非天然氨基酸標(biāo)記的目的蛋白或肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及非天然氨基酸標(biāo)記的目的蛋白或肽的生產(chǎn)及制備。例如，本發(fā)明涉及經(jīng)過定點(diǎn)突變的人干擾素α2b，定點(diǎn)修飾的人干擾素α2b，所述干擾素可以是不同種屬及不同類型的。本發(fā)明還涉及定點(diǎn)突變和定點(diǎn)修飾干擾素的方法，所述方法包括使用基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)將非天然氨基酸定點(diǎn)引入干擾素基因中，借助非天然氨基酸與修飾劑，如聚乙二醇與生長激素定點(diǎn)連接。本發(fā)明進(jìn)一步涉及定點(diǎn)突變或修飾的干擾素的應(yīng)用，如作為穩(wěn)定、長效干擾素等的用途。
【專利說明】非天然氨基酸標(biāo)記的目的蛋白或肽的制備

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)或肽(例如干擾素）的非天然氨基酸的定點(diǎn) 插入及定點(diǎn)修飾方法。所述方法包括基于基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)將非天然氨基酸定點(diǎn)引入蛋 白質(zhì)或肽(例如干擾素）中，以及借助非天然氨基酸與修飾劑，例如聚乙二醇的定點(diǎn)連接。

【背景技術(shù)】
[0002] 下面以干擾素為例說明本發(fā)明的【背景技術(shù)】，但是下述內(nèi)容無論如何都不能理解為 其是現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)，也無論無何都不能認(rèn)為本發(fā)明的僅僅適用于干擾素。
[0003] (1)干擾素
[0004] 干擾素是細(xì)胞在誘生劑作用的條件下產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，具有抑制病毒復(fù)制，抑 制細(xì)胞分裂，及免疫調(diào)節(jié)等功能。人干擾素 a 2b分子量約為19kD，由165個氨基酸組成， 序列如下：
[0005] CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEM IQQIFNLFS TKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILA VRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVR AEIMRSFSLSTNLQESLRSKE (SEQ ID N0：1)
[0006] 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對個別密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量，所用編 碼人干擾素 a 2b的編碼序列為：
[0007] TGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCCGCCGCACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGCGCCGC ATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACCGCCATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAA GGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTG CTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATA CAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAAT CACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTT CTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAA (SEQ ID NO ：2)
[0008] 干擾素是商品化較早的生物制品，自從1986年美國FDA批準(zhǔn)Roch公司的干擾素 a 2a及Schering公司的干擾素 a 2b上市，目前干擾素已經(jīng)成為世界上基因工程藥物的重 要成員。干擾素在我國也是第一個投放市場的基因藥物，已經(jīng)獲得了廣泛的使用。其在我 國慢性乙型肝炎等治療方面取得的重要效益和經(jīng)濟(jì)利益，使干擾素成為抗病毒和抗癌癥方 面最廣泛應(yīng)用的藥物之一。
[0009] 作為基因藥物，干擾素半衰期短而治療周期長，需要患者頻繁的注射給藥，大大降 低了患者的依從性以及干擾素的應(yīng)用價(jià)值。因此，改善干擾素藥代動力學(xué)的研究正在世界 范圍內(nèi)廣泛進(jìn)行。
[0010] (2)聚乙二醇修飾
[0011] 共價(jià)交聯(lián)聚乙二醇是增加生物分子水溶性，調(diào)節(jié)免疫原性，延長其半衰期的常用 方法。利用聚乙二醇修飾干擾素，延長其半衰期，改善其生物學(xué)特性，已經(jīng)是得到應(yīng)用的成 功技術(shù)。此前已經(jīng)有美國先靈葆雅公司生產(chǎn)的佩樂能，及羅氏公司生產(chǎn)的派羅欣作為PEG 化干擾素通過FDA認(rèn)證進(jìn)入了醫(yī)藥市場。
[0012] 但是，此兩種藥物所使用的PEG連接方法都可以和干擾素上多個位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)， 因此會產(chǎn)生多聚體和同分異構(gòu)體。作為細(xì)胞因子類藥物，干擾素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)需要和相 應(yīng)的受體結(jié)合，而非理想位點(diǎn)的不可控PEG修飾會明顯阻礙干擾素與其受體分子結(jié)合，從 而會大大減少PEG化干擾素的生物學(xué)活性；而多PEG化及單PEG同分異構(gòu)體的產(chǎn)生，又對工 業(yè)生產(chǎn)的后期處理帶來高成本的影響，且由于同分異構(gòu)體的分離的復(fù)雜性，在工業(yè)化生產(chǎn) 中分離同分異構(gòu)體的步驟往往被省略。已上市的兩種PEG化干擾素都為多位點(diǎn)單PEG修飾 的同分異構(gòu)體混合物，相比于未修飾干擾素，其生物學(xué)活性大大下降。
[0013] 針對此問題，國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表了多篇關(guān)于單PEG化修飾的干擾素方法。半胱氨 酸的定點(diǎn)突變修飾PEG是單修飾的常用方法，其利用半胱氨酸上特有的巰基作為活性基 團(tuán)，通過特異性地和活性PEG反應(yīng)進(jìn)行修飾（Mary S.Rosendahl et al, Bioconjugate Chem. 2005; Stacie J. Bell et al, Bioconjugate Chem. 2008)，此種方法雖然可以一定程 度上解決單PEG修飾的異構(gòu)體問題，但對氨基酸序列中已有半胱氨酸的蛋白質(zhì)而言，引 入多余的半胱氨酸未必可以達(dá)到理想的效果，可能會造成蛋白質(zhì)的多聚化，二硫鍵的錯 配等嚴(yán)重問題；Sibu Balan等對干擾素進(jìn)行定點(diǎn)的二硫鍵修飾，得到了單PEG修飾的干 擾素 （Sibu Balan et al, Bioconjugate Chem. 2007)，但二硫鍵往往參與形成蛋白質(zhì)的 活性口袋，并對蛋白質(zhì)形成正確的折疊起到重要作用，也因此成為針對二硫鍵的定點(diǎn)修 飾技術(shù)的嚴(yán)重限制；另外，也有通過改變PH以達(dá)到定點(diǎn)N端的PEG修飾方法（Amartya Basu et al, Biocon jugate Chem. 2006)，以及利用 Dock-and-lock 融合蛋白技術(shù)修飾 PEG(Chien_Hsing Chang et al, Bioconjugate Chem. 2009)等，但都無法回避位點(diǎn)的局限 性以及修飾條件的復(fù)雜性問題。
[0014] 利用疊氮和炔的Click反應(yīng)在生物分子體系中進(jìn)行修飾是近年來研究的熱門領(lǐng) 域。Natalie W. Nairn等利用甲硫氨酸缺陷型菌在干擾素 β中引入含有疊氮基團(tuán)的非天 然氨基酸，然后利用有銅催化的Click反應(yīng)進(jìn)行單位點(diǎn)的PEG修飾（Natalie W. Nairn et al, Bioconjugate Chem. 2012)。但是此種方法僅能針對蛋白質(zhì)中甲硫氨酸位點(diǎn)引入設(shè)計(jì)好 的非天然氨基酸，如果蛋白質(zhì)中有多個甲硫氨酸位點(diǎn)，要達(dá)到單PEG修飾的目的，則需要定 點(diǎn)突變其余位點(diǎn)的甲硫氨酸，如此以來，無論在位點(diǎn)選擇的靈活性上，及操作的復(fù)雜性上， 都有著很大的限制。
[0015] (3)遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)
[0016] 近年來遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)發(fā)展迅速，利用琥珀終止密碼子為有義編碼子，通過引 入相應(yīng)的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最終可以將設(shè)計(jì)好的非天然氨基酸引入蛋白質(zhì)中。 根據(jù)非天然氨基酸的性質(zhì)，可以賦予蛋白質(zhì)特殊的功能。到目前為止，這一技術(shù)已經(jīng)將幾 十種非天然氨基酸成功地定點(diǎn)表達(dá)在活細(xì)胞的蛋白質(zhì)當(dāng)中，涉及的非天然氨基酸包括炔 基和疊氮等，利用這些生物體中本來不存在的特殊基團(tuán)，就可以特異性地對蛋白質(zhì)進(jìn)行定 點(diǎn)修飾。
[0017] 面對現(xiàn)有技術(shù)中干擾素修飾不均勻，分離純化工藝復(fù)雜等問題，該領(lǐng)域迫切需要 能夠任意位點(diǎn)特異性修飾功能基團(tuán)的方法.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 發(fā)明人經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的思考和研究，利用古甲烷球菌的tRNA(tRNAPyl)和吡咯賴 氨酰-tRNA合成酶（tRNA Pyl/PylRS)的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)使非天然氨基酸定點(diǎn)摻入到蛋白中， 從而得到定點(diǎn)突變的目的蛋白或肽，例如人干擾素。然后將所述定點(diǎn)突變的干擾素作為可 被進(jìn)一步定點(diǎn)修飾的原料，對該定點(diǎn)突變的干擾素進(jìn)行進(jìn)一步修飾，進(jìn)而得到單一位點(diǎn)定 點(diǎn)修飾的目的蛋白（例如干擾素)。所述的定點(diǎn)修飾例如為PEG化，S卩，將PEG定點(diǎn)修飾入目 的蛋白（例如干擾素）中，從而得到單一位點(diǎn)PEG修飾的長效干擾素。
[0019] 相比于其它方法，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可體現(xiàn)在如下中的一個或幾個：
[0020] 1.可以在蛋白質(zhì)任意位點(diǎn)引入非天然氨基酸，從而創(chuàng)造可以僅對該位點(diǎn)進(jìn)行特異 性修飾的原料蛋白；
[0021] 2.利用非天然氨基酸上特有的活性基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)高效，特異性的修飾目的；
[0022] 3.任意位點(diǎn)的PEG修飾可以帶來更好的修飾效果，修飾在非活性位點(diǎn)，有可能實(shí) 現(xiàn)藥效減少最小化和藥代性能最優(yōu)化的修飾目的；修飾在抗原暴露區(qū)，可以實(shí)現(xiàn)免疫原性 降低的效果；修飾在易被蛋白酶水解區(qū)，可以實(shí)現(xiàn)有效避被免體內(nèi)蛋白酶降解目的；和
[0023] 4.通過修飾條件的優(yōu)化，利用環(huán)辛炔介導(dǎo)的無銅Click反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)高效，對蛋 白無害，簡單易行的修飾反應(yīng)。
[0024] 具體地，在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，提供了引入非天然氨基酸的目的蛋 白（例如人干擾素)，主要通過兩個步驟：（1)構(gòu)建含有在選定的位點(diǎn)上具有琥珀密碼子突變 的編碼目的蛋白（例如人干擾素）基因的載體，（2)獲得pSUPAR-YAV-tRNA Pyl/PylRS質(zhì)粒，將 步驟（1)與（2)在合適的宿主菌中共表達(dá)，且在培養(yǎng)基中填入需要的非天然氨基酸，獲得引 入突變的目的蛋白（例如人干擾素)。
[0025] 該突變系統(tǒng)的原理在于：突變型的tRNAPyl/PylRS滿足下列關(guān)系：（1):突變型的 tRNAPyl不能利用宿主細(xì)胞的賴氨酰tRNA酶，只能被突變型的PylRS?；唬?):突變型的 PylRS只能?；痶RNAPy1，不能?；渌黷RNA，因此，突變型tRNAPyl和PylRS之間的關(guān)系是 正交性的，即突變型的PylRS只能酰化突變型tRNA Py1，同時突變型的tRNAPyl只能被突變型 的PylRS?；簿褪钦f同一質(zhì)粒中的突變型的tRNA Pyl和PylRS是絕對的相互專一的。這 種正交性的酶并且是只有這種酶可以把非天然氨基酸酰化到這種正交的tRNA上，并且只 能?；@種tRNA，而不能?；渌膖RNA。獲得的正交賴氨酰tRNA合酶/tRNA系統(tǒng)，使非 20種常見氨基酸的Lys-azido (也可稱為：Lys -疊氮）與琥珀密碼子相對應(yīng)，從而將非天 然氨基酸定點(diǎn)引入到目的蛋白（例如人干擾素）中。
[0026] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，通過將帶有琥珀密碼子的人干擾素基因插入 到載體(例如pET-21 (a) +質(zhì)粒)中，將插入后得到的載體和所述的pSUPAR-YAV-tRNA/PylRS 一起轉(zhuǎn)化大腸桿菌工程菌，然后可通過在發(fā)酵液中添加非天然氨基酸例如Lys-azido獲得 定點(diǎn)突變的目的蛋白（例如人干擾素)。
[0027] 在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種定點(diǎn)引入非天然氨基酸 的突變重組蛋白或肽(例如人干擾素）及其定點(diǎn)修飾(例如聚乙二醇化）的方法，該突變方法 為針對蛋白或肽(例如人干擾素）中特定位點(diǎn)引入的非天然氨基酸Lys-azido,其特有的疊 氮基團(tuán)可以特異性地和修飾劑(例如炔-聚乙二醇）發(fā)生Click反應(yīng)，從而將非天然氨基酸 定點(diǎn)偶聯(lián)在目的蛋白（例如人干擾素）上。
[0028] 在本發(fā)明的另外的實(shí)施方案中，將純化的Lys - azido定點(diǎn)突變目的蛋白或肽，例 如人干擾素蛋白與聚乙二醇(聚乙二醇-炔）進(jìn)行無銅或有銅催化的Click反應(yīng)，使得例如 分子量5k, 10k, 20k, 30k, 40k (直線，分枝型）的PEG通過目的蛋白（例如干擾素）上的非天 然氨基酸對干擾素實(shí)行定點(diǎn)修飾。經(jīng)簡單離子交換色譜純化即可獲得PEG-Lys-azido-目 的蛋白（肽)，例如PEG-Lys-azido-IFN。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)初步證明，經(jīng)PEG定點(diǎn)修飾的人干擾素 依然保持其原有的生物活性。
[0029] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明選取了 0rigamiB(DE3)表達(dá)體系，此種感受 態(tài)細(xì)胞通過基因改造，缺失蛋白還原途徑的兩個關(guān)鍵酶，從而穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的二硫鍵，使菌 體內(nèi)蛋白更易形成天然構(gòu)象，增強(qiáng)蛋白可溶性。
[0030] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，出于方便后續(xù)純化的考慮，本發(fā)明可在目的蛋白（例 如干擾素)C端引入若干個(例如6個)組氨酸，蛋白表達(dá)出來后，可以通過簡單的Ni-NTA親 和純化，一步得到高純度的干擾素純品。
[0031] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，利用Click反應(yīng)對含有疊氮基團(tuán)的目的蛋白或肽(例如 干擾素）進(jìn)行修飾，其中修飾劑可為有末端炔基的修飾物，借助一價(jià)銅的催化作用，實(shí)現(xiàn)定 點(diǎn)的修飾；或者修飾劑為以環(huán)辛炔為修飾基的修飾物，直接實(shí)現(xiàn)對目的蛋白或肽，例如干擾 素的高效且無害的修飾。
[0032] 更為具體地，本發(fā)明提供了：
[0033] 1.定點(diǎn)突變的蛋白或肽，例如人干擾素，其至少1個位點(diǎn)上的氨基酸被突變?yōu)榉?天然氨基酸，所述非天然氨基酸為：
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 表達(dá)突變的tRNAPyl/PylRS的質(zhì)粒，其是從保藏日為2013年4月8日、保藏號為CGMCC No :7432 的大腸埃希氏菌 pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS 中獲取的 pSUPAR-YAV-tRNAPyl/PylRS 質(zhì)粒。
2. 微生物，其含有權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物，其是大腸桿菌。
4. 制備含有非天然氨基酸的目的蛋白（例如干擾素）的方法，包括步驟： (1) 選擇步驟：在目的蛋白的氨基酸序列中選擇期望突變的一個或多個特定氨基酸位 占. (2) 基因突變：將編碼對應(yīng)于（1)中選擇的位點(diǎn)的目的蛋白的氨基酸的密碼子用基因 工程方法突變?yōu)殓昝艽a子； (3) 表達(dá)載體構(gòu)建：將（2)基因突變步驟得到的突變的目的蛋白的編碼序列與合適的 載體可操作地連接，得到突變序列表達(dá)載體； (4) 獲得權(quán)利要求1的質(zhì)粒； (5) 表達(dá)：將（3)得到的突變序列表達(dá)載體與（4)的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染相同的宿主細(xì)胞，將 轉(zhuǎn)染成功后的宿主細(xì)胞在含有Lys-azido的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在合適的條件下誘導(dǎo)表達(dá)； (6) 純化含有非天然氨基酸的干擾素；和 (7) 任選的，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性檢測。
5. 權(quán)利要求4的制備含有非天然氨基酸的目的蛋白的方法，其中在步驟（7)之后還進(jìn) 一步包括： (i )對目的蛋白中的非天然氨基酸進(jìn)行特異性化學(xué)修飾，示例性地，所示修飾包括聚乙 二醇化、糖基化或?；?；和 (i i )任選地，對（i )中經(jīng)修飾的干擾素進(jìn)行穩(wěn)定性或活性檢測，相比野生型得到提高的 目的蛋白（例如干擾素）為改良的目的蛋白（例如干擾素)。
6. 蛋白質(zhì)，其是根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法獲得的。
7. 定點(diǎn)突變的蛋白或肽，例如人干擾素，其至少1個位點(diǎn)上的氨基酸被突變?yōu)榉翘烊?氨基酸，所述非天然氨基酸為：
所示的 Lys-azido。 示例性地，所述突變位點(diǎn)可為SEQ ID NO :1中任意位點(diǎn)上一個或多個的氨基酸。優(yōu) 選地，所述突變位點(diǎn)選自：示于SEQ ID NO :1的序列的第P4位，H7位，S8位，K31位，H34 位，E51 位，A74 位，G102 位，T106 位，E107 位，Mill 位，Y129 位，K133 位，K134 位，P137 位，E159位或其他對活性影響較小的位點(diǎn)。
8. 定點(diǎn)突變的目的蛋白（例如干擾素)，其與示于突變前目的蛋白的氨基酸(例如SEQ ID NO :1)的序列的區(qū)別在于：在突變前目的蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO :1)所示的 序列的第N位的氨基酸被突變?yōu)長ys-azido,所述突變氨基酸與突變前目的蛋白氨基酸序 列(例如SEQ ID NO :1)所示的序列的連接方式如下式所示：
由札到R2的方向?yàn)榘被嵝蛄械腘末端到C末端方向，札為突變前目的蛋白（例如SEQ ID NO :1)所示序列的第1至第N-1位氨基酸殘基， R2為突變前目的蛋白（例如SEQ ID NO :1)所示序列的第N + 1位至C末端的氨基酸殘 基， R4 為 W 〇 示例性地，所述第Ν位氨基酸可為SEQ ID NO :1中任意位點(diǎn)上的一個或多個氨基酸。優(yōu) 選地，所述第N位的氨基酸選自第P4位，H7位，S8位，K31位，H34位，E51位，A74位，G102 位，T106位，E107位，Mill位，Y129位，K133位，K134位，P137位，E159位或其他對活性 影響較小的位點(diǎn)的中一個或多個。
9.經(jīng)過修飾的定點(diǎn)突變的目的蛋白（例如干擾素)，其結(jié)構(gòu)如下式所示： 式⑴：
或式（II)
其中，Ri為突變前目的蛋白（例如SEQ ID NO :1)所示序列的第1至第N-1位氨基酸殘 基， R2為突變前目的蛋白（例如SEQ ID NO :1)所示序列的第N + 1位至C末端的氨基酸殘 基， R3為相同或不同分子量PEG，環(huán)糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修飾基團(tuán)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的經(jīng)修飾的定點(diǎn)突變的目的蛋白，所述修飾為在R3上連接不同分 子量的PEG，環(huán)糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修飾基團(tuán)。
11. 編碼權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的突變的目的蛋白（例如干擾素）的核酸分子。示 例性地，所述核酸分子與編碼SEQID N0:1的核酸分子SEQ ID N0:2的區(qū)別在于，編碼SEQ ID N 0 :1 的第 P4 位，H7 位，S8 位，K31 位，H34 位，E51 位，A74 位，G102 位，T106 位，E107 位，Mill位，Y129位，K133位，K134位，P137位，E159位或其他對活性影響較小的位點(diǎn)的 一個氨基酸的密碼子被突變?yōu)殓昝艽a子。
12. 核酸載體，其可操作地連接有權(quán)利要求11的核酸分子。
13. 宿主細(xì)胞，其中含有權(quán)利要求12的核酸載體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，其中還含有權(quán)利要求1的質(zhì)粒。
15. 制備定點(diǎn)PEG化的目的蛋白（例如干擾素）的方法，包括： (1) 獲取甲氧基聚乙二醇胺及聚乙二醇單甲醚乙烯醚； (2) 合成催化劑BTTES，或環(huán)辛炔； (3) 將PEG與環(huán)辛炔進(jìn)行偶聯(lián)，得到無需銅離子催化的活性PEG ;及將聚乙二醇單甲醚 乙烯醚經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)得到末端含炔基的PEG ;和 (4) 將權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的蛋白（例如干擾素）與（3)的活性PEG反應(yīng)，得到用 聚乙二醇定點(diǎn)修飾的突變的目的蛋白（例如干擾素)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中甲氧基聚乙二醇胺的分子式為CH3〇- (CH2CH20) nCH2CH2NH2，分子量范圍2kD-100kD，n為1 一 60的整數(shù)；聚乙二醇單甲醚乙烯醚的分子式為 CH30-(CH2CH20)nCH2CH 20_CH=CH2，分子量范圍 2kD-100kD，η 為 1 - 60 的整數(shù)。
17. 定點(diǎn)改良的目的蛋白（例如干擾素)，其在權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的蛋白（例如 干擾素）的非天然氨基酸位置定點(diǎn)引入修飾，例如PEG修飾，優(yōu)選所述PEG的分子量范圍為 2kD-100kD。
18. 組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的蛋白（例如干擾素)或者權(quán) 利要求17的定點(diǎn)改良的目的蛋白。
19. 藥物組合物，其中含有有效量的權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的蛋白（例如干擾素)或 者權(quán)利要求17的定點(diǎn)改良的目的蛋白，以及藥學(xué)上可以接受的載體。
20. 權(quán)利要求6 - 10中任一項(xiàng)的目的蛋白，或者權(quán)利要求17的定點(diǎn)改良的目的蛋白在 制備長效、穩(wěn)定性目的蛋白，用于抗病毒，治療多種惡性腫瘤，免疫調(diào)節(jié)的藥物中的用途。
【文檔編號】C07K1/107GK104099360SQ201310128367
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月12日
【發(fā)明者】周德敏, 陳景賢, 張博, 俞飛, 張傳領(lǐng), 司龍龍 申請人:北京大學(xué)