專利名稱：鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法。
背景技術(shù)：
鯉魚(Cjprizw1S carpio),又稱鯉拐子、鯉子,隸屬于魚綱,鯉形目，鯉科。其種類多，有紅鯉、團(tuán)鯉、草鯉、荷色鯉、錦鯉、火鯉、芙蓉鯉、荷包鯉等。鯉魚對(duì)水體環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是我國(guó)淡水養(yǎng)殖傳統(tǒng)的優(yōu)良品種。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體rBAT/b°+AT是一種異源二聚體，包含rBAT和b°+AT兩個(gè)亞基，是腎臟和小腸頂膜轉(zhuǎn)運(yùn)堿性氨基酸的主要載體蛋白。rBAT為轉(zhuǎn)運(yùn)亞基，b°+AT是催化亞基。rBAT蛋白是一個(gè)II型膜糖蛋白，具有與細(xì)菌糖苷酶同源的大胞外環(huán)結(jié)構(gòu)域，并且高度糖基化。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體不僅介導(dǎo)氨基酸從胞外轉(zhuǎn)入胞內(nèi)發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)也介導(dǎo)氨基酸作為神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞內(nèi)外，完成神經(jīng)細(xì)胞抑制或興奮等重要功能。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)吸收異常會(huì)導(dǎo)致范科尼綜合癥、胱氨酸尿癥、家族性腎原性亞甘氨酸尿癥、肥胖和哈氏遺傳性疾病等氨基酸代謝障礙性疾病。因此，研究氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體分子特性及功能等方面對(duì)于機(jī)體營(yíng)養(yǎng)代謝及疾病病理的研究具有重要意義。為了研究rBAT基因表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性的調(diào)控因素及調(diào)控機(jī)理，需要高特異性的rBAT抗體。rBAT抗體可為rBAT的組織定位、細(xì)胞定位、表達(dá)定量、魚類氨基酸代謝障礙等系列研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。獲得大量有活性的rBAT蛋白作為免疫抗原是制備高活性抗體的關(guān)鍵。由于鯉魚rBAT蛋白是典型的跨膜蛋白，組織含量低，具有I個(gè)跨膜域，因此，不能有效地分離純化及體外表達(dá)超量具有生物活性的rBAT抗原蛋白成了制備rBAT抗體的瓶頸。

與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)一的技術(shù)方案是通過蛋白質(zhì)分離純化的方法，從組織中直接分離純化rBAT蛋白作免疫抗原。其缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)蛋白一般含量很低，提取方法復(fù)雜，得到的蛋白量相對(duì)較少，含雜質(zhì)多，需要復(fù)雜的純化過程，成本高。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)二的技術(shù)方案是通過構(gòu)建工程菌體外表達(dá)外源蛋白作免疫抗原。其缺點(diǎn)是通過構(gòu)建原核或真核表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)抗原蛋白，雖然體外表達(dá)的效率和表達(dá)量比較高，但是這種方法有很多的局限性，很多特殊結(jié)構(gòu)異源基因如富含AT堿基和一些跨膜蛋白的基因很難在微生物中表達(dá)或者表達(dá)量很低，有的即使表達(dá)了但是沒有活性。與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)三的技術(shù)方案是通過無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白，無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是指以細(xì)胞裂解液為基礎(chǔ)，加之外援的RNA模板、氨基酸和能量所構(gòu)成的細(xì)胞外表達(dá)體系。其缺點(diǎn)是無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)一些跨膜蛋白，但是這項(xiàng)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外還處于實(shí)驗(yàn)室研究水平，技術(shù)難度大，成本高，目前還無法實(shí)際應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)完成了對(duì)鯉魚rBAT全長(zhǎng)的測(cè)序工作，包括Y端非翻譯區(qū)(5' UTR),3'端非翻譯區(qū)(3' UTR)，一個(gè)2000bp左右的開放閱讀框(0RF)。經(jīng)序列同源性分析顯示，rBAT氨基酸序列具有高度保守性，鯉魚rBAT氨基酸序列和斑馬魚的相似性最高達(dá)80%以上，與豬的rBAT氨基酸序列相似性最低(低于60%)。鯉魚腸道rBAT基因全長(zhǎng)2040 bp，其rBAT蛋白含有跨膜域，所以重組表達(dá)rBAT基因全長(zhǎng)存在一定的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是:鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(1)克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因，通過分析膜蛋白rBAT的三維結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和抗原決定簇，利用原核表達(dá)具有抗原決定簇的部分rBAT基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達(dá)全長(zhǎng)基因；(2)構(gòu)建氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因工程菌；(3)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；
(4)制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT抗原；(5)免疫兔子；(6)采血樣測(cè)定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的效價(jià)；(7)頸動(dòng)脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的兔抗血清；(8)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。本發(fā)明所述的制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT抗原的具體步驟為:將步驟(3)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，棄上清，按照濕重I g的菌體加6 ml蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將分離膠放于0.3 M KCl溶液里染色，顯示目的條帶，切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20里清洗，將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度。本發(fā)明所述的免疫兔子的具體步驟為:按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化:耳緣靜脈注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內(nèi)注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次采用耳緣靜脈注射法，第三、四次采用皮內(nèi)多點(diǎn)注射法；每隔10 d加強(qiáng)免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐齊U，以后加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全弗氏佐劑。本發(fā)明所述的頸動(dòng)脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的兔抗血清的具體步驟為:步驟(5)中第四次免疫后8 d頸動(dòng)脈采血，兔子在采血前禁食I d，采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊后，4 °C保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4 °C備用。本發(fā)明采用表達(dá)跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長(zhǎng)基因，解決了跨膜蛋白無法表達(dá)的難題，并且該方法簡(jiǎn)單易行，快速，穩(wěn)定，成本低，周期短，表達(dá)量高，制備的抗體特異性強(qiáng)，效價(jià)高。


圖1是本發(fā)明制備方法的流程圖，圖2是鯉魚全長(zhǎng)rBAT基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖，圖3是鯉魚部 分rBAT基因rBAT-P PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖，圖4是重組rBAT_PSDS-PAGE電泳分析圖，圖5鯉魚腸道PepTl表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果圖(100 χ)。
具體實(shí)施例方式結(jié)合附圖詳細(xì)描述實(shí)施例。1.鯉魚腸道rBAT的克隆與表達(dá) (I) PCR引物設(shè)計(jì)
利用Primer Primern 5.0設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,基于本實(shí)驗(yàn)室已獲得的鯉魚腸道rBAT基因的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物rBAT - F和rBAT - R:rBAT - F:5，-GGGACTGAAGGAAGCAAG-3，rBAT - R:5’-GTCGCTTCT ATCTTCAACACTT-3’
另一對(duì)為含Kpn 及Not 雙酶切位點(diǎn)的特異性引物rBAT-F2和rBAT_R2: rBAT-F2:5’-GGGGTACCATGAGTTCGACCAAAAA-3’
Kpn
rBAT-R2:5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGCGGTAGCAGGCTTTCC-3’
Not
劃線部分分別為Kpn 及Not 的酶切位點(diǎn)。(2)全長(zhǎng)rBAT基因的克隆與序列分析
采用Trizol法提取鯉魚前腸組織總RNA，用01igo(dT)18引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，采用rBAT - F和rBAT - R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95°C 3 min, 94°C30s, 53.5°C 50s, 72°C 2min 15s，33 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，16°C保溫。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析。擴(kuò)增到了大約2000bp左右的DNA片段(圖2)，將rBAT PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM_TVector連接，構(gòu)建pGEM-T-rBAT重組質(zhì)粒，連接載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌iE.coli JM109)感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選出陽性克隆，將陽性克隆的菌液送至中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序。結(jié)果表明，該核酸片段長(zhǎng)度為2040 bp，經(jīng)序列比對(duì)顯示，該DNA片段即為鯉魚腸道rBAT的ORF區(qū)。采用在線服務(wù)器TMHMM Server v.2.0.對(duì)5^7 7進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，具有I個(gè)跨膜區(qū)域。鯉魚rBAT基因編碼679個(gè)氨基酸殘基，采用SignalP 3.0在線服務(wù)器對(duì)rBAT氨基酸序列預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示1-105位氨基酸(MSSTKITNIDAVELQEGIQNAAFHEDDDDTSNASSSREQQATSVSVTRPEENEYTQIKPYAGMPKEVLMLYSRKACYR)可能為其抗原決定簇。本實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)長(zhǎng)度為78個(gè)氨基酸、具有一個(gè)抗原決定簇的多肽。(3)抗原決定簇部分rBAT基因rBAT_P的克隆及重組質(zhì)粒pMD 19_T_rBAT-P的構(gòu)
建
采用rBAT-F2和rBAT_R2引物，以pGEM_T_rBAT質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為950C 3 min, 940C 30s, 53.5°C 50s, 72°C 2min 15s，33 個(gè)循環(huán)，72°C lOmin，16°C保溫。在250 bp附近獲得一條特異性條帶(圖3)(實(shí)際大小為234 bp)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pMD 19-T載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，選取陽性克隆菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，用Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒提取pMD 19-T-rBATT0質(zhì)粒。(4)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-rBAT-P的構(gòu)建、鑒定將陽性克隆pMD 19-T-rBAT-P與原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)分別用Kpn 及Not ，37 °C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收rBAT-P片段和線性化pET-32a(+)質(zhì)粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設(shè)計(jì)連接反應(yīng)體系，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-rBAT-P,并轉(zhuǎn)化萬.co7iRosetta,篩選陽性克隆，進(jìn)行單雙酶切鑒定。(5) rBAT蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
將構(gòu)建的基因工程菌按1%接種量接種于新鮮的含有AMP的TB培養(yǎng)液中，37 °C, 200rpm振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.5-0.6，加入IPTG (終濃度I mmol/L), 37 V，200 rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h-10 h。誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液5000 rpm離心3min得到菌體，棄上清，加適量(1(1!120水，與2X上樣緩沖液1:1在1.5 ml Eppendorf管中混合。沸水浴10 min, 5000 rpm離心30 S。取35 μ I樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的對(duì)照菌體樣品和誘導(dǎo)的含有空載體pET-32a(+)表達(dá)菌體為對(duì)照。SDS-PAGE電泳顯示I條特異性表達(dá)條帶，大小約26 kDa (圖4)，而陰性對(duì)照組在此位置沒有特異性條帶。2.鯉魚腸道rBAT抗血清的制備
(I)融合蛋白的獲得、純化
將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，棄上清，按照I g菌體(濕重)加6 ml蒸餾水，吹打混勻，再加等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將分離膠放于0.3 M KCl里染色幾分鐘，顯示目的條帶。切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20里清洗。將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度。( 2 )免疫新西蘭長(zhǎng)耳兔與采血
將蛋白溶液稀釋一定的比例，使終蛋白濃度維持在一定濃度；乳化:耳緣靜脈注射:
0.8 ml蛋白溶液(約375 μδ/πι1)+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；皮內(nèi)注射:1 ml蛋白溶液(約200 μδ/πι1)+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次采用耳緣靜脈注射法，第三、四次采用皮內(nèi)多點(diǎn)(4-6點(diǎn))注射法；每隔10 d加強(qiáng)免疫I次(第I次免疫加完全弗氏佐劑，以后加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全弗氏佐劑)。④第四次免疫后8 d頸動(dòng)脈采血(兔子在采血前禁食I d)。采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊后，放4 °C過夜，使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min,吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4 °C備用。3.鯉魚腸道rBAT抗血清的檢測(cè)
(I)抗血清效價(jià)的測(cè)定
采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA):將抗原(純化過的Sgltl融合蛋白)稀釋于包被緩沖液(0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6)中，終濃度為10 Pg/ml，每孔加100 μ ，并設(shè)立空白對(duì)照(只加包被緩沖液)，4°C包被過夜后，用IXPBST[I XPBS + (0.05%)Tween 20]，于室溫下洗滌3次，每次3min，然后每孔加100 μ 封閉液(0.5% BSA)，37 °C孵育2 h，IXPBST洗滌3次，加入一抗，血清樣品按IO2-1O9倍比稀釋于IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C孵育I h，I X PBST洗滌3次，加入羊抗兔酶標(biāo)二抗，酶標(biāo)二抗按1: 1000稀釋于IXPBST中，每孔100 μ1，37 °C，1 h，I X PBST洗滌3次，每孔加100μ 顯色液(TMB溶液)，室溫放置10-15 min，加入50 μ1，2 mol/L H2SO4終止，酶標(biāo)儀上判讀結(jié)果?？寡逍r(jià)測(cè)定結(jié)果見表I。A行是不同稀釋倍數(shù)抗血清(序號(hào)1-8) ;B行為正常兔子的血清；C行是沒有包被抗原的陰性對(duì)照。通過酶標(biāo)儀測(cè)定Sgltl抗血清OD45tl值，采用終點(diǎn)“滴度”表示法判斷結(jié)果，rBAT抗血清的效價(jià)為4X 105。表I ELISA測(cè)定抗體效價(jià)
權(quán)利要求
1.鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(I)克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因，通過分析膜蛋白rBAT的三維結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和抗原決定簇，利用原核表達(dá)具有抗原決定簇的部分rBAT基因片段作為免疫抗原蛋白代替表達(dá)全長(zhǎng)基因；(2)構(gòu)建氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因工程菌；(3)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；(4)制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT抗原；(5)免疫兔子；(6)采血樣測(cè)定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的效價(jià)；(7)頸動(dòng)脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的兔抗血清；(8)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)中制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT抗原的具體步驟為:將步驟(3)誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，棄上清，按照濕重I g的菌體加6 ml的蒸餾水，吹打混勻，再加入與上述菌體混合液等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將分離膠放于0.3 M KCl溶液里染色，顯示目的條帶，切下膠上的目的蛋白條帶，放入ddH20里清洗，將膠條剪碎放入塑料培養(yǎng)皿中，冷凍干燥I d，放入研缽中磨成粉末，每200 mg目的蛋白粉加3 ml生理鹽水溶解蛋白，離心，取上清，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)蛋 白濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)中免疫兔子的具體步驟為:按注射要求將蛋白溶液稀釋；乳化:耳緣靜脈注射:0.8 ml蛋白溶液+0.4 ml完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩，皮內(nèi)注射:1 ml蛋白溶液+1 ml不完全弗氏佐劑，漩渦震蕩；注射方法:第一、二次采用耳緣靜脈注射法,第三、四次采用皮內(nèi)多點(diǎn)注射法；每隔10 d加強(qiáng)免疫I次，第I次免疫加完全弗氏佐劑，以后加強(qiáng)免疫時(shí)用不完全弗氏佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，其特征在于所述的步驟(7)中頸動(dòng)脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的兔抗血清的具體步驟為:步驟(5)中第四次免疫后8 d頸動(dòng)脈采血，兔子在采血前禁食I d，采集血樣收集于經(jīng)滅菌并不含抗凝劑的離心管中，室溫放置2 h，待血液凝塊后，4 1:保存使之凝固，析出淡黃色抗血清，將抗血清轉(zhuǎn)移至另一管中，血凝塊以1500 rpm離心10 min，吸出上清液合并于收集到的抗血清管中，分裝冷凍干燥保存，部分放于4 °C備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案要點(diǎn)為鯉魚氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT兔抗血清的制備方法，包括以下步驟(1)克隆鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的基因；(2)構(gòu)建rBAT的基因工程菌；(3)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；(4)制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT抗原；(5)免疫兔子；(6)采血樣測(cè)定鯉魚腸道氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的效價(jià)；(7)頸動(dòng)脈采血制備氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體轉(zhuǎn)運(yùn)亞基rBAT的兔抗血清；(8)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)。本發(fā)明采用表達(dá)跨膜蛋白的具有抗原決定簇部分基因片段作為抗原蛋白代替全長(zhǎng)基因，解決了跨膜蛋白無法表達(dá)的難題。
文檔編號(hào)C07K16/18GK103214575SQ20131008452
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月18日
發(fā)明者聶國(guó)興, 王俊麗, 明紅, 王貝, 劉起麗, 段艷艷 申請(qǐng)人:河南師范大學(xué)