專利名稱：一種特異性克倫特羅人工抗原的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種高特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)，又稱“瘦肉精”，是一種平喘藥。是腎上腺類神經(jīng)興奮劑，20世紀(jì)80年代初，美國(guó)Cyanamid公司意外發(fā)現(xiàn)其有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)、提高瘦肉率及減少脂肪的效果，于是其被畜牧業(yè)作為瘦肉精使用。但由于其副作用，歐共體于1988年I月I日起禁止鹽酸克倫特羅物質(zhì)當(dāng)飼料添加劑使用。1991年被FDA禁止。1997年，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部下文嚴(yán)禁β -腎上腺素類激素在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，鹽酸克倫特羅列為第一位，2002年9月10起在中國(guó)境內(nèi)禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用鹽酸克倫特羅。
權(quán)利要求
1.一種特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，其特征在于以4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸為半抗原，將4-氨基_3，5- 二氯苯甲酸上的羧基通過(guò)1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺EDC與N-羥基琥珀酰亞胺NHS活化、或者通過(guò)三正丁胺與氯甲酸異丁酯活化，再與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到克倫特羅人工抗原，將人工抗原透析，工藝為: (A)將4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸用N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸與N-羥基琥珀酰亞胺NHS，1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺EDC的摩爾比為1:1.5:2，在4°C避光攪拌反應(yīng)lh，再在室溫反應(yīng)12h，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原與牛血清白蛋白的摩爾比為80:1，牛血清白蛋白用0.1MPH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白濃度大于3mg/mL，且碳酸鹽緩沖液與N，N- 二甲基甲酰胺DMF的體積比例為5:1 ;將活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室溫反應(yīng)24h，用PBS緩沖液透析2天，期間更換PBS緩沖液4次，得到克倫特羅人工抗原； 或(B)將4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸用N，N- 二甲基甲酰胺DMF溶解，4-氨基-3，5- 二氯苯甲酸與三正丁胺，氯甲酸異丁酯的摩爾比為1:1.2:1.2，(TC反應(yīng)lh，得活化的半抗原溶液； 取牛血清白蛋白，半抗原與牛血清白蛋白的摩爾比為80:1，牛血清白蛋白用0.1MPH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，(TC預(yù)冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白濃度大于3mg/mL，且碳酸鹽緩沖液與N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的體積比例為5:1 ;在(TC條件下，將活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0°C條件下反應(yīng)Ih，然后室溫反應(yīng)24h ;用PBS緩沖液透析2天，期間更換PBS緩沖液4次，得到克倫特羅人工抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，其特征在于，所述載體蛋白為:牛血清白蛋白BSA、陽(yáng)離子化的牛血清白蛋白cBSA、匙孔血藍(lán)蛋白KLH、血藍(lán)蛋白LPH、雞卵清白蛋白OVA、人血清白蛋白HSA之一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，其特征在于克倫特羅人工抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式I所示:
4.用權(quán)利要求1所述方法合成的特異性克倫特羅人工抗原的應(yīng)用，其特征在于制備克倫特羅抗體，所述抗體為多克隆抗體和/或單克隆抗體。
5.用權(quán)利要求1所述方法合成的特異性克倫特羅人工抗原的應(yīng)用，其特征在于在檢測(cè)克倫特羅中的應(yīng)用，檢測(cè)食品中的克倫特羅殘留。
全文摘要
一種特異性克倫特羅人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括如下步驟選擇4-氨基-3,5-二氯苯甲酸作為克倫特羅的半抗原，該分子與克倫特羅分子的同源性大于50%，將該半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到克倫特羅人工抗原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用本發(fā)明的抗原免疫動(dòng)物得到的抗血清效價(jià)可達(dá)32000，檢測(cè)限為1ng/mL，半抑制濃度IC50為10ng/mL。產(chǎn)生的抗體特異性高、靈敏度高。本發(fā)明的抗原或抗體可用于建立酶聯(lián)免疫吸附分析方法和膠體金試紙快速檢測(cè)法，從而用于快速檢測(cè)食品中的克倫特羅殘留，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K14/765GK103159852SQ20131010359
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月28日
發(fā)明者胥傳來(lái), 劉麗強(qiáng), 王利兵, 匡華, 徐利廣, 馬偉, 胡擁明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)