專利名稱：旋毛蟲an1型鋅指蛋白-2b重組蛋白抗原及其制備方法
技術領域：

本發(fā)明提供了一種旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B重組蛋白抗原及其制備方法，涉及旋毛蟲與H7402肝癌相關抗原基因ANl型鋅指蛋白-2B抗體，本發(fā)明還提供了該抗體的醫(yī)用用途，屬于生物制藥領域。
背景技術：
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旋毛蟲是一種毛尾目，毛形科的旋毛形線蟲{Trihinella可感染包括人在
內幾乎所有哺乳動物，是一種危害較嚴重的人獸共患病。最近研究發(fā)現，旋毛蟲感染可提高宿主對腫瘤的抵抗力,但對其抗腫瘤活性成分尚不清楚。據報導異體抗原物所產生的抗體及免疫細胞對惡性腫瘤具有抵抗作用。旋毛蟲與腫瘤細胞間相關抗原產生的抗體可針對腫瘤細胞引發(fā)較強的特異性和非特異性免疫反應。發(fā)明內容:
本發(fā)明提供了一種旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因(以下簡稱:旋毛蟲ANl基因)，為旋毛蟲與H7402肝癌相關抗原基因 ，是一種新的蛋白基因物質，其抗體具有抗腫瘤生物活性。本發(fā)明提供了旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因的制備方法。本發(fā)明提供了旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原。本發(fā)明還提供了旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原的制備方法，用于制備治療腫瘤的藥物。本發(fā)明進一步公開了旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原的抗體在制備抗肝癌藥物中的用途。本發(fā)明公開旋毛蟲ANl基因，基因序列如SEQ n0.1所不。本發(fā)明用于擴增旋毛蟲ANl基因的擴增引物，具有以下序列:
上游引物 CGCGAATTCATGGAATTTCCTAATTTAGA EcoR I
下游引物 CCGCTCGAGTCAAGATATAAGGCAGTTTC Xho I。本發(fā)明所述旋毛蟲ANl基因的獲取方法如下:
分別制備旋毛蟲和H7402肝癌細胞的抗血清，利用間接ELISA方法確定H7402肝癌細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與H7402肝癌細胞陽性血清間存在相關抗原；利用western blotting方法確定H7402肝癌細胞抗原和旋毛蟲抗血清間具有交叉反應的分子大小，利用H7402肝癌高免血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行免疫篩選獲得與H7402肝癌相關的抗原蛋白基因。設計特異性引物，利用PCR擴增目的基因。本發(fā)明公開的旋毛蟲ANl重組蛋白抗原，其特征在于:
利用分子量和等電點推測軟件得到，旋毛蟲ANl基因蛋白分子量約為24.1KD,等電點約為7.82。應用DNAStar軟件對公開的旋毛蟲ANl蛋白的抗原表位進行預測，該蛋白存在六個潛在的抗原表位，區(qū)域為:63-77,81-90,129-144，160-170，174-180，191-218。本發(fā)明所述的旋毛蟲ANl重組蛋白抗原的制備方法，包括以下步驟:
將PCR產物與pMD-18T連接，雙酶切重組克隆質粒PMD-18T-AN1和表達載體pET-28a(+)，回收并連接旋毛蟲ANl基因片段和pET_28a(+)載體片段，將連接產物轉化到大腸桿菌Top 10中。挑取陽性菌落，搖菌，提取質粒，進行PCR和雙酶切鑒定。本發(fā)明所述的旋毛蟲ANl重組蛋白抗原的抗體的制備方法，包括以下步驟:
用純化復性的原核表達蛋白免疫小鼠，獲得相關抗原基因蛋白的抗體血清。旋毛蟲與
H7402肝癌細胞相關抗原蛋白抗體能對H7402肝癌產生強的抑制作用，且獲得的旋毛蟲與H7402肝癌細胞相關抗原蛋白抗體易于制備和工業(yè)化生產。本發(fā)明旋毛蟲ANl重組蛋白抗原的抗體在制備抗肝癌藥物中的用途。本發(fā)明的積極效果在于:提供了旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因，并提供了該基因抗體的制備方法，分別制備旋毛蟲和H7402肝癌細胞的抗血清，利用間接ELISA方法確定H7402肝癌細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與H7402肝癌細胞陽性血清間存在相關抗原；利用多克隆抗體從旋毛蟲cDNA文庫中免疫篩選獲得與H7402肝癌相關的抗原蛋白基因?？寺〔⒃吮磉_相關蛋白，純化復性其原核表達蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關抗原基因蛋白的抗體。旋毛蟲ANl重組蛋白抗原的抗體能對H7402肝癌產生強的抑制作用，且獲得的旋毛蟲ANl重組蛋白抗原的抗體易于制備和工業(yè)化生產。


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圖1為旋毛蟲高免血清和H7402肝癌細胞粗抗原的交叉反應及其分子量；
圖2為旋毛蟲ANl基因PCR擴增產物電泳 圖3為DNAStar對ANl基因蛋白潛在蛋白抗原表位分析；
圖4為旋毛蟲ANl重組蛋白抗原的SDS-PAGE圖。
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具體實施方法:
實施例1
1.旋毛蟲ANl基因的獲取
1.1旋毛蟲與H7402肝癌細胞相關基因抗原的確定
首先制備旋毛蟲可溶性抗原和H7402肝癌細胞抗原并分別免疫兔和BalB/C小鼠制備兩種抗原的陽性血清。用H7402可溶性蛋白和旋毛蟲可溶性粗抗原作為包被抗原，分別用兔抗旋毛蟲高免血清和鼠抗H7402細胞高免血清作為被檢抗體，通過建立間接ELISA方法檢測旋毛蟲與H7402肝癌細胞間的交叉抗原反應。結果表明，旋毛蟲抗原與抗H7402肝癌細胞高免血清之間及抗旋毛蟲高免血清與H7402肝癌細胞蛋白間均存在一定的交叉免疫反應，同時，兩種蛋白不與兔和小鼠的健康血清反應。經反復摸索，得到最佳的抗體效價分別為:抗旋毛蟲高免血清1:25600，抗H7402肝癌細胞高免血清1:6400，同時兩種抗原都不與健康小鼠血清反應。1.2 Western blotting檢測旋毛蟲與H7402肝癌細胞相關抗原
首先培養(yǎng)H7402肝癌細胞，提取H7402肝癌細胞抗原蛋白，將該抗原蛋白進行SDS-PAGE,然后轉到硝酸纖維素(NC)膜上,進行Western blotting鑒定相關抗原的分子量，用兔抗旋毛蟲高免血清作為一抗，用HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗，檢測與旋毛蟲可溶性抗原相關的H7402肝癌細胞相關蛋白的分子量大小(如圖1)。Western blotting免疫雜交的結果用DAB顯色，顯示相關蛋白分子量約存在于20 kDa, 29 kDa，43kDa。1.3旋毛蟲與H7402肝癌細胞相關抗原的免疫篩選
將H7402肝癌細胞與旋毛蟲相關抗原進行分離，并制備相關抗原的抗體。采用與XLl-Blue株大腸桿菌裂解液共溫育的方法從抗血清中去除交叉反應性抗體，利用抗H7402肝癌細胞的高免血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行交叉免疫篩選，獲得旋毛蟲與H7402肝癌細胞相關抗原的陽性克隆。分離陽性克隆噬菌斑并進行3次復篩，直至得到一致的免疫陽性重組噬菌體。1.4陽性克隆的PCR擴增和序列測序
分離陽性噬菌斑，用200 μ L SM buffer重懸噬菌斑，取50 μ L煮沸裂解噬菌體，提取噬菌體DNA，用噬菌體通用引物(見表I)擴增插入片段，送至生物公司測序。登陸NCBI網站，對擴增序列進行比對，為旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2Β基因。表I
權利要求
1.一種旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因，基因序列如SEQ n0.1所示。
2.用于擴增旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因的擴增引物，具有以下序列: 上游引物 ANl-R CGCGAATTCATGGAATTTCCTAATTTAGA EcoR I 下游引物 ANl-F CCGCTCGAGTCAAGATATAAGGCAGTTTC Xho I。
3.權利要求1所述一種旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因的獲取方法，其特征在于: 分別制備旋毛蟲和H7402肝癌細胞的抗血清，利用間接ELISA方法確定H7402肝癌細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與H7402肝癌細胞陽性血清間存在相關抗原；利用western blotting方法確定H7402肝癌細胞抗原和旋毛蟲抗血清間具有交叉反應的分子大小，利用H7402肝癌高免血清對旋毛蟲cDNA表達文庫進行免疫篩選獲得與H7402肝癌相關的抗原蛋白基因。
4.旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原，其特征在于: 旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因蛋白分子量為24.1KD，等電點為7.82。
5.權利要求4所述的旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原的制備方法，包括以下步驟: 用EcoR I和通ο I分別雙酶切重組克隆質粒pMD-18T-ANl和表達載體pET_28a(+)，回收旋毛蟲ANl基因片段和pET-28a(+)載體片段，將4μ I旋毛蟲ANl基因片段、I μ IpET-28a(+)載體片段、0.5μ I Τ4 DNA酶、I μ I連接酶緩沖液、3.5 μ I ddH20加入一個滅菌的1.5ml微量離心管中，16°C連接過夜，將連接產物轉化到大腸桿菌Top 10中，冰浴30min，42°C熱休克90 S，冰浴2_3min，加Iml LB液體培養(yǎng)基37°C搖半個小時，均勻涂在含氨芐西林(100μ g/ml)的LB平板上37 °C培養(yǎng)過夜； 挑取陽性菌落，搖菌，提取質粒，進行PCR和雙酶切鑒定、測序； 將重組表達質粒pET-28a-ANl轉化入感受態(tài)疋co7iBL21 (DE3)中，在含50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜； 挑取單菌落(含陽性質粒)，加入含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至菌液A600達0.4-0.6時，加入終濃度為ImM的IPTG誘導表達，37°C振蕩誘導4h，離心，收集菌體； 取Iml菌液，40C，3000g/min離心5min，棄上清，加入70 μ I I X TE緩沖液，重懸沉淀，加入 4.5μ1 DTT, 2 μ I 5 X Loading Buffer，煮沸 lOmin，4°C 10000 g 離心 lOmin，取 15 μ I上清進行SDS-PAGE分析； 誘導表達收集菌體用PBS反復沖洗兩次，超聲儀設置為130W，開5s，停5s，超聲30min，超聲破碎菌體，12000r/min離心15min,收集沉淀；用含有8M尿素的Banding Buffer 4°C溶解Ih ； 過鎳柱，分離純化表達的重組蛋白，對純化蛋白進行梯度復性，并透析濃縮。
6.權利要求4所述的旋毛蟲ANl型鋅指蛋白-2B基因重組蛋白抗原的抗體在制備抗肝癌藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B重組蛋白抗原及其制備方法，提供了旋毛蟲AN1型鋅指蛋白-2B基因，并提供了該基因抗體的制備方法，分別制備旋毛蟲和H7402肝癌細胞的抗血清，利用間接ELISA方法確定H7402肝癌細胞抗原與旋毛蟲陽性血清、旋毛蟲抗原與H7402肝癌細胞陽性血清間存在相關抗原；利用多克隆抗體從旋毛蟲cDNA文庫中免疫篩選獲得與H7402肝癌相關的抗原蛋白基因。克隆并原核表達相關蛋白，純化復性其原核表達蛋白作為免疫原免疫小鼠，獲得相關抗原基因蛋白的抗體。旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的抗體能對H7402肝癌產生強的抑制作用，且獲得的旋毛蟲AN1重組蛋白抗原的抗體易于制備和工業(yè)化生產。
文檔編號C07K14/435GK103114095SQ201310080980
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權日2013年3月14日
發(fā)明者張西臣, 李建華, 徐曉芳, 宮鵬濤, 高江明, 楊舉, 李 赫, 張楠, 張國才 申請人:吉林大學