多頭絨泡菌14-3-3蛋白單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開3個(gè)多頭絨泡菌14-3-3蛋白（P14-3-3）的單克隆抗體mAbα+、mAbβ+和mAbγ+，表達(dá)分泌上述三個(gè)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株McAbα+、McAbβ+或McAbγ+的微生物保藏號(hào)分別是：CCTCC?NO:C2012131、C2012132、C2012133，保藏地點(diǎn)：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其目的是提供研究14-3-3蛋白結(jié)構(gòu)與功能以及P14-3-3隨細(xì)胞周期和生命周期表達(dá)變化的有效手段。本發(fā)明所制備的抗體效價(jià)均高于100K，親和常數(shù)均都大于2.12×108，能夠用于研究低等真核生物14-3-3蛋白的結(jié)構(gòu)與功能以及14-3-3蛋白隨細(xì)胞周期和生命周期的表達(dá)變化規(guī)律，具有很好的商業(yè)用途。
【專利說明】多頭絨泡菌14-3-3蛋白單克隆抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及分泌抗14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的14-3-3蛋白單克隆抗體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]14-3-3蛋白(14-3-3S)是真核生物普遍存在的分子伴侶蛋白，但目前尚未在原核生物中發(fā)現(xiàn)該類蛋白[1]。已有的報(bào)道顯示，脊椎動(dòng)物存在由7種基因編碼的9種14-3-3S亞型(α、β、gamma、δ、ε、η、ξ、σ和τ )，其中α和σ分別是β和ξ的磷酸化形式[1]。擬南芥有13種14-3-3亞型,被劃分為ε ( μ、ε、J1、ι和ο )和非ε ( κ、λ、ψ、ν、υ、ω、φ和 X )兩個(gè)家族[2],大豆有 18 個(gè) 14_3_3s 亞型(a、b、C、d、e、f、g、h、1、j、k、1、m、n、o、p、q和r),是目前發(fā)現(xiàn)的最大14_3_3家族[3]。酵母含有2個(gè)14_3_3亞型Bmhl和Bmh2，編碼這兩個(gè)蛋白的基因分別稱作rad24和rad25[4]。在白色念珠菌[5]和阿米巴蟲[6]各發(fā)現(xiàn)I個(gè)14-3-3蛋白基因。P14-3-3是發(fā)明人在多頭絨泡菌發(fā)現(xiàn)的14_3_3蛋白[7]。
[0003]14-3-3蛋白單體是由9個(gè)反平行的α螺旋構(gòu)成的杯狀結(jié)構(gòu)，杯狀結(jié)構(gòu)的底部是由3個(gè)反向平行的α螺旋通過疏水作用重疊構(gòu)成的，杯狀體底部的其余部分和側(cè)面由另外6個(gè)反向平行的α螺旋構(gòu)成[8，9]。有報(bào)道顯示，14-3-3蛋白N-端和C-端的非保守序列是影響14_3_3s的功能差異的決定因素,其中N-端的差異決定了 14_3_3s各亞型形成同源或異源二聚體的傾向；而0端的序列差異決定了 14-3-3S功能的特異性[2’1(U1]。天然14-3-3蛋白主要以同源或異源二聚體形式存在，14-3-3 二聚體界面由一個(gè)單體的螺旋I與另一單體的螺旋3和4構(gòu)成的 ，界面內(nèi)包埋著幾個(gè)疏水殘基和極性殘基，外周則由螺旋2形成的鹽橋連接，螺旋5-9形成二聚體的外側(cè)和底部。
[0004]研究表明，14-3-3蛋白可以同時(shí)與兩個(gè)靶蛋白或一個(gè)靶蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互作用，并調(diào)節(jié)靶蛋白的生物活性[12]。磷酸化是影響靶蛋白與14-3-3S相互作用的關(guān)鍵因素
[13]，14-3-3S結(jié)合的磷酸化靶蛋白基序通常有4種模式:RSXpSXP、RXF/YpSXP[14]、YpTV[15]和RXSX-pSXP (其中，pS代表磷酸化絲氨酸，PT代表磷酸化蘇氨酸)[16]。已有的報(bào)道顯示，14-3-3s作用的配體蛋白有300余種[17]。14-3-3s主要通過配體蛋白(如激酶、受體蛋白、酶類、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架蛋白、腳手架分子、細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和細(xì)胞凋亡蛋白等)參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、存活、凋亡、遷移和擴(kuò)展、信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、脅迫響應(yīng)、周期調(diào)控、基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生命過程[18，19]。因此，14-3-3蛋白是研究各種生命活動(dòng)的重要切入點(diǎn)之一，特異性的14-3-3蛋白抗體是研究14-3-3s在各種生命活動(dòng)中作用的重要手段之一。
[0005]發(fā)明人在前期研究中發(fā)現(xiàn)，P14-3-3能激活Gal4蛋白調(diào)控的Y187酵母報(bào)告基因表達(dá)；P14_3_3 蛋白的二聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dimer-binding motif2, DBM2)上的 Ser62 和 Ser67以及C端235ThrSer236是影響P14-3-3轉(zhuǎn)錄激活功能的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)m。以P14-3-3為餌蛋白，通過酵母雙雜交篩選多頭絨泡菌cDNA文庫，獲得近200個(gè)P14-3-3相關(guān)蛋白基因，這些基因編碼的蛋白包括激酶、代謝酶類、轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、離子通道蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、受體蛋白、抗病相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白及細(xì)胞凋亡蛋白。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)P14-3-3與PSR (多頭絨泡菌RNA選擇性剪接調(diào)控蛋白)、PSm-E和PSm_D3 (PSm-E和PSm-D3為多頭絨泡菌pre-mRNA剪接復(fù)合物U snRNP核心蛋白Sm的E和D3亞基)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)都能相互作用，并確定了相互作用關(guān)鍵氨基酸和肽段，說明了 P14-3-3參與基因的轉(zhuǎn)錄后加工。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，P14-3-3不但能提高Hela細(xì)胞的增殖能力，還能縮短Hela細(xì)胞的Gl期、延長(zhǎng)G2期；此外，表達(dá)P14-3-3的Hela細(xì)胞的Bcl_2蛋白水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，抗凋亡誘導(dǎo)劑TNF α和CHX脅迫的能力明顯增強(qiáng)，說明Ρ14-3-3可通過調(diào)控抗凋亡蛋白表達(dá)參與細(xì)胞的凋亡過程。上述結(jié)果說明，Ρ14-3-3不僅在基因轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄后加工中扮演重要角色，還具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞抗凋亡能力的作用[2°]。因此有必要制備Ρ14-3-3的單克隆抗體，以便開展Ρ14-3-3的生理功能研究。[0006]哺乳動(dòng)物有7個(gè)14-3-3蛋白亞型，亞型之間的序列比較保守。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的和市售的14-3-3蛋白抗體主要以哺乳動(dòng)物14-3-3蛋白抗體為主，而且以多克隆抗體為主。Abcam公司銷售的14-3-3 ξ抗體是以14_3_3 ξ的N端重組片段以及C端合成多肽為抗原免疫動(dòng)物制得的。santa cruz公司銷售的14_3_3 ξ抗體是以14_3_3 ξ C端的16個(gè)氨基酸為抗原制備的。國(guó)內(nèi)關(guān)于14-3-3蛋白抗體制備不多見，都是以14-3-3重組蛋白作為抗原免疫動(dòng)物，獲得相關(guān)的抗體。在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上，僅有杭州宜康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)出售商品化的14-3-3 β抗體。董長(zhǎng)松[21]等制備了 14-3-3 ζ的單克隆抗體。錢春艷[22]等制備了日本血吸蟲重組信號(hào)蛋白14-3-3的單克隆抗體，并發(fā)現(xiàn)其與華支睪吸蟲、大腸埃希菌可溶性抗原無明顯交叉反應(yīng)。目前為止，尚未看到14-3-3蛋白Ρ14-3-3單克隆抗體和酵母14_3_3蛋白Bmhl和Bmh2單克隆抗體的相關(guān)報(bào)道。
[0007]基于上述理由，目前需要制備至少能分泌抗14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及至少能識(shí)別多頭絨泡菌14-3-3蛋白的單克隆抗體，尤其是制備具有抗體效價(jià)高、親和常數(shù)大、滴度高、特異性好的單抗及其雜交瘤，并將其應(yīng)用于免疫印跡和免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)，以及分離14-3-3蛋白及其配體蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明第一個(gè)目的是提供分泌14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于:該組雜交瘤細(xì)胞株McAb α +、McAb β +或McAb Y +,其微生物保藏號(hào)分別是:CCTCCNO:C2012131、CCTCC N0:C2012132、CCTCC NO:C2012133，保藏地點(diǎn):中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時(shí)間為2013年3月8日。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，該組雜交瘤細(xì)胞株是由表達(dá)抗體mAb a +、mAb β +和mAb Y +的BALB/c鼠B淋巴細(xì)胞與NS-1骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選和亞克隆制備而成的。
[0010]本發(fā)明第二個(gè)目的是提供由上述雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單克隆抗體是mAb a +、mAb β +和mAb Y +。
[0012]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述單克隆抗體分別特異識(shí)別14-3-3蛋白上的抗原決定簇肽段 l-MTHDESREDS-10、18-EQAERYDEMV-27 和 245-PKPVEDEAPA-255。
[0013]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體mAb α +所識(shí)別的抗原決定簇肽段為MTHDESREDS ；抗體mAb β +所識(shí)別的抗原決定簇肽段為EQAERYDEMV ;抗體mAb Y +所識(shí)別的抗原決定簇肽段為 PKPVEDEAPA。[0014]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,抗體mAb α+、mAb β +和mAb Y +的亞型均為IgG2b。
[0015]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中,抗體mAb a +、mAb β +和mAb Y +與P14_3_3蛋白反應(yīng)的親和常數(shù)分別為:2.72Χ108、4.26 X IO9 和 2.52 X IO8 ；
[0016]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體mAb α +和mAb β +能與酵母14_3_3蛋白Bmhl和Bmh2分別反應(yīng)；
[0017]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗體mAba +和rnAbP +能與40kD和48kD的人14_3_3蛋白分別反應(yīng)；
[0018]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述單克隆抗體mAb a +、mAb β +和mAb Y +效價(jià)為128000。
[0019]本發(fā)明第三個(gè)目的是提供上述單抗的制備方法。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，包括如下步驟:
[0021](I)腹水的制備:對(duì)上述己建株的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0022](2)腹水中單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定；
[0023](3)單克隆抗體的篩選；
[0024](4)單克隆抗體的純化；
[0025](5)單克隆抗體的鑒定。
[0026]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟5包括:按單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(Mousemonoclonal antibody isotyping reaents, Sigma)使用說明鑒定單克隆抗體的亞類；和通過Western blot法檢測(cè)多頭絨泡菌破碎液、酵母和人胚腎細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)中與所制備的P14-3-3單克隆抗體反應(yīng)的蛋白。
[0027]本發(fā)明第四個(gè)目的是提供上述抗體用于研究多頭絨泡菌或其他物種的P14-3-3蛋白的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的用途是研究P14-3-3蛋白隨細(xì)胞周期以及生命周期的表達(dá)變化的用途。
[0028]本發(fā)明第五個(gè)目的是提供一組通過上述方法制備的且包括以下組成序列的抗體，其中:
[0029]mAba+的輕鏈、重鏈可變區(qū)肽段的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 2、4，其編碼序列選自 SEQ ID N0:l、3 ；
[0030]mAb β+的輕鏈、重鏈可變區(qū)肽段的氨基酸序列選自SEQ ID NO:6、8，其編碼序列選自 SEQ ID Ν0:5、7 ；
[0031]mAb ν +的輕鏈、重鏈可變區(qū)肽段的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 10、12，其編碼序列選自 SEQ ID N0:9、ll。
[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，上述抗體包括所述輕鏈或重鏈的氨基酸序列經(jīng)過I~10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并對(duì)14-3-3蛋白具有特異的靶向性，具有影響14-3-3蛋白功能的抗體。
[0033]技術(shù)效果
[0034]1、上述雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)液中的抗體效價(jià)均高于100K，親和常數(shù)均都大于2.12 X 108，說明所獲得的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體的效率較高，特異性較好。
[0035]2、上述3個(gè)抗體均可用于檢測(cè)重組和天然的P14-3-3，也可用于檢測(cè)P14_3_3的性質(zhì)、表達(dá)以及生理功能。[0036]3、上述3個(gè)抗體均可用于ELISA檢測(cè)，也可以用于Western blot檢測(cè),且3個(gè)單抗均以IgG2b亞型為主，具有很好的商業(yè)用途。
[0037]4、用protein G親和層析膠純化實(shí)驗(yàn)表明，所制備的抗體雜蛋白條帶很少,說明抗體純度較高。
[0038]5、通過上述三個(gè)抗體研究P14-3-3隨細(xì)胞周期以及生命周期的表達(dá)變化，成功證明P14-3-3的表達(dá)與細(xì)胞周期和生命周期有關(guān)，P14-3-3是一個(gè)細(xì)胞周期和生命周期調(diào)控蛋白，P14-3-3的功能可能與S期的生命活動(dòng)密切相關(guān)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1:DNAStar軟件分析的P14_3_3親水性、抗原指數(shù)和表面可及性，其中:模擬的P14-3-3 三級(jí)結(jié)構(gòu) Epitope I, II, III 分別為 mAb a +、mAb β + 和 mAb Y + 在 P14-3-3 上識(shí)別的位點(diǎn)。
[0040]圖2:雜交瘤細(xì)胞McAb a +,McAb β +和McAb Y +誘導(dǎo)的腹水與天然和重組Ρ14_3_3反應(yīng)的Westrn blot檢測(cè)結(jié)果，其中:Α、B和C:分別為用雜交瘤細(xì)胞株McAb α+、McAb β +和McAb Y +誘導(dǎo)的腹水；泳道M:預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道1-3:分別為6XHis表達(dá)菌、6XHis tagged P14-3-3表達(dá)菌和多頭絨泡菌破碎液。
[0041 ] 圖3:抗體mAb a +、mAb β +和mAb Y +純化產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。其中:泳道M:標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1-3:分別為單克隆抗體mAb α +、mAb β +和mAb Y +。
[0042]圖4:雜交瘤細(xì)胞McAb α +、McAb β +和McAb Y +誘導(dǎo)的腹水效價(jià)的ELISA檢測(cè)結(jié)果
[0043]圖5:抗體mAb α +、mAb β +和mAb Y +亞型的鑒定結(jié)果。
[0044]圖6:抗體mAb α+、mAb β +和mAb Y +特異性的Westrn blot檢測(cè)結(jié)果。其中，A、B和C:分別為單克隆抗體mAb a+、mAb β +和mAb Y +的Westrn blot檢測(cè)結(jié)果；泳道M:預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；泳道1-3:酵母、HEK293細(xì)胞和多頭絨泡菌的破碎液。
[0045]圖7:P14-3-3的表達(dá)隨細(xì)胞周期和孢子形成變化的Western blot檢測(cè)結(jié)果，其中:圖中，泳道M:預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1:對(duì)照，泳道2-7:mAbi3 +檢測(cè)的第二次有絲分裂開始后 0.5hr (S 期)、4.0hr (G2 早期)、6.0hr (G2 中期)、8.0hr (G2 晚期)和 9.5hr(Μ期)及孢子表達(dá)的P14-3-3。
[0046]圖8:Ρ14-3-3的表達(dá)隨細(xì)胞周期和孢子形成變化的Quantity One分析結(jié)果,其中以M期P14-3-3水平為比較標(biāo)準(zhǔn)，柱狀圖由左至右:為多頭絨泡菌第二次同步化有絲分裂開始后 0.5hr (S 期)、4.0hr (G2 早期)、6.0hr (G2 中期)、8.0hr (G2 晚期)、9.5hr (Μ 期)和孢子的P14-3-3表達(dá)水平。
[0047]圖9:P14-3-3mRNA豐度隨細(xì)胞周期以及孢子形成變化的Q-PCR檢測(cè)結(jié)果，其中:以M期P14-3-3mRNA豐度為比較標(biāo)準(zhǔn)，柱狀圖由左至右:P14-3_3mRNA在第二次同步化有絲分裂開始后 0.5hr (S 期)、4.0hr (G2 早期)、6.0hr (G2 中期)、8.0hr (G2 晚期)和 9.5hr (Μ期)以及孢子的水平。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。但以下所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
[0049]實(shí)施例一:本發(fā)明涉及的相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及試劑和生物材料
[0050]1、多頭絨泡菌的培養(yǎng)及菌破碎液制備:
[0051]多頭絨泡菌的液體培養(yǎng):多頭絨泡菌M3CVII strain (ATCC編號(hào)204388)由德國(guó)雷根斯堡大學(xué)生物物理所Eggehard Holler教授惠贈(zèng)。在250ml錐形瓶中加入25mlMSD-A 液(3.54g Citric acid, 0.06g FeCl2.4Η20，0.2g KH2PO4,0.6g MgSO4.7Η20，0.084gMnCl2.4H20,0.04g ZnSO4.7H20,0.6g CaCl2.2H20, IOg Tryptone, 1.5g Yeastextract, IOgGlucose,用30%K0H調(diào)pH至4.6,蒸懼水定容至1L,高壓滅菌后室溫保存。固體MSD含2%瓊脂粉)和0.25ml MSD-B液(0.05g Hematin溶于100mll%Na0H溶液中，高壓滅菌后4°C保存)，接入適量菌體，300rpm，26°C下暗培養(yǎng)，每3天繼代I次。
[0052]2、多頭絨泡菌的同步化培養(yǎng):將濾紙置于鋪滿玻璃珠的培養(yǎng)皿中，高壓滅菌。離心收集懸浮培養(yǎng)的微原生質(zhì)團(tuán)，經(jīng)無菌蒸餾水洗滌2次后，接種于濾紙中央，26 °C暗培養(yǎng)2-3h后，加入12.5ml的MSD培養(yǎng)基，大約16h后進(jìn)入第二次同步化有絲分裂M期。每30min取一次樣品，用卡諾固定液(甲醇:冰乙酸=3:1,現(xiàn)配現(xiàn)用)固定2min,卡寶品紅(Carbolfuchsin，上海生工)染色，壓片，在顯微鏡下跟蹤觀察原質(zhì)團(tuán)的細(xì)胞周期進(jìn)程，在細(xì)胞完成第二次同步化有絲分裂(M期)后的0.5hr (S期)、4.0hr (G2早期)、6.0hr (G2中期)、8.0hr(G2晚期)和9.5hr (Μ期)取樣。
[0053]3、多頭絨泡菌的孢子培養(yǎng):離心收集懸浮培養(yǎng)的微原生質(zhì)團(tuán)，經(jīng)無菌蒸餾水洗滌2次后，接種于濾紙中央，26°C暗培養(yǎng)4-5h，移至盛有25ml孢子培養(yǎng)基(1.2g/L Citricacid，400mg/L KH2PO4,600mg/L CaCl2.2Η20，600mg/L MgSO4.7Η20，60mg/LFeCl2.4Η20，84mg/L MnCl2.4H20，34mg/L ZnSO4.7H20 ；pH5.0)的三角瓶中 300 rpm，26°C暗培養(yǎng) 4 天，26°C光照誘導(dǎo)3-4h, 300rpm培養(yǎng)1_2天形成孢子。
[0054]4、多頭絨泡菌的脅迫培`養(yǎng):將多頭絨泡菌接種于含不同濃度的CuSO4的MSD固體或液體培養(yǎng)基中，26 °C下，暗培養(yǎng)。
[0055]5、多頭絨泡菌破碎液的制備:取IOOmg多頭絨泡原質(zhì)團(tuán)或孢子，加入0.1ml破碎液[KCl 65mM, NaCl 15mM, Hepes IOmM, Na2EDTA IOmM, KF 5mM, DTT 5mM, PMSF 0.2mM,Tritonx-100 0.l%(w/v), 2 μ g/ml aprotinin, pH7.6]冰上勻衆(zhòng)破碎。12，OOOrpm 離心 5min后，取上清液(約含10 μ g蛋白)備用。
[0056]6、蛋白濃度的檢測(cè):
[0057]參照BCA法[32]測(cè)定蛋白含量，用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(CWB10，北京)檢測(cè)蛋白濃度的操作步驟如下:(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:取8個(gè)1.5ml的離心管，分別加入5、10、20、40、60、80、100 μ I標(biāo)準(zhǔn)蛋白液,用去離子水補(bǔ)足至200 μ I ； (2)按50:1的體積比混合solutionA和B，配制成BCA工作液；(3)各管加入1000 μ I BCA工作液，充分混勻，37°C放置30分鐘，用Ultro spec200分光光度計(jì)(Pharmacia Biotech)檢測(cè)562nm波長(zhǎng)下吸光度。以蛋白含量(μ g)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)將待測(cè)樣品稀釋至合適濃度，取100 μ I樣品稀釋液，加入1000 μ I BCA工作液，充分混勻，37°C放置30min后，用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品在562nm波長(zhǎng)下吸光度，并記錄吸光值；根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的蛋白含量(μ g)，除以樣品稀釋液總體積(100 μ 1)，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度(單位:μ g/μ I)。
[0058]7、間接ELISA法操作步驟:
[0059](I)包被:用包被緩沖液(Na2CO3L 59g/L, NaHC032.93g/L，ρΗ9.6)將 Ρ14-3-3 蛋白配制成濃度為lng/μ I的抗原液，取ΙΟΟμ I抗原液加入酶標(biāo)板孔中，4°C下過夜；(2)封閉:次日，將包被液甩干，加入200μ 1，3%BSA封閉液，37°C封閉1.5h ；(3)加入一抗:用洗滌液(NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L, NaH2PO4.12Η202.9g/L，ΚΗ2Ρ042.7g/L, Tween-200.05%, pH7.4)洗滌3次，然后加入一抗，37°C孵育Ih ; (4)加入二抗:用洗滌液洗滌3次，加入二抗，37°C孵育Ih ; (5)顯色:洗滌三次，加入TMB底物，37°C孵育15min ；(6)終止:每孔加入50 μ I的2mmol/L的硫酸；(7)讀數(shù):樣品A450nm與陰性對(duì)照A450nm之比大于2.1的為陽性。
[0060]8、SDS-PAGE 操作步驟:
[0061](I) 5%濃縮膠的配制:0.9ml雙蒸水，0.67ml30%丙烯酰胺，0.04mll0%SDS溶液，
0.04mll0% 過硫酸銨，0.5mllmol/L Tris-HCl, 0.002ml TEMED ；
[0062](2) 12%分離膠的配制:3.3ml雙蒸水，2.7ml30%丙烯酰胺，0.1 ml 10%SDS溶液，
0.1ml 10% 過硫酸銨，2.5mll.5mol/L Tris_HCl，0.004ml TEMED ；
[0063](3)電泳:取菌破碎液上清或蛋白液與等體積的2X loading buffer混合，煮沸5min后，12，OOOrpm離心5min,用微量移液器取上清加入聚丙烯酰胺凝膠的樣品孔中；Power PAC3000電泳儀(Bio-RAD)調(diào)至恒壓狀態(tài),開始電壓調(diào)節(jié)到80V,當(dāng)樣品條帶壓縮成一條線并且進(jìn)入分離膠時(shí)電壓調(diào)到120V ;指示劑遷移至距離膠板底端Icm左右時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳。
[0064]9、Western blot 操作步驟:`[0065]用半干電轉(zhuǎn)儀Jim-X (大連競(jìng)邁)將SDS-PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μ的硝酸纖維膜(BioTrace NT,Gelman Laboratory)上，用 TBS (NaC1150mM, Tris-HC120mM, pH7.2)洗滌3次，每次5min。4°C下，用含5% (w/v)脫脂奶粉的TBS封閉硝酸纖維膜過夜，用含
0.l%Tween-20的TBS (TTBS)洗滌2次，TBS洗滌I次，每次5min。將封閉好的硝酸纖維膜浸于TBS稀釋的一抗溶液中，37°C溫育2h ;用TTBS洗滌2次，TBS洗滌I次，每次5min。將纖維膜浸于含5%脫脂奶粉TBS稀釋的二抗溶液中，37°C孵育2h ;用TTBS洗滌2次，TBS洗漆 I 次后，浸于 BCIP/NBT (Nitro blue tetrazolium-bromo-4-chloro-3-1ndoly-phosphate)溶液中顯色。用Quantity One軟件分析色帶的灰度。
[0066]10、單克隆抗體的篩選:
[0067]以pET28a_BL21 (含pET28a質(zhì)粒的BL21重組菌，本實(shí)驗(yàn)室自備)的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為陰性對(duì)照，pET28a-pl4-3-3-BL21 (表達(dá) 6XHis tagged P14-3-3 的 BL21 重組菌，本實(shí)驗(yàn)室自備)的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為陽性對(duì)照，多頭絨泡菌破碎液(含有天然P14-3-3)為檢測(cè)樣品，小鼠腹水為一抗，AP (堿性磷酸酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗,通過Western blot篩選有陽性反應(yīng)的腹水。
[0068]11、單克隆抗體的純化和鑒定:
[0069]用HiTrap protein G親和層析膠純化抗體?？贵w的純度用SDS-PAGE檢測(cè)。
[0070]12、單克隆抗體的亞類鑒定
[0071]用抗體亞類鑒定試劑盒(MouseMonoclonal Antibody Isotyping Reaents,Sigma)鑒定單克隆抗體的亞類。[0072]13、單克隆抗體的特異性檢測(cè):
[0073]通過Western blot法檢測(cè)多頭絨泡菌破碎液、酵母和人胚腎細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)中與所制備的P14-3-3單克隆抗體反應(yīng)的蛋白。
[0074]實(shí)施例二:抗原決定簇肽段篩選以及抗原決定簇肽融合蛋白的表達(dá)和純制
[0075]用DNAStar生物學(xué)軟件分析P14-3-3氨基酸序列(其編碼序列GenBank注冊(cè)號(hào)為EF140724)的親水性、表面可及性以及抗原指數(shù)，根據(jù)抗原表位預(yù)測(cè)原則(親水性，抗原指數(shù)均大于零，表面可及性大于I)選擇符合抗原決定簇要求的肽段，共選擇了 l-MTHDESREDS-10、18-EQAERYDEMV-27、28-EAMKRVAKLD-37、35-ENSLIAYKSA-44、70-EQKEENKGNE-79、109-QHLIVSSTTG-l18、237_DMQAG⑶EPK-246 和 245-PKPVEDEAPA-254等8個(gè)潛在的抗原決定簇肽段，并在Abmart上海分公司協(xié)助下，用該公司特有的SEAL(Surface Epitope Antibody Library)技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)、純制了這些潛在的抗原決定簇肽段。
[0076]實(shí)施例3:免疫抗原(由Abmart上海分公司協(xié)助完成)
[0077]取純化的P14-3-3抗原決定簇多肽融合蛋白液按等質(zhì)量蛋白混合，用PBS液稀釋成終濃度為ΙΟΟμ g/ml的蛋白混合液，取蛋白液與等量的福氏完全佐劑混合并乳化后，背部皮下多點(diǎn)注射8~12周齡的雌性BALB/c小鼠，免疫劑量為40 μ g/只。2周后，取抗原液與等量福氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第二次常規(guī)免疫；再過3周后，進(jìn)行第三次常規(guī)免疫；再過3周后，從小鼠尾部采血，用間接ELISA法檢測(cè)小鼠產(chǎn)生的抗體滴度；再過I個(gè)月后(融合前的第3天)，從尾靜脈注射劑量為50 μ g/只的混合抗原決定簇多肽液，以加強(qiáng)免疫。
[0078]實(shí)施例4:雜交瘤細(xì)胞的制備(由Abmart上海分公司協(xié)助完成)
[0079](I)NS-1骨髓瘤細(xì)胞的制備:在細(xì)胞融合前，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)NS-1骨髓瘤至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集細(xì)胞(1000rpm, 5min)，用無血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次，并調(diào)整細(xì)胞濃度至106cells/ml。
[0080](2)免疫鼠脾細(xì)胞的制備:取免疫效價(jià)最高的BALB/c鼠，通過眼眶放血處死，在75%酒精中浸泡5min后取脾臟，用無血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗脾臟，在盛有5ml無血清培養(yǎng)液的玻璃培養(yǎng)皿中，用100目的不銹鋼網(wǎng)將脾臟磨碎，用無血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌脾細(xì)胞2次，用無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
[0081](3)飼養(yǎng)細(xì)胞的制備:用注射器將5ml無血清培養(yǎng)液注入未免疫BALB/c鼠腹腔內(nèi)，抽取腹腔液，離心收集飼養(yǎng)層細(xì)胞；用HAT培養(yǎng)液[99ml含15%胎牛血清的DMEM液與ImllOOXHAT (H:次黃嘌呤，A:氨基碟呤，T:胸腺嘧啶)液的混合液]重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO5個(gè)/ml，按100 μ I/孔的量加到96孔培養(yǎng)板中，置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中，以備第二天使用。
[0082](4)細(xì)胞融合:取I X IO8個(gè)脾細(xì)胞和I X IO7個(gè)NS-1細(xì)胞于50ml離心管中，混勻后離心，棄上清后輕彈離心管底部，使沉淀細(xì)胞松動(dòng)，握住離心管底部，在I min內(nèi)滴加完Iml預(yù)熱至37°C的細(xì)胞促融合液[PEG4000質(zhì)量濃度為47.5%、DMSO質(zhì)量濃度為2.5%的DMEM培養(yǎng)液(w/v)]，邊加邊搖離心管；將離心管置于37°C水浴中，在Smin內(nèi)滴加完IOml預(yù)溫至37°C的無血清DMEM培養(yǎng)液(邊加邊輕搖離心管)，600rpm離心5min后，棄上清；用HAT培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X IO5個(gè)/ml，然后按200 μ I/孔的量加入到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d，每孔補(bǔ)加I滴HAT培養(yǎng)液，8~IOd時(shí)，每孔吸去100 μ I培養(yǎng)基，加入100 μ IHT培養(yǎng)液(99ml DMEM培養(yǎng)基加I mllOOXHT液)，待融合細(xì)胞的集落長(zhǎng)至培養(yǎng)孔1/4時(shí)，用間接ELISA法檢測(cè)抗體產(chǎn)生。
[0083]實(shí)施例5:雜交瘤細(xì)胞株的篩選和克隆(由Abmart上海分公司協(xié)助完成)
[0084]用重組表達(dá)的6XHis tagged P14-3-3蛋白包被酶標(biāo)板，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清為一抗，AP (堿性磷酸酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，通過間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體。以未免疫的正常BALB/c鼠血清為ELISA檢測(cè)的陰性對(duì)照。ELISA檢測(cè)連續(xù)2次都為陽性的細(xì)胞孔，按有限稀釋法亞克隆細(xì)胞?？寺∏癐天制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞層。用HAT培養(yǎng)液將要克隆的細(xì)胞濃度調(diào)整為5、10和50細(xì)胞/ml。按100 μ I/孔的將上述三個(gè)濃度的細(xì)胞懸液分別加入己鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中。使相應(yīng)的孔中分別含0.5、I和5個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至第4天半量換液一次，第5~6天仔細(xì)觀察各孔內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況并記錄。在克隆第10~14天后，細(xì)胞長(zhǎng)滿約1/4~1/2孔底時(shí)，全量換液，次日通過間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液抗體效價(jià)。如培養(yǎng)液中含有抗重組Ρ14-3-3的特異性抗體，則選擇抗體效價(jià)高，呈單克隆生長(zhǎng)，形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞孔，繼續(xù)用同樣的方法再克隆一次。之后，以單一的重組抗原決定簇肽段為抗原包被酶標(biāo)板，通過間接ELISA檢測(cè)識(shí)別單一的重組抗原決定簇肽段的抗體，確定抗原表位。將陽性孔的雜交瘤細(xì)胞移至24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)，待24孔板中的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)，按細(xì)胞數(shù)I~2 X IO6/管進(jìn)行凍存，同時(shí)收集細(xì)胞準(zhǔn)備腹水制備。
[0085]實(shí)施例4和5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用混合的抗原決定簇肽段融合蛋白免疫BALB/c鼠，并選取血清效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與NS-1細(xì)胞融合制備了雜交瘤細(xì)胞。通過ELISA法，用重組的P14-3-3篩選培養(yǎng)液呈陽性的雜交瘤細(xì)胞株，獲得16株陽性率為100%的雜交瘤細(xì)胞株 。用ELISA法檢測(cè)這16株雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液與重組的P14-3-3抗原決定簇肽段融合蛋白的反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液與肽段1-MTHDESREDS-10反應(yīng)的細(xì)胞株有I個(gè)，其抗體的親和常數(shù)為2.72X 108，效價(jià)為128K ;培養(yǎng)液與肽段18-EQAERYDEMV-27反應(yīng)的細(xì)胞株有2個(gè)，其抗體的親和常數(shù)分別為3.16 X IO9和4.26 X IO9,效價(jià)均為128K ;培養(yǎng)液與肽段28-EAMKRVAKLD-37反應(yīng)的細(xì)胞株有2個(gè)，其抗體的親和常數(shù)分別為3.55X IO9和3.18X109,效價(jià)分別為128K和100K ;培養(yǎng)液與肽段70-EQKEENKGNE-79反應(yīng)的細(xì)胞株有2個(gè)，其抗體的親和常數(shù)分別為2.72X IO8和2.12X108,效價(jià)均為128K ；培養(yǎng)液與肽段109-QHLIVSSTTG-118反應(yīng)的細(xì)胞株有I個(gè)，抗體的親和常數(shù)為8.51 X 109，效價(jià)為100K ;培養(yǎng)液與肽段149-ENSLIAYKSA-158反應(yīng)的細(xì)胞株有3個(gè)，其抗體的親和常數(shù)均為3.23 X IO9,效價(jià)均為128K ;培養(yǎng)液與肽段237-DMQAGGDEPK-246反應(yīng)的細(xì)胞株有3個(gè)，其抗體的親和常數(shù)分別為6.03 X IO9, 5.76 X IO9和6.33 X IO9,效價(jià)分別為100K, 100K和128K ;培養(yǎng)液與肽段245-PKPVEDEAPA-254反應(yīng)的細(xì)胞株有2個(gè)，親和常數(shù)分別為2.52 X IO8和2.44 X IO8,效價(jià)均為128K ;上述雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)液中的抗體效價(jià)均高于100K，親和常數(shù)均都大于
2.12 X 108，說明所獲得的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體的效率較高，特異性較好。
[0086]實(shí)施例6:單克隆抗體的制備和效價(jià)測(cè)定(由Abmart上海分公司協(xié)助完成)
[0087](I)腹水的制備:對(duì)己經(jīng)建株的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。取8周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5ml/只，7天后向腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO5~5X IO6ceIls/只，待7~10天后小鼠腹腔明顯腫大后處死小鼠采集腹水，將腹水置于室溫下I~2小時(shí)后，再置于4°C冰箱過夜，1200rpm離心IOmin取上清。[0088](2)腹水中單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定:以重組P14-3-3為抗原包被酶標(biāo)板，以稀釋100、200、400、800、1600、3200、6400和12800倍的腹水為一抗，以堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，通過ELISA測(cè)定其A450nm值，用未免疫的小鼠血清做平行陰性對(duì)照試驗(yàn)，P/NS 2.1的為陽性反應(yīng)，與重組P14-3-3抗原發(fā)生反應(yīng)的單克隆抗體的最大稀釋度即為其效價(jià)。
[0089]實(shí)施例6的結(jié)果表明:分別用上述雜交瘤細(xì)胞株制備腹水，并通過Westrn blot檢測(cè)這些腹水與多頭絨泡菌破碎液、6XHis tagged P14_3_3表達(dá)菌破碎液以及與6XHis表達(dá)菌破碎液的反應(yīng)。結(jié)果顯示，識(shí)別肽段1-MTHDESREDS-10、18-EQAERYDEMV-27和245-PKPVEDEAPA-255的腹水能與6XHis tagged P14-3-3表達(dá)菌破碎液中的一個(gè)31kD蛋白(與6 XHis tagged P14-3-3的理論值相符)和多頭絨泡菌的I個(gè)47kD蛋白反應(yīng)(圖2A、B和C的2、3泳道)，但不與6 XHis表達(dá)菌的任何蛋白反應(yīng)(圖2A、B和C的I泳道)，說明上述3個(gè)抗體均可用于檢測(cè)重組和天然的P14-3-3，也可用于檢測(cè)P14-3-3的性質(zhì)、表達(dá)以及生理功能，該結(jié)果也說明天然P14-3-3在翻譯后發(fā)生了化學(xué)修飾。本發(fā)明將上述3個(gè)單克隆抗體分別命名為mAb a +>mAb β +和mAb Y +，將分泌這3個(gè)抗體的雜交瘤細(xì)胞株分別命名為 McAb α +、McAb β + 和 McAb Y +。
[0090]實(shí)施例7:單克隆抗體的篩選
[0091]以含質(zhì)粒pET28a(+)的BL21大腸桿菌(由本實(shí)驗(yàn)室制備)的IPTG (isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,終濃度為1mmol/)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為陰性對(duì)照，以表達(dá)6 XHis tagged P14-3-3的BL21重組菌(由本實(shí)驗(yàn)室制備)的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物為陽性對(duì)照，多頭絨泡菌破碎液(含有天然P14-3-3)為測(cè)試樣品，小鼠腹水為一抗，AP (堿性磷酸酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，通過Western blot篩選有陽性反應(yīng)的腹水。
[0092]實(shí)施例8:單克隆抗體的純化
[0093]用HiTrap protein G親和層析膠純化McAb a+、McAb β +和McAb Y +誘導(dǎo)的腹水，之后再通過SDS-PAGE分析純度。結(jié)果(圖3)顯示，電泳膠上存在兩條清晰的蛋白帶，位于55kD附近的為抗體重鏈，位于25kD附近的為輕鏈，雜蛋白條帶很少，說明抗體純度較高。
[0094]將純化的mAb α +、mAb β +和mAb Y +稀釋5000倍后,再倍比稀釋成不同濃度的溶液，之后以重組Ρ14-3-3為抗原，通過ELISA法檢測(cè)稀釋后抗體效價(jià)，發(fā)現(xiàn)mAb α +、mAb β +和mAb Y +稀釋4X IO5倍后，A450值仍然高于2.0 (圖4顯示)，說明mAb α +、mAb β +和mAb Y +均可以用于ELISA檢測(cè)，也可以用于Western blot檢測(cè),3個(gè)抗體均具有商用價(jià)值。
[0095]實(shí)施例9:單克隆抗體的鑒定
[0096]( I)單克隆抗體的亞類
[0097]按單克隆抗體亞類鑒定試劑盒(Mouse monoclonal antibody isotypingreaents, Sigma)使用說明鑒定單克隆抗體的亞類,通過ELISA法檢測(cè)了這3個(gè)單抗的亞型，發(fā)現(xiàn)3個(gè)單抗均以IgG 2b亞型為主(圖5)。
[0098](2)單克隆抗體的特異性
[0099]通過Western blot法檢測(cè)多頭絨泡菌破碎液、酵母細(xì)胞Y187和人胚腎細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)中與所制備的P14-3-3單克隆抗體反應(yīng)的蛋白。
[0100]結(jié)果表明:通過Westrn blot檢測(cè)了 mAb α+、mAb β +和mAb Y +與多頭絨泡菌,酵母細(xì)胞Y187和人胚腎細(xì)胞HEK293蛋白的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)mAb α +和mAb β +不僅能與多頭絨泡菌14-3-3蛋白反應(yīng)(圖6A的泳道3和圖6B的泳道3)，還能與酵母和人的14_3_3蛋白反應(yīng)(圖6A的泳道1、2和圖6B的泳道1、2 )，說明mAb α +和mAb β +不僅能用于檢測(cè)多頭絨泡菌14-3-3蛋白，也可以用于檢測(cè)酵母和人的14-3-3蛋白。mAb Y +只與多頭絨泡菌14_3_3蛋白反應(yīng)(圖6C的泳道3)，不與酵母和人14-3-3蛋白反應(yīng)(圖6C的泳道1、2)，說明mAb Y +所識(shí)別的14-3-3蛋白具有物種特異性。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，mAba +檢測(cè)到的酵母蛋白分子量為33kD，與酵母的Bmhl分子量相符，mAb β +檢測(cè)到的酵母蛋白分子量為36kD，與酵母的Bmh2分子量相符；mAb α +檢測(cè)到的人蛋白分子量為40kD，mAb β +檢測(cè)到的人蛋白分子量為48kD ;說明mAb α +和mAb β +識(shí)別的酵母蛋白是不同亞型的14_3_3蛋白,mAb α +和mAb β +識(shí)別的人蛋白也可能是不同亞型的14-3-3蛋白。
[0101]實(shí)施例10:利用本發(fā)明的單抗用于研究14-3-3隨細(xì)胞周期以及生命周期的表達(dá)變化
[0102]為了解Ρ14-3-3隨細(xì)胞周期以及生命周期的表達(dá)變化，本發(fā)明用mAb β+，通過Western blot檢測(cè)了多頭絨泡菌細(xì)胞第二次同步化有絲分裂開始后0.5hr (S期)、4.0hr(G2早期)、6.0hr (G2中期)、8.0hr (G2晚期)和9.5hr (Μ期)以及孢子期樣品中Ρ14-3-3的表達(dá)量(見圖7)。
[0103]Quantity One分析結(jié)果(表1和圖8)顯示，P14_3_3的表達(dá)水平在多頭絨泡菌S期最高(圖7的泳道2)，在G2前期降到最低點(diǎn)(圖7的泳道3)，進(jìn)入G2中后期略有升高(圖7的泳道4和5)，在M期又有所下降(圖7的泳道6)，而P14-3-3在多頭絨泡菌孢子的表達(dá)水平比任何時(shí)相同步化原質(zhì)團(tuán)的都低。以M期的P14-3-3表達(dá)水平為比較標(biāo)準(zhǔn)，則P14-3-3在多頭絨泡菌第二次同步化有絲分裂開始后0.5hr (S期)、4.0hr (G2早期)、6.0hr (G2中期)和8.0hr (G2晚期)的相對(duì)水平分別是M期的2.050,0.989、1.178和1.168倍，而孢子中P14-3-3的表達(dá)水平只有M期的0.763倍。
[0104]
【權(quán)利要求】
1.一組分泌14-3-3蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于:該組雜交瘤細(xì)胞株 McAb a +、McAb β + 或 McAb Y +，其微生物保藏號(hào)分別是:CCTCC NO: C2012131、C2012132、C2012133，保藏地點(diǎn):中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.權(quán)利要求1的雜交瘤細(xì)胞株,其中該組雜交瘤細(xì)胞株是由表達(dá)抗體mAba+、mAb3+和mAb Y +的BALB/c鼠B淋巴細(xì)胞與NS-1骨髓瘤細(xì)胞融合后，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選和亞克隆制備而成的。
3.由權(quán)利要求1或2的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體。
4.權(quán)利要求3所述的單克隆抗體,其中所述單克隆抗體是mAba +、mAb β +和mAb Y +,其中，抗體mAb a +所識(shí)別的抗原決定簇肽段為MTHDESREDS ;抗體mAb β +所識(shí)別的抗原決定簇肽段為EQAERYDEMV ;抗體mAb Y +所識(shí)別的抗原決定簇肽段為PKPVEDEAPA。
5.權(quán)利要求4中的抗體，其中: ①mAba +、rnAb β +和mAb Y +的亞型均為IgG2b，效價(jià)為128000，且其與P14-3-3蛋白反應(yīng)的親和常數(shù)分別為:2.72X 108、4.26 X IO9和2.52 X IO8 ； ②mAba +和mAb β +能與酵母14-3-3蛋白Bmhl和Bmh2分別反應(yīng)，以及能與40kD和48kD的人14-3-3蛋白分別反應(yīng)。
6.制備權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的單抗的方法，包括如下步驟: (1)腹水的制備:對(duì)上述己建株的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)； (2)腹水中單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定； (3)單克隆抗體的篩選； (4)單克隆抗體的純化； (5)單克隆抗體的鑒定。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的單抗用于研究多頭絨泡菌或其他物種的P14-3-3蛋白的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述的用途是研究P14-3-3蛋白隨細(xì)胞周期以及生命周期的表達(dá)變化的用途。
9.一種由權(quán)利要求1或2的雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體，其特征在于: mAb a +的輕鏈、重鏈可變區(qū)肽段的氨基酸序列選自SEQ ID NO:2、4 ； mAb β +的輕鏈、重鏈可變區(qū)肽段的氨基酸序列選自SEQ ID ΝΟ:6、8 ; mAb V+的輕鏈、重鏈可變區(qū)肽段的氨基酸序列選自SEQ ID N0:10、12。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中抗體包括所述輕鏈或重鏈的氨基酸序列經(jīng)過I~10個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加并對(duì)14-3-3蛋白具有特異的靶向性，具有影響14-3-3蛋白功能的抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/14GK103627676SQ201310169681
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年5月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月10日
【發(fā)明者】邢苗, 劉士德, 張建華, 陳乃權(quán), 羅慧琳 申請(qǐng)人:深圳大學(xué), 深圳伯美生物醫(yī)藥有限公司