專利名稱：對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲基因cry2Ah-like及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及蘇云金芽孢桿菌對鱗翅目害蟲高毒力的新的殺蟲基因 cry2Ah_like, cry2Ah_likesp, cry2Ah_likevp 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蟲害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的重要原因之一，減少蟲害的損失是增加糧食與飼料作物產(chǎn)量的重要途徑。據(jù)統(tǒng)計全球糧食與飼料作物總產(chǎn)量每年因蟲害造成的損失達(dá)14%，直接給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失高達(dá)數(shù)千億美元。我國每年因蟲害造成的損失水稻減產(chǎn)10%、小麥減產(chǎn)20%、棉花減產(chǎn)30%以上。采用噴施化學(xué)農(nóng)藥和生物殺蟲劑等防治手段固然可以減輕害蟲對農(nóng)作物的為害，但化學(xué)農(nóng)藥造成環(huán)境污染，生物殺蟲劑成本較高。長期以來，大量噴施化學(xué)殺蟲劑，不僅會增強害蟲的抗藥性，使益蟲及其它生態(tài)區(qū)系遭受破壞，而且嚴(yán)重污染環(huán)境，提高生產(chǎn)成本，破壞生態(tài)平衡。因此，減少殺蟲劑使用量，發(fā)展現(xiàn)代植物保護技術(shù)，已成為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)中必須正視的課題之一。蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌，是一種對害蟲毒力強且對天敵無毒性的昆蟲病原微生物，對高等動物和人無毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲劑，對16個目3000多種害蟲有活性。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins,ICPs)，也稱 δ -內(nèi)毒素(delta-endotoxin) [Brav0.A., Gi I IS.S., Soberon M.BacillusthuringiensisMechanisms and Use.Comprehensive Molecular InsectScienceElsevier, 2005, 175 206.]，它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白因其殺蟲效果好、對人畜無害[De Maagd R.A., Bravo A., CrickmoreN.How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to col onize theinsect world.Trends Genet, 2001, 17:193 199.]，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。

1996年全世界第一例轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在美國獲準(zhǔn)應(yīng)用，它使用的基因來自BtcryIAcο在接下來的幾年里，轉(zhuǎn)cryIAb基因的抗蟲玉米,轉(zhuǎn)cry3Aa基因的抗蟲土豆等相距問世。在中國，自1998年開始正式推廣含有crylAc/crylA基因的抗蟲棉以來，已經(jīng)被普遍種植。在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的第一個12年(1996-2007)中，由于能得到持續(xù)穩(wěn)定的收益，農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物量逐年增加。2009年有25個國家的1400萬小農(nóng)戶和大農(nóng)場主種植了 1.34億公頃(3.3億英畝)的轉(zhuǎn)基因作物，比2008年增長了 7%，即900萬公頃(2200萬英畝)，達(dá)到歷史最高點；相應(yīng)的“性狀或?qū)嶋H面積”增長了 8%，即相比2008年的1.66億公頃，增長了 1400萬公頃，達(dá)到2009年的1.8億公頃。1996年至2009年間轉(zhuǎn)基因作物種植面積空前地增長了 80倍，使轉(zhuǎn)基因成為農(nóng)業(yè)近代史上利用最快的作物技術(shù)。由于目前商品化的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的抗蟲基因種類比較單一，如此大面積推廣種植存在害蟲避難所減少與害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。因此需要不斷分離高毒力的或者新的基因組合來避免害蟲抗藥性上升的風(fēng)險。
因此，篩選分離克隆新的、高毒力的Bt殺蟲基因，可以豐富殺蟲基因資源，為轉(zhuǎn)基因作物與工程菌株提供新的基因來源，提高Bt轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的抗蟲效果，并且可以降低害蟲對Bt毒蛋白的抗性風(fēng)險，避免新的生態(tài)災(zāi)難降臨，具有重要的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新的對玉米螟、棉鈴蟲等鱗翅目害蟲具有高毒力的蘇云金芽孢桿菌晶體殺蟲蛋白基因序列，以應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌的抗藥性產(chǎn)生。對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲蛋白Cry2Ah_like, Cry2Ah_likesp, Cry2Ah_likevp,其蛋白序列分別如SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03所示。編碼上述蛋白的殺蟲基因，名稱為cry2Ah_like, cry2Ah_likesp, cry2Ah_likevp,其基因序列分別如SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06所示。含有上述基因的載體。所述載體分別為pET2Ah-like、pET2Ah_likesp 和 pET2Ah_likevp，其骨架載體為pET。 所述基因在殺滅棉鈴蟲、玉米螟中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將基因表達(dá)的蛋白制成藥劑殺滅棉鈴蟲、玉米螟。所述應(yīng)用為將基因轉(zhuǎn)化微生物或植物，使植物受體表達(dá)對棉鈴蟲、玉米螟的抗性。本發(fā)明從SC6H8菌株(新型cry2基因克隆、表達(dá)及活性分析，張靜濤，2009，碩士論文)中克隆得到了一個新的基因即cry2Ah-like，該基因序列如SEQ ID N04，蛋白序列如SEQ ID N01，該基因?qū)γ掴徬x、玉米螟具有高毒力。利用重復(fù)PCR得到了 cry2Ah-like的兩個突變體，該兩個突變基因的序列分別為SEQ ID N05, SEQ ID N06 ;蛋白序列如SEQ ID N02, SEQ ID N03，該兩個突變體基因?qū)γ掴徬x的毒力較cry2Ah_like高。本發(fā)明提供的新的基因?qū)γ掴徬x、玉米螟具有高毒力，豐富了殺蟲基因資源，同時將基應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌的抗藥性產(chǎn)生。


圖1 cry2Ah_like基因在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，圖2 cry2Ah_likesp和cry2Ah_likevp基因在大腸桿菌BL21菌株中表達(dá)，圖3殺蟲活性趨勢圖，圖4pET2類基因的載體結(jié)構(gòu)圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。Bt質(zhì)粒提取RNaseA (10mg/ml):稱取 0.1g RNaseA 溶于 IOmllOmM Tris HCl (pH7.5)，15mMNaCl中，100°C煮沸15min，冰浴冷卻，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> SC6H8菌株，申請人的實驗室有保存，可以對外公開發(fā)放。1.過夜培養(yǎng)5ml SC6H8菌液。2.離心收集菌體，用含有30mg/ml溶菌酶的25%的蔗糖溶液懸浮細(xì)胞，總體積為200 μ 1，37。。孵育 15mins。3.加入400 μ I堿裂解液(3%SDS，0.2N NaOH)，立即緩慢混勻，室溫孵育5mins。4.加入300 μ I冰冷的3Μ醋酸鈉(ρΗ4.8)，立即混勻，12000g離心IOmins05.取上清，加入等體 積的異丙醇，充分混勻，_20°C放置30mins，12000g離心5mins。6.棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，晾干后加入320ul純水溶解沉淀，加入200 μ I含有0.5mg/ml EB的7.5M醋酸銨溶液?；靹蚝蠹尤氲润w積的酹氯仿,混勻。12000g離心5mins。7.取上清，加入2倍體積冰冷的無水乙醇，充分混勻，_20°C放置30mins，12000g離心 5mins。8.去上清，70%乙醇洗滌沉淀，晾干，加入40 μ I TE溶解沉淀，加入I μ I RNase A除 RNA。0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。DNA回收(步驟參見Axygen公司試劑盒)1.在長波紫外燈下切下含所需目的DNA片段的凝膠，置于1.5mL離心管中；2.加入3倍溶膠體積的ED-A溶膠緩沖液，置于70° c水浴鍋中；3.待溶解后加入0.5個ED-A溶膠緩沖液的ED-B ；4.混勻后轉(zhuǎn)入回收柱，離心12000r/min0.5min ；5.棄去殘液,加入洗脫緩沖液W1SOO μ L,離in心12000r/min0.5min ；6.棄去殘液，加入洗脫緩沖液W2700 y L，重復(fù)一次；7.將15 30 μ L TE或超純水適量加入回收柱中，靜置5min ；8.離心 12000r/min2min,備用。E.coli質(zhì)粒提取SI:50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl (ρΗ8.0), IOmM EDTA (ρΗ8.0) ；SI1:0.2M NaOH,1%SDS (用時以 2M NaOH 和 10%SDS 稀釋)；SIII:5M KAc，用冰乙酸調(diào)至 ρΗ4.8。I)離心收集菌體，用200 μ L SI懸浮，冰浴IOmin ；2)加入SII400 μ L，翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5min ；3)加入SII1300 μ L，迅速混勻，冰浴5min ；4) 12000r/min離心8min，取上清用等體積的異丙醇沉淀；5) 12000r/min離心8min，棄上清，用70%的乙醇洗沉淀，干燥，溶解；6)用RNase A2 μ L除RNA，用苯酚、氯仿/異戊醇分別抽提溶液；7)加入 1/10V 的 3Μ NaAc (ΡΗ5.2)，加入 2V 的無水乙醇沉淀，-20。clOmin ；8) 12000r/min離心8min，70%乙醇洗沉淀，干燥，適量的水溶解。DNA片段常規(guī)連接體系
權(quán)利要求
1.對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲蛋白Cry2Ah_like,Cry2Ah_likesp, Cry2Ah_likevp,其蛋白序列分別如 SEQ ID N01、SEQ ID N02、SEQ ID N03 所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述殺蟲蛋白的殺蟲基因，名稱為cry2Ah-like,cry2Ah_likesp,cry2Ah-likevp，其基因序列分別如 SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06 所示。
3.含有權(quán)利要求2所述的殺蟲基因的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其分別為pET2Ah-like、pET2Ah-likesp和pET2Ah-likevp，其骨架載體為pET。
5.權(quán)利要求2所述殺蟲基因在殺滅棉鈴蟲、玉米螟中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，為將基因表達(dá)的蛋白制成藥劑殺滅棉鈴蟲、玉米螟。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，為將基因轉(zhuǎn)化微生物或植物，使植物受體表達(dá)對棉鈴蟲、玉米螟的抗性。 ·
全文摘要
本發(fā)明涉及“對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲基因cry2Ah-like及應(yīng)用”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。對鱗翅目害蟲高毒力殺蟲蛋白Cry2Ah-like，Cry2Ah-likesp，Cry2Ah-likevp，其蛋白序列分別如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3所示。本發(fā)明提供的新的基因?qū)γ掴徬x、玉米螟具有高毒力，豐富了殺蟲基因資源，同時將基應(yīng)用于轉(zhuǎn)化微生物，使之表現(xiàn)出對相關(guān)害蟲的毒性，并克服、延緩害蟲對工程菌的抗藥性產(chǎn)生。
文檔編號C07K14/325GK103204912SQ20131015096
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者束長龍, 張 杰, 耿麗麗, 宋福平, 彭琦, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所