉末旋干，產品水中打漿洗滌，過濾水洗，干燥得到純品，為N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸； 步驟3)將12克N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸溶于100毫升的無水甲醇中，7.72毫升二氯亞砜在冰浴下滴入，滴完后此溫度下繼續(xù)反應15分鐘，然后回流2小時，除掉溶劑，用9/1的乙醚和甲醇溶解，O度析晶，過濾，乙醚洗滌，干燥，得到純品，為N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽； 步驟4)將389克干燥的腺嘌呤懸浮于6升的DMF中，加入40克的氫化鈉，反應液攪拌，有氫氣溢出，攪拌15分鐘后，再加入42克氫化鈉，攪拌I小時后,有大量固體析出，攪拌困難，再加入1.5升的 DMF，繼續(xù)攪拌3小時，351毫升的溴乙酸乙酯在半個小時內滴加完畢，此過程中有冰浴保持溫度在20-30度范圍內，然后室溫攪拌過夜，蒸除容積，加入3升水，攪拌一小時，過濾固體，水洗三次，固體懸浮于2升乙醇中，攪拌回流45分鐘，冷到室溫，攪拌過夜，抽濾，得固體，乙醇洗滌，干燥，得純品，為9-乙酸乙酯腺嘌呤；步驟5)將433克9-乙酸乙酯腺嘌呤和478克羰基二咪唑懸浮于4升的DMF中，反應液緩慢加熱至105度，然后在此溫度下攪拌2小時，將溫度降到95度，加入541克二苯甲醇，撤掉加熱，反應液攪拌過夜，2.5倍的水加入反應液，快速攪拌I小時，固體析出，過濾,水洗三次，甲醇重結晶，得到純品，為6-N-( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸乙酯，淡黃綠色；步驟6)將300克的6-N-( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸乙酯懸浮于1.5升乙醇和1.5升乙腈的混合溶劑，加熱至溶解，加入I升水，有固體析出，冷至10度以下，將294克氫氧化鋰溶于2.5升水中，加入上面的懸濁液，溫度上升至20度，繼續(xù)攪拌6分鐘，溫度升至25度，把按1346克檸檬酸加水3升的比例配制好的檸檬酸溶液加入反應液，攪拌10分鐘，加入I升水，冰鹽浴冷卻，直到大量固體析出，繼續(xù)攪拌半個小時，過濾，水洗，得到純品，為6-N-( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸； 步驟7) 2克6-N- ( 二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸溶于5毫升乙腈和5毫升DMF的混合溶劑中，加入1.9克苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽，反應液冷至O度，在此溫度下滴加1.6毫升N-甲基嗎啉，攪拌反應一下小時后，O度下將1.896克的C 一次加入反應液，此反應液室溫攪拌一個小時，后室溫反應兩個小時，冷卻至O度，加水產物分層，分液水洗三次，取有機相，旋干有機溶劑得到粗產品3.7克Fmoc-PNA-A (Bhoc)-OMe ； 步驟8)將3.7克的粗產品Fmoc-PNA-A (Bhoc) -OMe溶于25毫升的四氫呋喃中，冷至零度，將10毫升濃度為5mol/l的氫氧化鋰水溶液，劇烈攪拌緩慢滴加入反應液中，溫度控制在零度左右，有固體析出，此溫度下繼續(xù)攪拌20分鐘，TLC跟蹤為準，反應完畢，加入事先按6克梓檬酸加10毫升水的比例配好的梓檬酸水溶液，冷至零下析晶，攪拌半個小時后過濾，水洗三次，得到的固體干燥后用乙醚打漿洗掉低極性雜質，過濾干燥，得到純品Fmoc-PNA-A(Bhoc)-OH,純度為 95% ； 過程如下:
全文摘要
本發(fā)明公開了一種公斤級合成PNA的方法，包括以下步驟乙二胺與氯乙酸反應，用DMSO重結晶得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；以N-(2-氨乙基)甘氨酸為反應物，加入原料，反應得N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽；以腺嘌呤為反應物，加入原料，反應得9-乙酸乙酯腺嘌呤；以9-乙酸乙酯腺嘌呤和羰基二咪唑為反應物，加入原料，反應得6-N-(二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸；以6-N-(二苯甲氧羰基)腺嘌呤-9-乙酸為反應物，加入原料，反應即得。本發(fā)明屬于大規(guī)模生產工藝，為PNA的大規(guī)模研究做好物質準備，以及為以后的大規(guī)模應用做好工藝準備。
文檔編號C07D473/34GK103145714SQ20131007852
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權日2013年3月13日
發(fā)明者凌靜, 劉金永 申請人:蘇州維泰生物技術有限公司