人類分泌蛋白si-clp作為炎性調(diào)節(jié)因子的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了人類分泌蛋白SI-CLP作為炎性調(diào)節(jié)因子的用途。SI-CLP調(diào)控小鼠原代巨噬細(xì)胞內(nèi)前炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL12的mRNA表達(dá)，并受IL-12和IL13的調(diào)控，能惡化膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎的炎癥。SI-CLP在體內(nèi)作為炎性調(diào)節(jié)因子，參與炎性因子的平衡，促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)展，SI-CLP缺失可以阻滯慢性炎癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥的發(fā)展。因此，SI-CLP蛋白及其基因可以作為藥物靶標(biāo)應(yīng)用于慢性炎癥的治療，并為慢性炎癥治療藥物的篩選提供新的途徑。
【專利說明】人類分泌蛋白S1-CLP作為炎性調(diào)節(jié)因子的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及人類分泌蛋白S1-CLP作為炎性調(diào)節(jié)因子在醫(yī)藥研究領(lǐng)域的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]巨噬細(xì)胞來源于骨髓CD34+祖細(xì)胞，發(fā)育為單核細(xì)胞，滲透至不同組織而分化為不同組織的特定類型。巨噬細(xì)胞是宿主防御反應(yīng)的第一道屏障，可以通過兩種不同的方式激活:一種由IFN-Y誘導(dǎo)的典型性激活，釋放TNF-a、IL-U IL_6、IL-12、IL-15、IL-18、TGF-β等細(xì)胞因子；另一種由Th-2型細(xì)胞因子IL-4和IL-13激活，在過敏反應(yīng)及寄生蟲感染的防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并且釋放一些重要的效應(yīng)分子，包括精氨酸家族、抵抗素家族分子、幾丁質(zhì)酶蛋白家族和intelectins蛋白家族。
[0003]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以巨噬細(xì)胞浸潤和關(guān)節(jié)炎癥為主的慢性自我免疫性疾病。細(xì)胞因子在自我免疫性疾病、炎癥等疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，調(diào)節(jié)大部分免疫和炎癥的進(jìn)程。研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞因子TNF-α、IL-U IL_6、IL_8、IL-12和巨噬細(xì)胞-集落刺激因子等等相關(guān)。
[0004]巨噬細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中數(shù)量大量增加，通過促進(jìn)炎癥發(fā)展和關(guān)節(jié)損傷參與其發(fā)生發(fā)展。巨噬細(xì)胞浸潤至炎性滑膜，轉(zhuǎn)變?yōu)锳型滑膜細(xì)胞，被激活而釋放與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥相關(guān)的前炎性因子，促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)展，并且通過不同機(jī)制加劇類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎軟骨和骨破壞。
[0005]分泌蛋白 S1-CLP(stabilin-1 interacting chitinase-like protein)是最近被鑒定出來的幾丁質(zhì)酶蛋白家族或Glyco_18蛋白家族新成員，其編碼基因?yàn)镚L008，全長S1-CLP包含393氨基酸。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，S1-CLP在進(jìn)化中高度保守，人類S1-CLP與小鼠S1-CLP氨基酸序列具有90% —致性。S1-CLP的分泌由Th_2細(xì)胞因子激活，通過與胞吞/轉(zhuǎn)運(yùn)受體stabilin-1相互作用調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道在呼吸道慢性炎癥病人的支氣管肺泡灌洗液、人類外周血白細(xì)胞和糖皮質(zhì)激素治療的病人中檢測到S1-CLP蛋白的表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是了解S1-CLP與慢性炎癥以及前炎性細(xì)胞因子之間的關(guān)系，提供一種阻滯慢性炎癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥發(fā)展的方法。
[0007]考慮到S1-CLP與慢性炎性失調(diào)相關(guān)，本發(fā)明鑒定了慢性炎性失調(diào)病人例如RA病人外周血中S1-CLP的表達(dá)升高，并且利用C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠研究了S1-CLP對膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的影響。進(jìn)一步檢測了 S1-CLP對于前炎性細(xì)胞因子的影響，以及前炎性細(xì)胞因子對S1-CLP的影響。
[0008]本發(fā)明的研究結(jié)果顯示:
[0009]1、S1-CLP作為炎性調(diào)節(jié)因子調(diào)控小鼠原代巨噬細(xì)胞內(nèi)前炎性細(xì)胞因子IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，S1-CLP上調(diào)C57B/L小鼠來源巨噬細(xì)胞內(nèi)前炎性細(xì)胞因子IL-1 β、IL-6和IL12的mRNA表達(dá)。在C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞中，S1-CLP上調(diào)前炎性細(xì)胞因子IL-1 β，IL-6和IL12的mRNA表達(dá)。
[0010]2、小鼠原代巨噬細(xì)胞內(nèi)S1-CLP作為炎性調(diào)節(jié)因子受前炎性細(xì)胞因子IL-12和IL13的調(diào)控表達(dá)上調(diào)。IL-12和IL-13均上調(diào)C57B/L小鼠來源巨噬細(xì)胞內(nèi)S1-CLP mRNA的表達(dá)。
[0011]3、C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中，IL-1 β、IL-6和IL-12中的蛋白質(zhì)濃度降低。
[0012]4、C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1 β、IL-6蛋白質(zhì)濃度降低。5、S1-CLP上調(diào)C57B/L小鼠及S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1 β、IL-6和IL-12的蛋白質(zhì)濃度。
[0013]6、S1-CLP基因敲除小鼠對于膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有低敏感性。
[0014]7、S1-CLP加重膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的臨床評分。
[0015]8、S1-CLP加重膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)腫脹。
[0016]9、S1-CLP加重膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的骨損傷。
[0017]基于上述研究，本發(fā)明提供分泌蛋白S1-CLP作為靶標(biāo)用于篩選治療慢性炎癥的藥物，以及用作慢性炎癥治療藥物的藥物靶標(biāo)的用途。
[0018]上述以S1-CLP為藥物靶標(biāo)的慢性炎癥治療藥物例如S1-CLP蛋白的特異性抗體，通過特異性抗體中和S1-CLP蛋白，以阻滯慢性炎癥的發(fā)展。
[0019]本發(fā)明還提供S1-CLP基因作為慢性炎癥治療藥物的靶標(biāo)，例如敲除S1-CLP基因或通過RNA干擾技術(shù)降低S1-CLP基因的表達(dá)，從而抑制炎癥的發(fā)展。S1-CLP基因還可以作為靶標(biāo)用于篩選治療慢性炎癥的藥物。
[0020]優(yōu)選的，本發(fā)明所述慢性炎癥指類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0021]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，S1-CLP作為炎性調(diào)節(jié)因子調(diào)控小鼠原代巨噬細(xì)胞內(nèi)前炎性細(xì)胞因子IL-1 β、IL-6和IL12的mRNA表達(dá)，并受IL-12和IL13的調(diào)控，能惡化膠原誘導(dǎo)小鼠關(guān)節(jié)炎的炎癥。S1-CLP在體內(nèi)作為炎性調(diào)節(jié)因子，參與炎性因子的平衡，促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)展，S1-CLP缺失可以阻滯慢性炎癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥的發(fā)展。這樣研究成果為慢性炎癥的治療和藥物研究提供了新的方法。S1-CLP蛋白及其基因可以作為藥物靶標(biāo)應(yīng)用于慢性炎癥的治療，并為慢性炎癥治療藥物的篩選提供新的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1顯示了 S1-CLP蛋白處理后的C57B/L小鼠原代巨噬細(xì)胞中IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表達(dá)水平。
[0023]圖2顯示了 S1-CLP蛋白處理后的C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠原代巨噬細(xì)胞中IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表達(dá)水平。
[0024] 圖3顯示了 IL-12和IL-13處理后的C57B/L小鼠原代巨噬細(xì)胞中S1-CLP的mRNA表達(dá)水平。
[0025]圖4顯示C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-1 β的蛋白質(zhì)濃度降低。
[0026]圖5顯示C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL_6的蛋白質(zhì)濃度降低。
[0027]圖6顯示C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-12的蛋白質(zhì)濃度降低。
[0028]圖7顯示S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1 β的蛋白質(zhì)濃度降低，并且S1-CLP上調(diào)野生型C57B/L小鼠以及S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1 β的蛋白質(zhì)濃度。
[0029]注:圖中WT指野生型C57B/L小鼠fl-CLP+指C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠(本發(fā)明下文中出現(xiàn)的簡稱所代表的意義均與此一致)。
[0030]圖8顯示S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6的蛋白質(zhì)濃度降低，并且S1-CLP上調(diào)野生型C57B/L小鼠以及S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6的蛋白質(zhì)濃度。
[0031]圖9顯示S1-CLP上調(diào)野生型C57B/L小鼠以及S1-CLP基因敲除小鼠來源巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-12的蛋白質(zhì)濃度。
[0032]圖10顯示S1-CLP基因敲除小鼠對于膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎發(fā)病率明顯低于野生型C57B/L 小鼠。
[0033]注:WT指野生型C57B/L小鼠；K0指C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠；+SI_CLP指小鼠腹腔注射S1-CLP(本發(fā)明下文中出現(xiàn)的簡稱所代表的意義均與此一致)。
[0034]圖11顯示S1-CLP加重C57B/L小鼠以及C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠基因敲除小鼠關(guān)節(jié)炎臨床評分。
[0035]圖12顯示S1-CLP加重C57B/L小鼠以及C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠基因敲除小鼠關(guān)節(jié)腫脹。
[0036]圖13顯示S1-CLP加重C57B/L小鼠關(guān)節(jié)骨破壞。

【具體實(shí)施方式】
[0037]以下實(shí)施方案進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0038]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0039]實(shí)施例1S1-CLP提高C57B/L小鼠原代巨噬細(xì)胞中IL-1 β、IL_6和IL-12的mRNA表達(dá)
[0040]因?yàn)镾1-CLP能夠特異性的結(jié)合到分化的THP-1細(xì)胞和原代巨噬細(xì)胞表面，我們推測這種特異性的結(jié)合能夠改變細(xì)胞的某種活性。分離小鼠后腿骨髓細(xì)胞，用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用改良型1640基本培養(yǎng)基加20% L929細(xì)胞培養(yǎng)基上清和10% FBS誘導(dǎo)7天,每天換液2次,7天后獲得的貼壁細(xì)胞即為原代巨噬細(xì)胞,用lμg/ml S1-CLP蛋白(蛋白純化參考文獻(xiàn)見JB1l.Chem.2010，285，39898-39904)與貼壁的巨噬細(xì)胞孵育24小時(shí)，用PBS作為對照。收集處理后細(xì)胞，Trizol法抽提RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)操作者手冊，通過 RTsystem(Promega, Madison, USA)用 IygS RNA 產(chǎn)生 cDNA。用 SYBRGreen qPCR kit進(jìn)行定量real-time PCR(本發(fā)明中所有實(shí)施例原代巨噬細(xì)胞的獲得以及定量Real-Time PCR的方法均與此相同)。
[0041]設(shè)計(jì)上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.1和2所示)，通過定量real-time PCR對IL-1 β的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。
[0042]設(shè)計(jì)上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.3和4所示)，通過定量real-time PCR對IL-6的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。
[0043]設(shè)計(jì)上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.5和6所示)，通過定量real-time PCR對IL-12的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。
[0044]設(shè)計(jì)actin上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.7和8所示)，作為對照。
[0045]Real-Time PCR 條件:95°C 5 分鐘；95°C 15 秒，58°C 10 秒，72°C 15 秒，50 個(gè)循環(huán)；72 0C 10 秒。
[0046]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，表明S1-CLP蛋白處理的野生型C57B/L小鼠骨髓來源的原代巨噬細(xì)胞IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。
[0047]實(shí)施例2S1-CLP提高C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠原代巨噬細(xì)胞中IL-1 β、IL-6 和 IL-12 的 mRNA 表達(dá)
[0048]分離C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠(購自于上海南方模式生物研究中心)后腿骨髓，用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用改良型1640基本培養(yǎng)基加20% L929培養(yǎng)基和10% FBS誘導(dǎo)7天，每天換液2次，7天后獲得的貼壁細(xì)胞即為原代巨噬細(xì)胞，用
Iμ g/ml S1-CLP蛋白與貼壁的巨噬細(xì)胞孵育24小時(shí)，用PBS作為對照。收集處理后細(xì)胞，Trizol法抽提RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過定量Real-Time PCR對前炎性細(xì)胞因子IL-1 β ,IL-6和IL-12的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量(引物序列見序列表中SEQ ID N0.1、2、
3、4、5和6)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，表明S1-CLP基因敲除的C57B/L小鼠骨髓來源的原代巨噬細(xì)胞經(jīng)S1-CLP蛋白處理后，IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。
[0049]實(shí)施例3IL-12和IL-13上調(diào)C57B/L小鼠原代巨噬細(xì)胞中S1-CLP的mRNA表達(dá)
[0050]S1-CLP對于巨噬細(xì)胞前炎性細(xì)胞因子的調(diào)控促使我們檢測S1-CLP是否受到前炎性因子的調(diào)控。分離的小鼠細(xì)胞用IL-Ιβ、IL-4、IL-12和IL-13處理48小時(shí)，收集處理后細(xì)胞，Trizol法抽提RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)引物如序列表中SEQ ID N0.9和10所示，通過定量real-time PCR檢測S1-CLP表達(dá)水平變化。Real-Time PCR條件:950C 5分鐘；95°C 15秒，66°C 10秒，72°C 15秒，50個(gè)循環(huán)；72°C 10秒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，顯示IL-12和IL-13明顯上調(diào)S1-CLP mRNA表達(dá)。
[0051]實(shí)施例4S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-1 β的濃度明顯降低
[0052]S1-CLP對于前炎性細(xì)胞因子的相互調(diào)控作用促使我們檢測S1-CLP基因敲除小鼠中血清中前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。對S1-CLP基因敲除小鼠及野生型小鼠進(jìn)行眼眶取血。血液凝固后13000rpm離心15min，收集上清，-80°C保存待用。通過定量ELISA對前炎性細(xì)胞因子進(jìn)行定量，并且與野生型小鼠比較。血清中的前炎性細(xì)胞因子所有操作均按照操作說明書進(jìn)行。血清稀釋10倍以后用相同方法檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，與野生型小鼠相比，S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-1 β的濃度明顯降低。
[0053]實(shí)施例5S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL_6的濃度明顯降低
[0054]S1-CLP對于前炎性細(xì)胞因子的相互調(diào)控作用促使我們檢測S1-CLP基因敲除小鼠中血清中前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。對S1-CLP基因敲除小鼠及野生型小鼠進(jìn)行眼眶取血。血液凝固后13000rpm離心15min，收集上清，-80°C保存待用。血清中的前炎性細(xì)胞因子通過定量ELISA進(jìn)行定量，并且與野生型小鼠比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，與野生型小鼠相比，S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-6的濃度明顯降低。
[0055]實(shí)施例6S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-12的濃度明顯降低
[0056]S1-CLP對于前炎性細(xì)胞因子的相互調(diào)控作用促使我們檢測S1-CLP基因敲除小鼠中血清中前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況。對S1-CLP基因敲除小鼠及野生型小鼠進(jìn)行眼眶取血。血液凝固后13000rpm離心15min，收集上清，-80°C保存待用。血清中的前炎性細(xì)胞因子通過定量ELISA進(jìn)行定量，并且與野生型小鼠比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，與野生型小鼠相比，S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-12的濃度明顯降低。
[0057]實(shí)施例7S1-CLP基因敲除小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1 β濃度明顯降低，并且S1-CLP處理明顯提高野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1 β的濃度。
[0058]本發(fā)明分析S1-CLP對于炎癥的影響。分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，7天后用lyg/mL S1-CLP蛋白處理24小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過定量ELISA對前炎性細(xì)胞因子進(jìn)行定量，并且與野生型小鼠比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，S1-CLP敲除后，細(xì)胞上清中產(chǎn)生的IL-1 β濃度明顯降低，用S1-CLP處理明顯提高IL-1 β的濃度。
[0059]實(shí)施例8S1-CLP基因敲除小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL_6濃度明顯降低，并且S1-CLP處理明顯提高野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的濃度。
[0060]本發(fā)明分析S1-CLP對于炎癥的影響。分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，7天后用lyg/mL S1-CLP蛋白處理24小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過定量ELISA對前炎性細(xì)胞因子進(jìn)行定量，并且與野生型小鼠比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，S1-CLP敲除后，細(xì)胞上清中產(chǎn)生的IL-6濃度明顯降低，用S1-CLP處理明顯提高IL-6的濃度。
[0061]實(shí)施例9用S1-CLP處理小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，明顯提高野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的濃度。
[0062]本發(fā)明分析S1-CLP對于炎癥的影響。分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，7天后用lyg/mL S1-CLP蛋白處理24小時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過定量ELISA對前炎性細(xì)胞因子進(jìn)行定量，并且與野生型小鼠比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，S1-CLP處理小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，明顯提高培養(yǎng)上清中IL-12的濃度。
[0063]實(shí)施例10S1-CLP基因敲除小鼠對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有低發(fā)病率
[0064]本發(fā)明為了更好地了解S1-CLP在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用，用雞膠原誘導(dǎo)小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型。雞II型膠原溶解于0.1M醋酸，使用前終濃度為4mg/mL。在免疫小鼠前，雞II型膠原用等體積的完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant, 4mg/mL)乳化?？偣?0只8-9周齡的C57BL/6J小鼠(10雄和10雌)和20只8-9周齡C57BL/6J背景的S1-CLP基因敲除小鼠尾根部注射溶解于CFA的雞CI10.lmL，7天后用重新乳化的雞CI10.05mL加強(qiáng)免疫。同時(shí)，20只8_9周齡的C57BL/6J小鼠(10雄和10雌)用PBS注射作為對照。第一次免疫后5-9周，每一組用半數(shù)(10只)的老鼠注射純化的S1-CLP蛋白150 μ g，另外一半(10只)注射PBS作為對照。小鼠在第二次免疫后開始臨床計(jì)分。對S1-CLP基因敲除小鼠的發(fā)病率進(jìn)行評估，并且與野生型小鼠進(jìn)行比較。累計(jì)發(fā)病率以及臨床評分在第二次免疫以后開始計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，數(shù)據(jù)顯示S1-CLP基因敲除小鼠的累計(jì)發(fā)病率明顯低于野生型小鼠。
[0065]實(shí)施例1lS1-CLP基因敲除小鼠對膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有低的臨床評分
[0066]通過臨床評分對小鼠關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。臨床評分在第二次免疫以后開始計(jì)算。關(guān)節(jié)腫脹按照如下標(biāo)準(zhǔn):評分標(biāo)準(zhǔn):0，無紅腫；1，腳趾和踝關(guān)節(jié)輕微腫脹；2，腳趾和踝關(guān)節(jié)中度腫脹；3，腳趾和踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹；4，整個(gè)腳趾、關(guān)節(jié)完全腫脹。每只老鼠4只腳計(jì)算，總分16分。
[0067]為明確S1-CLP的作用，半數(shù)(10/20)的膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠通過腹腔注射S1-CLP，另外一半(10/20)用PBS處理作為對照。與對照組相比，S1-CLP處理加劇了膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)炎炎癥。對關(guān)節(jié)腫脹進(jìn)行臨床計(jì)分發(fā)現(xiàn)S1-CLP基因敲除小鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯低于野生型小鼠，并且S1-CLP能加重膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎的臨床評分(見圖11)。
[0068]實(shí)施例12膠原誘導(dǎo)S1-CLP基因敲除關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重程度低于野生型小鼠
[0069]S1-CLP基因敲除關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重程度低于野生型小鼠，為進(jìn)一步明確S1-CLP的作用，半數(shù)(10/20)的膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠通過腹腔注射S1-CLP，另外一半(10/20)用PBS處理作為對照。與對照組相比，S1-CLP處理加劇了膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)炎腫脹(見圖12)。
[0070]實(shí)施例13S1-CLP基因敲除小鼠的骨損傷嚴(yán)重程度低于野生型小鼠
[0071]為明確S1-CLP的作用，半數(shù)(10/20)的膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠通過腹腔注射S1-CLP，另外一半(10/20)用PBS處理作為對照。X_ray檢測放射性技術(shù)檢測膠原誘導(dǎo)小鼠骨質(zhì)破壞情況。放射性條件:MIKASA HF100H unit (MIKASA，Tokyo，Japan)，曝光參數(shù)42kV，2mA, 32msο實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所示，可以看到原代小鼠具有明顯的骨破壞，并且在S1-CLP處理后骨破壞加重，而S1-CLP基因敲除小鼠不明顯。
【權(quán)利要求】
1.S1-CLP蛋白的用途，其特征在于，以S1-CLP蛋白作為治療慢性炎癥的藥物的靶標(biāo)。
2.S1-CLP蛋白的用途，其特征在于，以S1-CLP蛋白作為靶標(biāo)篩選治療慢性炎癥的藥物。
3.S1-CLP基因的用途，其特征在于，以S1-CLP基因作為治療慢性炎癥的藥物的靶標(biāo)。
4.S1-CLP基因的用途，其特征在于，以S1-CLP基因作為靶標(biāo)篩選治療慢性炎癥的藥物。
5.如權(quán)利要求1~4任一所述的用途，其特征在于，所述慢性炎癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
6.一種治療慢性炎癥的藥物，其特征在于，所述藥物以S1-CLP蛋白或其基因作為藥物靶標(biāo)。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于，所述藥物包含S1-CLP蛋白的特異性抗體。
8.如權(quán)利要求6所述的藥物，其特征在于，所述藥物包含S1-CLP基因的干擾RNA。
9.如權(quán)利要求6~8任一所述的藥物，其特征在于，所述慢性炎癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
【文檔編號】C07K14/52GK104130324SQ201310157501
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月2日
【發(fā)明者】鄭曉峰, 肖衛(wèi)純, 孟賡, 趙艷梅 申請人:北京大學(xué)