專利名稱：一種抗雜色曲霉素的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，具體而言涉及抗雜色曲霉素單克隆抗體ASH，還涉及該單克隆抗體在制備雜色曲霉素檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前已知污染谷物的霉菌毒素約有100種，霉菌毒素是霉菌的代謝次生物。飼料中的霉菌毒素除了引起動(dòng)物霉菌毒素中毒，大部分還可抑制動(dòng)物免疫，降低抵抗力，從而誘發(fā)其他疾病。動(dòng)物試驗(yàn)表明:霉菌毒素能引起心率減慢、呼吸加快、脫毛和流廣等癥狀。霉菌毒素還可在畜產(chǎn)品中殘留，間接危害人類健康。雜色曲霉素(Sterigmatocys簡(jiǎn)稱ST)是一種雜環(huán)化合物具有很強(qiáng)的肝及腎臟毒素，能誘發(fā)多種腫瘤。南非某些地區(qū)的肝癌高發(fā)可能與ST有關(guān)。雜色曲霉素是，可導(dǎo)致膽管癌和肝癌，有致突變 性，但對(duì)食品的污染頻率較低。ST還可轉(zhuǎn)化成更強(qiáng)烈的致癌物黃曲霉毒素。ST還能引起一些動(dòng)物疾病。ST可有10多種真菌代謝產(chǎn)生，在人工培養(yǎng)基的產(chǎn)量高達(dá)10g/kg。已知可被ST污染的食品包括:大米、小麥、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等。雜色曲霉素經(jīng)三氯化鋁噴霧后加熱，可在365nm波長(zhǎng)紫外光下呈黃色熒光。衛(wèi)生研究所建立的檢測(cè)雜色曲霉素的薄層色譜法已于1984年列為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T5009.25-1996)。該法對(duì)大米、玉米、小麥的最低檢出量為25 μ g/kg,黃豆、花生為50 μ g/kg。由于ST危害大，分布廣，要減少其對(duì)人畜的影響，有效而快速的檢測(cè)食物及飼料中的ST就顯得非常重要。確診ST中毒則更有賴于從患者的組織或分泌物、排泄物中檢出。與傳統(tǒng)應(yīng)用的生物學(xué)檢測(cè)法、薄層層析法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)等相比，免疫化學(xué)檢測(cè)法對(duì)真菌毒素的檢測(cè)具有快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確、可以批量檢測(cè)、樣品處理簡(jiǎn)單、能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)。而免疫化學(xué)檢測(cè)ST的前提則是需要具備針對(duì)ST的抗體。以食品的天然組分形式存在的天然霉菌毒素則不易被識(shí)別，且由于潛在毒性大，從而會(huì)對(duì)消費(fèi)者的健康造成很大的威脅。越早進(jìn)行霉菌毒素檢測(cè)就越容易將霉菌毒素產(chǎn)生的危害降到最低。如能從源頭就發(fā)現(xiàn)霉菌毒素，則更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的飼料給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)危害，從而使企業(yè)包括食品安全蒙上陰影。實(shí)際操作中，如果在飼料原料采購(gòu)環(huán)節(jié)就采用快速篩選的方法，查看飼料原料是否含有霉菌毒素，則可以使企業(yè)避免使用含霉菌毒素的原料生產(chǎn)飼料。所以，研制對(duì)霉菌毒素快速、高靈敏、高特異性的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種抗雜色曲霉素單克隆抗體ASH，所述單克隆抗體包括輕鏈和重鏈，其氣基酸可變區(qū)序列分別如序列表中SEQ ID NO:I和SEQ ID NO:2所不。本發(fā)明還公開了上述單克隆抗體ASH的制備方法，主要包括如下:1.抗雜色曲霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建I)抗原的制備(BSA-ST)
將ST與稀硫酸在熱水浴中回流衍生成ST半縮醛衍生物，ST半縮醛衍生物經(jīng)過硅膠G層析柱純化后在中性磷酸鹽緩沖液中(PBS)與牛血清白蛋白(BSA)反應(yīng)5小時(shí)，低溫下加入NaBH4還原，再用稀鹽酸除掉過量的NaBH4，然后兌水透析，備用。由此得到復(fù)合抗原BSA-ST,分裝凍干，免疫動(dòng)物。用紫外吸收光譜確定BSA與ST的偶聯(lián)率。2)動(dòng)物免疫5只BABLC用BSA-ST進(jìn)行免疫，200 μ g/只/次，免疫4次，進(jìn)行小鼠尾血效價(jià)測(cè)定。最終要求ELISA效價(jià)達(dá)到1: 25600以上。3)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備(融合前一天制備完成)將未經(jīng)免疫的小鼠(BALB/C或昆明小鼠)拉頸處死，摘除眼球取血。將未經(jīng)免疫的小鼠用75%酒精浸泡消毒，取出后放在超凈工作臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。剪開小鼠腹部皮膚(不要損傷腹膜)、沿切口上下撕開皮膚，充分暴露腹部，換剪刀、鑷子，剪開腹膜，切口大小可以允許尖吸管隨意進(jìn)出，取一只尖端平整的尖吸管吸一管培養(yǎng)液，加到小鼠腹腔中，涮一涮，吸出，反復(fù)幾次(一般2 3次)，注意不要戳破小鼠消化道，污染細(xì)胞。離心收集的飼養(yǎng)層細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞懸于HAT培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，根據(jù)活細(xì)胞量進(jìn)行稀釋，使每毫升含約40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞。混勻后倒入滅過菌的排槍槽用排槍將細(xì)胞懸液加于96孔培養(yǎng)板的小孔中(或用滴管滴入96孔培養(yǎng)板的小孔)37°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。4)免疫脾細(xì)胞的制備免疫的BALB/C小鼠，眼球取血，作為陽(yáng)性對(duì)照用。免疫的BALB/C小鼠用75%酒精浸泡消毒，取出后放在超凈工作臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，剪開并充分剝離腹部皮膚，換一套無(wú)菌鑷子和剪子提起腹膜，剪開一小口，再換一套無(wú)菌鑷子和剪子，用剪刀分離脾臟，盡量不要帶結(jié)締組織，將脾臟轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞篩上，用剪刀剪開脾臟，用20ml玻璃注射器活塞輕輕擠壓脾臟，用滴管吸取無(wú)血清1640培養(yǎng)基沖洗活塞和鋼網(wǎng)，反復(fù)幾次上邊操作，直至脾臟僅剩包膜。將濾液離心用無(wú)血清1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，取少量脾細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)活細(xì)胞比例(應(yīng)大于80 % )，確定活脾細(xì)胞的數(shù)量，根據(jù)脾細(xì)胞的數(shù)量，按5: I 10:1準(zhǔn)備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，(一只小鼠脾細(xì)胞大約IO8個(gè)，用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞 2 X IO7 個(gè)，融合用 50% PEG40001ml)。5)骨髓瘤細(xì)胞懸液在融合前7 10天將凍存在液氮中的骨髓瘤細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)I 2代。選擇生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。在細(xì)胞融合當(dāng)天收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，對(duì)收集的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力檢測(cè)。透亮不著色的活細(xì)胞應(yīng)占90%以上。計(jì)數(shù)后，根據(jù)脾細(xì)胞的數(shù)量，按5:1 10:1吸取相應(yīng)數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞懸液注入滅菌的50mL離心管中備用(2 X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞)。6)細(xì)胞融合及培育 將裝PEG4000的玻璃離心管置于酒精燈上，熔化后稍冷卻，加入0.5ml無(wú)血清1640，混勻，即為50% PEG4000，37°C水浴平衡溫度備用。將準(zhǔn)備好的脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞兩種細(xì)胞懸液充分混勻后離心。再用RPM1-1640培養(yǎng)液洗一次。將上清倒干(或用滴管吸凈殘留液體)，以免影響PEG的濃度。用手指輕輕彈松沉淀細(xì)胞團(tuán)，使兩種細(xì)胞混勻成糊狀。將離心管置于37°C水浴中，緩慢加入lmL37°C預(yù)熱的50% PEG4000邊加邊攪勻，Imin完成。靜置lmin，然后將一吸管無(wú)血清培養(yǎng)液在Imin內(nèi)加入細(xì)胞中，動(dòng)作盡量輕柔，邊加邊攪，最后補(bǔ)液至20ml。離心棄上清液，將細(xì)胞輕輕懸于20%進(jìn)口胎牛RPMI1640HAT培養(yǎng)基中。鋪96孔板5塊。第二天檢查是否污染，第五天計(jì)算融合率，第七天換液，以后每隔3 4天換液一次，第十天檢測(cè)陽(yáng)性克隆。每天觀察每孔克隆生長(zhǎng)情況，做好記錄，換液時(shí)，吸出一半的培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)基，骨髓瘤細(xì)胞完全被殺死后，改用HT培養(yǎng)基。通過上述方法獲得可表達(dá)抗雜色曲霉素抗體的細(xì)胞，其表達(dá)的抗雜色曲霉素抗體命名為ASH。2.抗雜色曲霉素抗體ASH的輕、重鏈基因的釣取通過ELISA的方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的上清，篩選出能夠和雜色曲霉素結(jié)合的細(xì)胞株，提取篩選的細(xì)胞株的細(xì)胞RNA，經(jīng)RT-PCR，用兩對(duì)特異性引物釣取抗體的輕重鏈基因。常規(guī)法連接入載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落，提取質(zhì)粒PCR鑒定后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。通過上述步驟，構(gòu)建了含有抗雜色曲霉素抗體ASH輕、重鏈基因的載體，經(jīng)測(cè)序得到雜色曲霉素抗體ASH輕、重鏈基因信息，輕鏈其氨基酸可變區(qū)序列如序列表中SEQ ID NO:1，重鏈氨基酸可變區(qū)序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明利用單克隆抗體分型試劑盒對(duì)ASH抗體進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示本發(fā)明所述的ASH抗體為IgG2a。本發(fā)明通過ELISA交叉反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果顯示本發(fā)明所述的ASH抗體特異性的與雜色曲霉素結(jié)合，而不與 BSA結(jié)合，Western Blot檢測(cè)結(jié)果同ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。本發(fā)明利用上述方法篩選得到的抗體ASH和本發(fā)明人通過噬菌體庫(kù)篩選得到的抗雜色曲霉素抗體ASPl (ScFv抗體)，制備了檢測(cè)雜色曲霉素試劑盒，其中ASPl輕鏈和重鏈的可變區(qū)氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示。所述檢測(cè)雜色曲霉素試劑盒包括:抗雜色曲霉素ASH抗體、HRP標(biāo)記的抗雜色曲霉素ASPl抗體(HRP-Sulfo-SMCC-ASPl)、辣根過氧化物酶底物緩沖液、ST標(biāo)準(zhǔn)品(100ug/ml，0.1ml)、陰性對(duì)照樣品BSA。其中辣根過氧化物酶底物緩沖液:稱取10mg3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于5ml無(wú)水乙醇中制備成TMB貯存液。待使用時(shí)取0.5ml TMB貯存液加到IOml磷酸檸檬酸底物緩沖液(0.2MNa2HP04，0.1M檸檬酸)中，再加入32 μ 10.75% H2O2混勻，配置成辣根過氧化物酶底物緩沖液。本發(fā)明還公開了上述檢測(cè)雜色曲霉素ELISA試劑盒的使用方法:a)將抗雜色曲霉素ASH抗體(lmg/ml)用包被液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液)按I: 320稀釋，取稀釋后的ASH抗體稀釋液，加入酶標(biāo)板中，每孔100μ 1，4°C過夜；b)洗滌液(PH7.4PBS)清洗酶標(biāo)板3次，每次在搖床上搖5_8min ；c)取100 μ I待測(cè)樣品加入到包被的酶標(biāo)板中，37°C孵育2h，每個(gè)樣品包被2個(gè)孔，同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋依次為5pg/ul、10pg/ul、15pg/ul、20pg/ul25pg/ul、30pg/ul，每孔 100 u I ；d)將辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體ASPl (HRP-Sulfo-SMCC-ASPl)按I: 3000 I: 5000 稀釋，每孔 100μ 1，37°C孵育 2h ;e)再用洗滌液清洗5次，加辣根過氧化物酶底物緩沖液100 μ 1，顯色5min后，力口入終止液100 μ 1，終止顯色；
f)用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D450的值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而根據(jù)吸光值判斷所測(cè)樣品中ST的濃度。通過標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)上述ELISA試劑盒的靈敏度,標(biāo)準(zhǔn)品ST的稀釋度如下:500pg/μ l、250pg/μ l、125pg/μ 1、62.5pg/μ 1、31.25pg/μ 1、15.625pg/μ 1、7.8125pg/μ 1、
3.90625pg/y 1、1.953125pg/y 1,0.9765625pg/y 1,0.4882812pg/y 1,0.2441406pg/y 1，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的試劑盒能檢測(cè)的最低限度為lOpg/μ I。本發(fā)明的有益效果如下:I)本發(fā)明利用了傳統(tǒng)小鼠單抗與噬菌體抗體庫(kù)的技術(shù)相結(jié)合的方法，使雙抗夾心ELISA方法更加靈敏。噬菌體庫(kù)抗體的制備工藝更加簡(jiǎn)單，使整個(gè)ELSIA檢測(cè)數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定，更加方便快捷，傳統(tǒng)單抗作為第一抗體包被在ELISA板上，充分發(fā)揮傳統(tǒng)單抗捕捉抗原的能力。2) ST毒素ELISA檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的色譜、質(zhì)譜等方法相比所需設(shè)備簡(jiǎn)單(ELISA方法只需一臺(tái)酶標(biāo)儀或者不需檢測(cè)設(shè)備，加樣后直接進(jìn)行眼觀判定即可)。前處理程序簡(jiǎn)化(不需凈化)。檢 驗(yàn)快速，檢測(cè)容量大，檢驗(yàn)成本低。由于落方法簡(jiǎn)單易行，不需特殊設(shè)備，故可在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。谷物等可經(jīng)過抽提利抽提、濃縮并重新溶于水溶液中卻可取樣檢測(cè)。不需凈化，其檢驗(yàn)操作(不包括前處理)可在幾分鐘至幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。檢測(cè)容量根據(jù)所用固相的不同，每次可同時(shí)分析幾十個(gè)甚至更多樣品。


圖1ASH抗體與不同抗原結(jié)合情況，ST為雜色曲霉素，BSA-ST偶聯(lián)了 BSA的ST，HAS:人血清白蛋白；圖2Westem Blot檢測(cè)ASH抗體與雜色曲霉素的結(jié)合情況，I =BSA-ST泳道，2:純BSA泳道。
具體實(shí)施例方式通過參閱下述實(shí)施例可以更容易地了解本發(fā)明的內(nèi)容，這些實(shí)施例只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不意味著限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例一抗雜色曲霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的構(gòu)建一、材料20%胎牛血清:北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；無(wú)血清RPMI1640:Gibco公司產(chǎn)品；SP2/0細(xì)胞:ATCC引進(jìn)；福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑，顯色試劑TMB =Sigma公司產(chǎn)品；Balb/c以及C57BL/6小鼠；氨基蝶呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷、其余試劑均為市購(gòu)。二、方法和結(jié)果1、準(zhǔn)備工作I)氨基蝶呤(A)儲(chǔ)存液(100X):1.8mgA溶于90ml三蒸水，滴加ImM NaOH0.5ml磁力攪拌溶解，滴加ImM HCL0.5ml中和，定容到IOOml過濾滅菌，Iml分裝，_20°C儲(chǔ)存。2)次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)儲(chǔ)存液(100X):H136mg, T39mg,加三蒸水100ml,混勻后，50 60°C水浴中促溶,過濾除菌，Iml分裝，-20°C儲(chǔ)存。3)雙抗配制:青霉素鈉鹽100萬(wàn)單位(0.6gl國(guó)際單位青霉素相當(dāng)于0.60微克結(jié)晶青霉素G鈉鹽)，鏈霉素Ig溶于三蒸水IOOml過濾除菌Iml分裝，_20°C儲(chǔ)存。4)50% PEG4000:0.5g/管，高壓滅菌，_20°C儲(chǔ)存，用時(shí)酒精燈熔化后稍冷卻，加入0.5ml無(wú)血清1640，混勻，為 50% PEG。2、動(dòng)物免疫I)抗原的制備(BSA-ST)免疫抗原:將ST與稀硫酸在熱水浴中回流衍生成ST半縮醛衍生物，ST半縮醛衍生物經(jīng)過硅膠G層析柱純化后在中性 磷酸鹽緩沖液中(PBS)與牛血清白蛋白(BSA)反應(yīng)5小時(shí)，低溫下加入NaBH4還原，再用稀鹽酸除掉過量的NaBH4，然后兌水透析，備用。由此得到復(fù)合抗原BSA-ST,分裝凍干，免疫動(dòng)物。用紫外吸收光譜確定BSA與ST的偶聯(lián)率。通過SDS-PAGE電泳也能看出ST被偶聯(lián)到BSA上。2)動(dòng)物免疫 5只BABLC用BSA-ST進(jìn)行免疫，200 μ g/只/次，免疫4次，進(jìn)行小鼠尾血效價(jià)測(cè)定。最終要求ELISA效價(jià)達(dá)到1: 25600以上。3、細(xì)胞融合I)飼養(yǎng)層細(xì)胞制備(融合前一天制備完成)(I)將未經(jīng)免疫的小鼠(BALB/C或昆明小鼠)拉頸處死，摘除眼球取血。(2)自來(lái)水沖洗干凈。(3) 75%酒精浸泡消毒lOmin，取出后放在超凈工作臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。(4)取一只50ml離心管，加5 6ml無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液，剪開小鼠腹部皮膚(不要損傷腹膜)、沿切口上下撕開皮膚，充分暴露腹部，換剪刀、鑷子，剪開腹膜，切口大小可以允許尖吸管隨意進(jìn)出，取一只尖端平整的尖吸管吸一管培養(yǎng)液，加到小鼠腹腔中，涮一涮，吸出，反復(fù)幾次(一般2 3次)，注意不要戳破小鼠消化道，污染細(xì)胞。(5)離心50ml離心管中的飼養(yǎng)層細(xì)胞，1000rpm，5min，棄上清，將細(xì)胞懸于IOmLHAT培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，根據(jù)活細(xì)胞量進(jìn)行稀釋，使每毫升含約40萬(wàn)個(gè)活細(xì)胞?；靹蚝蟮谷霚邕^菌的排槍槽用排槍將細(xì)胞懸液加于96孔培養(yǎng)板的小孔中(或用滴管滴入96孔培養(yǎng)板的小孔)，每孔0.1mL約2 4萬(wàn)/孔，放置5 % 7%的CO2培養(yǎng)箱中，37°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。(6)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。(7)根據(jù)第二天細(xì)胞融合后所鋪96孔板數(shù)，制備足夠的飼養(yǎng)層細(xì)胞。2)免疫脾細(xì)胞的制備(I)免疫的BALB/C小鼠，眼球取血，作為陽(yáng)性對(duì)照用。(2)自來(lái)水沖洗干凈。(3) 75%酒精浸泡消毒lOmin，取出后放在超凈工作臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。(4)剪開并充分剝離腹部皮膚，換一套無(wú)菌鑷子和剪子提起腹膜，剪開一小口
(5)再換一套無(wú)菌鑷子和剪子，用剪刀分離脾臟，盡量不要帶結(jié)締組織。(6)將脾臟轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞篩上，用剪刀剪開脾臟，用20ml玻璃注射器活塞輕輕擠壓脾臟，用滴管吸取無(wú)血清1640培養(yǎng)基沖洗活塞和鋼網(wǎng)，反復(fù)幾次上邊操作，直至脾臟僅剩包膜。將濾液吸入50ml離心管中，最后沖洗培養(yǎng)皿，一并轉(zhuǎn)入50血離心管中，室溫靜止IOmin。(7) 1000r/min, 5min,用IOmL無(wú)血清1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，吸出明顯的組織塊。(8)取少量脾細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測(cè)活細(xì)胞比例(應(yīng)大于80% )，確定活脾細(xì)胞的數(shù)量，根據(jù)脾細(xì)胞的數(shù)量，按5:1 10:1準(zhǔn)備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，(一只小鼠脾細(xì)胞大約IO8個(gè)，用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞2 X IO7個(gè)，融合用50% PEG40001ml)。3)骨髓瘤細(xì)胞懸液(I)在融合前7 10天將凍存在液氮中的骨髓瘤細(xì)胞復(fù)蘇，培養(yǎng)I 2代。(2)選擇生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。融合前48h，將細(xì)胞接種于IOOmL培養(yǎng)瓶中，約4 6瓶，每瓶加完全培養(yǎng)液15mL，含細(xì)胞數(shù)為5 X IO4 5 X IO5個(gè)/mL。放置于5% 7% C02，37°C，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。(3)在細(xì)胞融合當(dāng)天收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于50mL離心管中，1000r/min離心5min。細(xì)胞培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(4)將細(xì)胞懸于20mL RPM1-1640培養(yǎng)液中。(5)臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力檢測(cè)。透亮不著色的活細(xì)胞應(yīng)占90%以上。計(jì)數(shù)后，根據(jù)脾細(xì)胞的數(shù)量，按5:1 10:1吸取相應(yīng)數(shù)量的骨髓瘤細(xì)胞懸液注入滅菌的50mL離心管中備用(2 X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞)。

4)細(xì)胞融合及培育(I)將裝PEG4000的玻璃離心管置于酒精燈上，熔化后稍冷卻，加入0.5ml無(wú)血清1640，混勻，即為50% PEG4000，37°C水浴平衡溫度備用。(2)準(zhǔn)備好的脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞分別1000r/min，5min20ml無(wú)血清1640洗兩次。(3)將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞混合于50mL離心管內(nèi)。(4)將兩種細(xì)胞懸液充分混勻后離心，1000r/min, 5min,棄上清液。再用RPM1-1640培養(yǎng)液洗一次。將上清倒干(或用滴管吸凈殘留液體)，以免影響PEG的濃度。用手指輕輕彈松沉淀細(xì)胞團(tuán)，使兩種細(xì)胞混勻成糊狀。(5)將離心管置于37°C水浴中，緩慢加入lmL37°C預(yù)熱的50% PEG4000邊加邊攪勻，Imin完成。靜置Imin (夏天時(shí)間為lmin,冬天時(shí)間為1.5min),然后將一吸管無(wú)血清培養(yǎng)液在Imin內(nèi)加入細(xì)胞中，動(dòng)作盡量輕柔，邊加邊攪(此時(shí)，細(xì)胞在PEG作用下已變形皺縮，加液太快，動(dòng)作過粗，會(huì)引起細(xì)胞破裂死亡)，隨后，不用計(jì)時(shí)，但仍要慢慢滴加培養(yǎng)液，最后補(bǔ)液至20ml ο(6) 1000r/min離心5min,棄上清液，將細(xì)胞輕輕懸于50mL20 %進(jìn)口胎牛RPMI1640HAT培養(yǎng)基中。鋪96孔板5塊。第二天檢查是否污染，第五天計(jì)算融合率，第七天換液，以后每隔3 4天換液一次，第十天檢測(cè)陽(yáng)性克隆。(7)每天觀察每孔克隆生長(zhǎng)情況，做好記錄，換液時(shí)，吸出一半的培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)基，骨髓瘤細(xì)胞完全被殺死后，改用HT培養(yǎng)基。通過上述方法獲得可表達(dá)抗雜色曲霉素抗體的細(xì)胞。
實(shí)施例二分泌抗雜色曲霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的篩選和鑒定一、材料20%胎牛血清:北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；無(wú)血清RPMI1640 =Gibco公司產(chǎn)品；SP2/0細(xì)胞:ATCC引進(jìn)；顯色試劑TMB:Sigma公司產(chǎn)品；二抗:羊抗小鼠-HRP ;其余試劑均為市購(gòu)。二、方法和結(jié)果
1、雜交瘤細(xì)胞篩選:(I)融合后當(dāng)雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)到一定大小，便可開始篩選抗體活性(在每次換液的時(shí)候進(jìn)行檢測(cè))。(2) ELISA檢測(cè)，取上層清液IOOmL進(jìn)行測(cè)定。通過2次檢測(cè)后確定有陽(yáng)性，就立即進(jìn)行亞克隆(細(xì)胞生長(zhǎng)約占孔底面積的1/4-1/3)，有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。將培養(yǎng)板置于37°C的5% CO2孵箱中培養(yǎng)，約5天后在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞克隆。適時(shí)換液，檢測(cè)，取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，及時(shí)凍存細(xì)胞株。通過上述方法，最終得到一株分泌抗ST高親和力的細(xì)胞株，其分泌的抗體命名為ASH。2、抗體ASH的交叉反應(yīng)檢測(cè):對(duì)細(xì)胞株分泌上清進(jìn)行了抗原、不同載體間的交叉檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):A1-A4為陰性空即ELISA板未包被任何抗原；Bl-Hl 包被純的 ST;B2-H2包被BST-ST免疫抗原；B3-H3包被純BSA蛋白；B4-H4包被純的HAS蛋白(人血清白蛋白)；B1-B4 一抗未加目的分泌液而是加入空細(xì)胞SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液；H1-H4 二抗加入空白 PBS。C、D、E、F、G為重復(fù)試驗(yàn)，一抗加入目的分泌液，二抗加入羊抗小鼠-HRP ；具體檢測(cè)步驟如下:a)按上述設(shè)計(jì)分別，在酶標(biāo)板中分別包被ST、BST_ST、BSA、HAS，每孔100 μ 1，其中Α1-Α4為陰性空白對(duì)照即ELISA板未包被任何抗原；4°C過夜。b)洗滌液清洗酶標(biāo)板3次，每次在搖床上搖5_8min，37°C下用樣品稀釋液封閉酶標(biāo)板4h以上。c)加入細(xì)胞分泌液，其中B1-B4 —抗未加目的分泌液而是加入空細(xì)胞SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)液每孔100 μ 1，其余加入分泌抗ST高親和力的細(xì)胞株分泌液每孔ΙΟΟμ 1，37°C孵育2h，再用洗滌液清洗3次。d)將二抗:羊抗小鼠-HRP按1: 3000-1: 5000稀釋，分別加入孔中，每孔100μ 1，37°C孵育2h，再用洗滌液清洗3次，其中H1-H4不加羊抗小鼠-HRP 二抗，只加入100 μ1PBS。e)加辣根過氧化物酶底物緩沖液100 μ 1，顯色5min后，加入終止液100 μ 1，終止顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D450的值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示:表I抗體ASH的交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗雜色曲霉素單克隆抗體，包括輕鏈和重鏈，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示。
2.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)雜色曲霉素的試劑、藥劑或試劑盒中的應(yīng)用。
3.—種檢測(cè)雜色曲霉素試劑盒包括:權(quán)利要求1所述的抗體、抗雜色曲霉素ASPl抗體，其中所述ASPl抗體其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)雜色曲霉素試劑盒，其特征在于，所述的抗雜色曲霉素ASPl抗體帶有生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記,所述生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記為突光標(biāo)記、放射性標(biāo)記或酶標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)雜色曲霉素試劑盒，其特征在于，所述的抗雜色曲霉素ASPl抗體為辣根過氧化酶標(biāo)記。
6.權(quán)利要求5所述的檢測(cè)雜色曲霉素試劑盒還包括:辣根過氧化物酶底物緩沖液、ST標(biāo)準(zhǔn)品(100ug/ml，0.1ml)、陰性對(duì)照樣品BSA。
7.—種檢測(cè)雜色曲霉素的方法，包括以下步驟: a)將權(quán)利要求1所述的抗雜色曲霉素抗體，濃度為lmg/ml，用包被液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液)按1: 320稀釋，取稀釋后的抗體稀釋液，加入酶標(biāo)板中，每孔100μ1，4 過夜； b)洗滌液(PH7.4PBS)清洗酶標(biāo)板3次，每次在搖床上搖5_8min ； c)取100μ I待測(cè)樣品加入到包被的酶標(biāo)板中，37°C孵育2h，每個(gè)樣品包被2個(gè)孔，同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋依次為 5pg/ul、10pg/ul、15pg/ul、20pg/ul25pg/ul、30pg/ul,每孔 100 μ I ; d)將辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體ASPl按1: 3000 1: 5000稀釋，每孔100μ 1，37°C孵育2h。
e)再用洗滌液清洗5次，加辣根過氧化物酶底物緩沖液100μ 1，顯色5min后，加入終止液100 μ I,終止顯色； f)用酶標(biāo)儀檢測(cè)0D450的值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而根據(jù)吸光值判斷所測(cè)樣品中ST的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗雜色曲霉素的單克隆抗體，所述抗體包括輕鏈和重鏈，其中輕鏈可變區(qū)氨基酸如序列表SEQ ID NO.1所示，重鏈可變區(qū)氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，本發(fā)明公開了制備上述抗體的方法。利用本發(fā)明所述的抗體制備了檢測(cè)雜色去霉素的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒的靈敏度達(dá)10pg/μl，可有效檢測(cè)樣品中雜色曲霉素的含量。本發(fā)明所述的試劑盒使用方便，不需貴重儀器，便于大范圍推廣使用。
文檔編號(hào)C07K16/14GK103214572SQ201310136959
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者江飛劍, 王海彬, 楊承剛, 韋國(guó)棟 申請(qǐng)人:中國(guó)人民共和國(guó)臺(tái)州出入境檢驗(yàn)檢疫局