專利名稱：新型多肽、水解抗菌肽及其制備方法
新型多肽、水解抗菌肽及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體說涉及一種新型多肽及其重組水解抗菌肽的制備方法。
背景技術(shù)：
抗生素的濫用會導(dǎo)致藥物殘留等公共衛(wèi)生問題，并引發(fā)耐藥菌株和新的致病亞型菌株的出現(xiàn)，使得細菌性疾病的防治再次成為困擾人類的難題。開發(fā)新的抗菌藥物成為一個越來越重大的研究課題。
抗菌肽是一種小分子的多肽類物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性，對原核生物有作用，對真核生物無害?？咕氖巧锓烙到y(tǒng)中產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體的肽類物質(zhì)，是生物先天的、非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分?？咕目膳c革蘭陰性菌外膜的脂多糖或革蘭陽性菌表面的肽聚糖結(jié)合，使其被破壞而形成穿膜通道，胞內(nèi)離子大量流出，細胞因高滲破裂而死亡，不易產(chǎn)生耐藥性。另外，它還具有免疫調(diào)節(jié)、促進損傷修復(fù)、中和內(nèi)毒素及對抗膿毒性休克的作用。因此，抗菌肽具有極廣泛的應(yīng)用價值。
然而，抗菌肽的生產(chǎn)技術(shù)一直是個瓶頸。天然抗菌肽由于含量低，提取成本高，不可能實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。可能實現(xiàn)抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的技術(shù)平臺有化學(xué)合成和基因工程技術(shù)。因制備成本相對較低，運用基因工程方法生產(chǎn)重組抗菌肽是一個令人關(guān)注的途徑。大腸桿菌是迄今為止體內(nèi)表達多肽最常用的宿主微生物，然而抗菌肽對大腸桿菌有毒性，經(jīng)常不能成功表達，或以無活性的包含體形式表達，以最大程度減輕對宿主細胞的毒性。這對需正確折疊才有抗菌活性的大多數(shù)天然抗菌肽來說是致命的。一般地，線性抗菌肽的抗菌活性不依賴于結(jié)構(gòu)。若線性抗菌肽串聯(lián)起來在大腸桿菌中以包含體形式高效表達，再將包含體水解，將會直接釋放出有活性的抗菌肽，這是利用大腸桿菌規(guī)?；a(chǎn)高活性抗菌肽的有效途徑。發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種核苷酸序列、含有該序列的重組載體及重組菌株，它們可以用于抗菌肽的制備。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
編碼抗菌肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0:1所示。
含有所述的核苷酸序列的重組載體。
所述的重組載體， 在所述核苷酸序列的5’端引入BamHI位點，且在3’端XhoI引入位點，酶切后得酶切片段，同時對PGEX-4T-1上述位點進行酶切后，連接所述酶切片段和酶切后的PGEX-4T-1連接，得重組載體。
所述重組載體制備的重組菌株。
本發(fā)明的目的之二在于提供新型多肽及其制備方法，所述新型多肽為具有抗菌效果的多肽的中間品。其制備方法簡單，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
所述的核苷酸序列編碼的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
選擇具有高抗菌活性的線性抗菌肽元件，線性抗菌肽元件有:1)RRWRIVVIRVRR、2)RIffVIffRR,3)RLARIVVIRVAR(Patel DA, et al.20 12)、4)RLCRIVVIRVCR、5)ILPffKffPffffPffRR(Hilpert K，et al.，2008)。把這些抗菌肽元件串聯(lián)，按大腸桿菌偏好的密碼子優(yōu)化設(shè)計編碼序列。
所述的抗菌肽的制備方法，具體包括以下步驟:
A抗菌肽基因的合成及表達載體構(gòu)建
將如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的編碼序列5，和3，端引入BamHI和XhoI酶切位點，與PGEX-4T-1分別進行酶切后再連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到BL21，構(gòu)建重組菌株;
B誘導(dǎo)表達
步驟A所得重組菌株單菌落接種于含100 μ g/mL氨芐青霉素的BL培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，按5%體積比接種于IOOmL BL培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至細菌濃度達到OD6tltl =0.6 時，按 0.lmmol/L 加入 IPTG, 37°C、180r/m 振搖培養(yǎng) 5h, 4°C、12000r/m 離心 IOmin 收集菌體，按每IOOml培養(yǎng)液加入20ml PBS重懸沉淀，得抗菌肽。
所述的抗菌肽的制備方法，步驟A所得重組菌株抗性培養(yǎng)至富集后，收集菌體，所述菌體中含有所述抗菌肽。
本發(fā)明的目的之三在于提供具有抗菌活性的多肽制劑，其抗菌效果好，商業(yè)應(yīng)用價值大。
所述的抗菌肽制劑，所述制劑為水解抗菌肽。
所述的制劑的制備方法，在所述抗菌肽中調(diào)節(jié)pH值至2.0，加入胃蛋白酶，37°C孵育5h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，12000r/m離心lOmin，收集上清。上清經(jīng)微濾、噴霧干燥或凍干，即為水解多肽制劑。
本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用胃蛋白酶的水解特性，設(shè)計了一種多肽，將如SEQID NO:1所示的核苷酸序列編碼序列克隆至PGEX-4T-1，在大腸桿菌中以包含體形式表達，實現(xiàn)了抗菌肽的高效表達，表達產(chǎn)物可在胃蛋白酶的水解下釋放出高活性多肽。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步描述。
圖1為抗菌肽經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中的表達情況(免疫印跡)，其中，M為蛋白質(zhì)Marker, I為新型多肽。
圖2為胃蛋白酶對重組的新型多肽的水解情況(免疫印跡)，其中，I為未水解，2-6依次水解1、2、3、4和5h。
圖3為胃蛋白酶水解新型多肽后得到的水解抗菌肽對大腸桿菌的抑菌效果，其中，1-5依次水解1、2、 3、4和5h，C為水解的未誘導(dǎo)重組菌。
具體實施方式
以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一新型多肽的重組表達載體構(gòu)建I新型多肽基因的設(shè)計與合成根據(jù)大腸桿菌BL21菌株的密碼子偏好性優(yōu)化上述氨基酸序列的編碼序列，釆用美國PE公司391型DNA自動合成儀合成基因序列。基因序列如SEQ ID NO:1所示:5’ -cgctggcaatggcgcgatcctcgccgttggcgcatcgtggttattcgtgtacgtcgtgatccggcggagatctacggcacgaaagagtctccgcagactcactactatgatccgcgtatctgggtgatctggcgccgtgacccacgtctggctcgcatcgttgtcatccgtgtagctcgtgacccgatcctgccgtggaaatggccatggtggccgtggcgtcgcgatccgcgtctgtgccgtattgttgtaattcgtgtatgccgtgatcctcgtcgctggtggtgccgcgatccgggtcgtcgccgtcgctctgttcagtggtgtgccgatccacgtcgttggtggacccgt-3’。(2)多肽表達載體及重組菌株的構(gòu)建在編碼基因的5 ’和3 ’端引入BamHI和XhoI酶切位點:5’ GGATCCcgctggcaatggcgcgatcctcgccgttggcgcatcgtggttattcgtgtacgtcgtgatccggcggagatctacggcacgaaagagtctccgcagactcactactatgatccgcgtatctgggtgatctggcgccgtgacccacgtctggctcgcatcgttgtcatccgtgtagctcgtgacccgatcctgccgtggaaatggccatggtggccgtggcgtcgcgatccgcgtctgtgccgtattgttgtaattcgtgtatgccgtgatcctcgtcgctggtggtgccgcgatccgggtcgtcgccgtcgctctgttcagtggtgtgccgatccacgtcgttggtggacccgt￡X￡^2r3’。利用BamHI/XhoI多克隆位點克隆到pGEX_4T_l質(zhì)粒中，得抗菌肽的重組表達載體。實施例二新型多肽的制備`將實施例一制備的重組表達載體轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21中，構(gòu)建BL21重組菌株。重組BL21菌株單菌落接種于含lOOyg/mL氨芐青霉素的BL培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，按5%體積比接種于IOOmL BL培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至細菌濃度達到0D_ = 0.6時，按0.1mmol/L加入IPTG，370C、180r/m振搖培養(yǎng)5h，4°C、12000r/m離心IOmin收集菌體，按每IOOml培養(yǎng)液加入20ml PBS重懸沉淀，結(jié)果如圖1所示。所述新型多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示， N’ -RRWRIVVIRVRRDPAEIYGTKESPQTHYYDPRIffVIWRRDPRLARIVVIRVARDPILPffKffPffffPffRRDPRLCRIVVIRVCRDPRRffffCRDPGRRRRSVQffCADPRRffffTR-C,o實施例三抗菌肽的制劑將菌體混懸液冰水浴，超聲裂解，功率為125w，工作5s，間歇Is。向裂解液中加入鹽酸調(diào)節(jié)PH至2.0，加入胃蛋白酶，37°C孵育5h，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,12000r/m離心lOmin，收集上清。上清經(jīng)微濾、噴霧干燥或凍干，即為水解抗菌肽。實施例四水解抗菌肽的水解效果測試實施例3方法所得的水解抗菌肽樣本分別經(jīng)10 % SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)印NC膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2h ;TBST洗滌3次；加入小鼠抗GST單克隆抗體(I: 4000，體積稀釋)，室溫孵育Ih ；TBST洗滌3次；再加入堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG(l: 5000，體積稀釋)，室溫孵育I小時；TBST洗滌3次；置BCTP/NBT顯色液中顯色。結(jié)果如圖2所示，經(jīng)免疫印跡分析可見，隨著水解時間的延長，沉淀中的重組多肽含量在逐步降低，水解5小時沉淀中重組多肽。實施例五水解抗菌肽的抗菌效果測試重組人工水解多肽的抑菌實驗(薄層瓊脂糖孔穴擴散法)，具體為:在含1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)基中，加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌K88，使瓊脂內(nèi)的細菌濃度達到107CFU/ml，搖勻，倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻凝固后，用打孔器在培養(yǎng)基上等距離打6個孔(直徑8mm)，依次加入不同水解時間的多肽水解液和未誘導(dǎo)的重組菌株培養(yǎng)物水解液，30 μ I/孔，各組均做3個重復(fù)，置于37°C培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，或如圖3所示，由抑菌實驗結(jié)果可見，用胃蛋白酶水解產(chǎn)生了有活性的物質(zhì)，并且這種抗菌物質(zhì)是由重組多肽產(chǎn)生的。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要 求范圍當中。
權(quán)利要求
1.編碼新型多肽的核苷酸序列，其特征在于，如SEQID N0:1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，在所述核苷酸序列的5’端引入BamHI位點，且在3’端引入XhoI位點，BamHI和XhoI位點酶切后得酶切片段，同時對pGEX_4T_l上述位點進行酶切后，連接所述酶切片段和酶切后的PGEX-4T-1連接，得重組載體。
4.權(quán)利要求2所述重組載體制備的重組菌株。
5.權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼的新型多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
6.權(quán)利要求5所述的新型多肽的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: A新型多肽基因的合成及表達載體構(gòu)建 將如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的編碼序列5’和3’端引入BamHI和XhoI酶切位點，與PGEX-4T-1分別進行酶切后再連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到BL21，構(gòu)建重組菌株； B誘導(dǎo)表達 步驟A所得重組菌株單菌落擴大培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)后，37°C、180r/m振搖培養(yǎng)5h，4°C、12000r/m離心IOmin收集菌體，按每IOOml培養(yǎng)液加入20ml PBS重懸沉淀，得新型多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的新型多肽的制備方法，其特征在于:步驟A所得重組菌株抗性培養(yǎng)至富集后，收集菌體，所述菌體中含有所述新型多肽。
8.權(quán)利要求5所述的新型多肽的制劑，其特征在于，所述制劑為水解后的所述新型多肽，即水解抗菌肽。
9.權(quán)利要求8所述的制劑的制備方法，其特征在于，在所述抗菌肽中調(diào)節(jié)pH值至1.5-2.0，加入胃蛋白酶至充分水解，并調(diào)節(jié)pH至中性，離心后收集上清液；上清液經(jīng)微濾、噴霧干燥或凍干，即為水解抗菌肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型多肽及其重組水解多肽的制備方法，具體為抗菌肽及其制備方法，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；本發(fā)明根據(jù)胃蛋白酶的水解特性，人工設(shè)計了一條可被其良好水解的多肽，根據(jù)大腸桿菌BL21菌株的密碼子偏好性，化學(xué)合成編碼序列，克隆到pGEX-4T-1質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到BL21菌株，用IPTG誘導(dǎo)，實現(xiàn)以包含體形式高效表達的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白。收集誘導(dǎo)表達菌體，在胃蛋白酶水解作用下釋放出耐受胃蛋白酶的有活性的抗菌肽。重組新型多肽及其水解多肽可作為畜禽飼料添加劑或用于畜禽疾病的預(yù)防與治療。
文檔編號C07K14/00GK103194442SQ20131010806
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者沈克飛, 鄭華, 曹蘭, 徐登峰, 付利芝, 楊睿, 王孝友 申請人:重慶市畜牧科學(xué)院