專利名稱：一種g因子的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鱟試劑的技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種G因子的分離純化方法。
背景技術(shù)：
1968年Levin J和Bang F B創(chuàng)建鱟試劑以來，使內(nèi)毒素的檢測成為靈敏、快速、簡便的方法，已被舉世公認，并被美、日、中、歐洲藥典以《細菌內(nèi)毒素試驗》收載。但1981年日本學(xué)者Kakinuma A發(fā)現(xiàn)非熱原物質(zhì)(1-3)- β -D-葡聚糖也可使當試劑凝聚，這極大影響了普通鱟試劑檢測內(nèi)毒素的特異性，因而目前檢測內(nèi)毒素的鱟試劑主要為特異鱟試劑，其生產(chǎn)工藝的特點是利用親和層析方法將普通鱟試劑中存在的可以和(1-3) _β-D-葡聚糖產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的G因子分離去除，如本發(fā)明人申請的中國專利CN1621841A中披露的“抗干擾鱟試劑的制備工藝”。因為葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，而患者的真菌感染檢測在醫(yī)學(xué)上一直是個難題，所以葡聚糖與G因子發(fā)生凝聚反應(yīng)的原理很快被用于真菌感染的檢測上，如本發(fā)明人申請的中國專利CN101880706A披露的“一種直接真菌檢測鱟試劑盒及方法”。該檢測方法對G因子的純度要求較高,尤其是當血細胞中含有的凝固原(coagulogen)不能混雜其中，而常規(guī)親和層析法分離的G因子和凝固原是在同一區(qū)間洗脫的，因此G因子的合并組分中通常含有凝固原組分，并不能直接作為真菌檢測的試劑來使用。所以，要么以獲取高純度G因子組分為目標開發(fā)一種從鱟全血中特異性分離純化G因子的方法，要么以特異鱟試劑生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的含有凝固原的G因子合并組分為基礎(chǔ)發(fā)明進一步分離純化的方法。顯然，后一種方法更能夠充分利用寶貴的鱟資源，但是從G因子組分中去除性質(zhì)相近的凝固原是一個技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提 供一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟，其還包括對初級分離純化所得的主要含G因子的合并組分進一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。該進一步分離純化的步驟為:
第一步:制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱,該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Φ2Χ16ο ，用含有pH=8.0、0.25 mol/L NaCl的20 mM Tris-HCl溶液進行預(yù)平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣；
第二步:用0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液洗脫，該 0.5 mol/L 甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液用 pH=8.0,20 mM Tris-HCl 溶液配制；
第三步:收集第二步產(chǎn)生的洗脫液，用Amicon PM-1O超濾膜濃縮；
第四步:收集第三步產(chǎn)生的濃縮液，用Sephacryl S-200HR柱進一步提純，該Sephacryl S-200HR 柱為 Φ2.7X98cm, M pH8.0、50mM Na3PO4 緩沖液預(yù)平衡；
第五步:收集第四步產(chǎn)生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機低溫濃縮。本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)了對鱟資源的充分利用，同時克服了凝固原難以從G因子組分中除去的難題。


圖1為本發(fā)明的ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線。圖2為本發(fā)明的S^hacryl S-200HR柱洗脫曲線。
具體實施例方式本發(fā)明揭示一種G因子分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟，還包括對初級分離純化所得的主要含G因子的合并組分進一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。如中國專利申請CN1632580A中的具體實施方式
部分披露的，典型的從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟為:
活鱟加抗凝劑采血后，于IOOOrpm下離心，棄上清液，收集細胞，再加入含NaCl 3 mol/L和Tris-HCl 0.05 mol/L pH 8.0的洗滌液洗滌，棄去上清液；收集的細胞加入含有NaCl0.1 mol/L和Tris-HCl 0.02 mol/L pH 8.0的崩解液進行細胞崩解，之后進行離心，收集提取液；提取液進行親和層析，用不同鹽濃度的NaCl和Tris-HCl洗脫液洗柱，收集洗脫液；對洗脫液進行鑒別后，將 相同成分的洗脫液進行合并。再如，初級分離純化的步驟還可以如中國專利申請CN1621841A中的具體實施方式
部分披露的:采用親和層析法，利用凝膠Dextran sulfate Sepharose CL-6B制備的無菌無熱原親和層析柱以及收集分離成份的設(shè)備，將鱟血細胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗內(nèi)毒素因子、凝固酶原等成份分別分離出來。在利用上述技術(shù)方案或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的類似技術(shù)方案獲得主要含G因子的合并組分后，本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的分離純化步驟，在本實施例中采取的具體步驟為:
第一步:制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱,該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Φ2Χ16ο ，用含有0.25 mol/L NaCl的pH=8.0、20 mM Tris-HCl溶液進行預(yù)平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣；
第二步:用0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液洗脫，該 0.5 mol/L 甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液用ρΗ=8.0、20 mM Tris-HCl溶液配制。參閱圖1所示的ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線可知，G因子與凝固原的洗脫峰重疊(圖1中空心圓圈連成的洗脫峰所示)，圖1中的α-MG是甲基葡萄糖苷methyl-a-D-glucoside的簡寫；
第三步:收集第二步產(chǎn)生的洗脫液，用Amicon PM-1O超濾膜濃縮?！暗诙疆a(chǎn)生的洗脫液”指圖1中0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-a -D-glucoside溶液洗脫的洗脫液，不包括0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗產(chǎn)生的溶液；
第四步:收集第三步產(chǎn)生的濃縮液，用Sephacryl S-200HR柱進一步提純，該Sephacryl S-200HR柱為 Φ2.7X98cm，用 pH 8.0、50mM Na3PO4 緩沖液預(yù)平衡。參閱圖 2 所示的Sephacryl S-200HR柱洗脫曲線，可見第二步中亦即圖1中所示的洗脫峰重疊的G因子與凝固原兩個組分明顯分開(圖2中空心圓圈連成的洗脫峰表示G因子組分)；
第五步:收集第四步產(chǎn)生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機低溫濃縮。上述步驟中，ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱填料購買自美國Bio-Rad公司，Amicon PM-10超濾膜購買自美國Millipore公司，Sephacryl S-200HR柱填料購買自美國GE公司，其他試劑及耗材均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。上述僅為本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明的設(shè)計構(gòu)思并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對本發(fā)明進行非實質(zhì)性的 改動，均應(yīng)屬于侵犯本發(fā)明保護范圍的行為。
權(quán)利要求
1.一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟，其特征在于:還包括對初級分離純化所得的主要含G因子的合并組分進一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分； 該進一步分離純化的步驟為: 第一步:制備ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱,該ConA-Sepharose瓊脂糖凝膠柱規(guī)格為柱為Φ2Χ 16cm，用含有pH=8.0、0.25 mol/L NaCl的20 mM Tris-HCl溶液進行預(yù)平衡，接著以上述主要含G因子的合并組分作為樣品上樣； 第二步:用0.5 mol/L NaCl溶液充分沖洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液洗脫，該 0.5 mol/L 甲基葡萄糖苷methyl- a -D-glucoside 溶液用 pH=8.0,20 mM Tris-HCl O 溶液配制； 第三步:收集第二步產(chǎn)生的洗脫液，用Amicon PM-1O超濾膜濃縮； 第四步:收集第三步產(chǎn)生的濃縮液，用Sephacryl S-200HR柱進一步提純，該Sephacryl S-200HR 柱為 Φ2.7X98cm，用 pH 8.0、50mM Na3PO4 緩沖液預(yù)平衡; 第五步:收集第四 步產(chǎn)生的高純度G因子合并組分，用冷凍干燥機低溫濃縮。
全文摘要
本發(fā)明公開一種G因子的分離純化方法，其包括從鱟全血中分離提取血細胞步驟及將血細胞崩解后利用親和層析法對鱟血細胞中包括G因子的各種血細胞成分進行初級分離純化的步驟，其還包括對初級分離純化所得的主要含G因子的合并組分進一步分離純化的步驟，籍以制備去除凝固原的高純度G因子組分。本發(fā)明的技術(shù)方案實現(xiàn)了對鱟資源的充分利用，同時克服了凝固原難以從G因子組分中除去的難題。
文檔編號C07K1/22GK103214566SQ20131010766
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月30日
發(fā)明者丁友玲 申請人:福州新北生化工業(yè)有限公司