專利名稱：一種抗氟苯尼考胺IgY的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域中的特異性IgY的制備和應用，具體涉及一種抗氟苯尼考胺IgY抗體的制備方法。
背景技術：
氟苯尼考(Florfenicol’FF)是一種新型的動物專用氯霉素類廣譜人工合成抗生素，與同類抗生素相比，因其具有抗菌活性高、無潛在致再生障礙性貧血等優(yōu)點，而成為氯霉素禁 用后的主要替代藥物，在獸醫(yī)臨床上得到廣泛的應用。FF的廣泛使用而引起的藥物殘留問題給人們的健康帶來了很大的威脅。FF具有較強的免疫毒性，能夠抑制免疫接種期或者免疫功能缺陷的動物的免疫反應，且具有一定的血液毒性和胚胎毒性，并能產生耐藥性。氟苯尼考胺(Florfenicol Ae, FFA)為氟苯尼考(Florfenicol，FF)的主要代謝產物，且FF及其主要代謝產物在酸水解條件下都可轉變?yōu)镕FA，因此，許多國家都把FFA作為FF殘留檢測的主要標志物。目前，對于FF及FFA總殘留的檢測主要為高效液相色譜法(HPLC)、質譜(MS)等理化手段，這些方法雖然靈敏度較高，但是相應的成本也較高，對專業(yè)技術要求較高，并不適合大量樣本的快速檢測，而已有的商品化的ELISA檢測試劑盒大多數是針對FF的，對其代謝產物FFA存在很大的漏檢風險，因此，建立一種能夠快速檢測FFA的免疫學檢測方法變得極為重要，結合成熟的動物組織樣品處理方法，可實現同時對FF和FFA的總殘留進行有效檢測。卵黃抗體(egg yolk antibody, IgY)是通過對禽類(雞)免疫注射特定抗原,從而在體內產生IgY，經血液由母體傳遞到卵黃內，在卵黃中富集，進而通過分離卵黃，獲得的特異性多克隆抗體。相對于從哺乳動物血清中獲得抗體，避免了常規(guī)的動物采血，減輕了動物的痛苦，同時通過卵黃獲得抗體，產量大，制備簡單，每枚蛋中可以提純50 IOOmg的抗體，且母雞易于飼養(yǎng)，費用低，便于大規(guī)模的生產特異性抗體，經濟優(yōu)勢明顯。與哺乳動物免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原結合位點，Fe片段包含的位點有補體激活功能、調理素作用和致敏過敏反應作用等功能。但是其結構同哺乳動物有些不同，相對于IgG，IgY重鏈的氨基酸殘基數量多于IgG，且重鏈恒定區(qū)(CH區(qū))數量多于IgG，而輕鏈小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相對于IgG更適合用于治療制劑。IgY等電點(PI)在5.7-7.6之間，在pH4.0 11.0時IgY穩(wěn)定，比兔IgG對酸變性更為敏感，當pH值從4降到3時，IgY活性迅速喪失，而IgG對此只受到微小影響；IgY在低溫下儲存時性能較穩(wěn)定，室溫下可保持6個月的活性，4°C儲存6 7 年活性下降僅 5% (Jaradat Z ff, Marquardt R R.2000.Studies on the stabilityof chicken IgY in different sugars, complex carbohydrates and food materials.Food and Agricultural Immunology，12 (4): 263-272)(卵黃抗體 IgY，在不同的糖，復合碳水化合物和食品原料的的穩(wěn)定性研究。糧食和農業(yè)免疫學雜志)；IgY抗胃蛋白酶消化的穩(wěn)定性較牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力則較強(Shimizu M，Nagashima H，SanoK，et al.1992.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G.BiosciBiotechnol Biochem, 56(2):270-274)(雞和兔免疫球蛋白IgG的分子穩(wěn)定)。由于系統(tǒng)發(fā)生學距離造成哺乳動物和雞抗體特異性的差異，相對于哺乳動物IgG，IgY應用于檢測也具有多方面的優(yōu)勢如=IgY與風濕因子、人類抗鼠抗體(HAMA)沒有交叉反應，無補體系統(tǒng)活性和異質性凝集素，且不結合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反應。此外，禽類針對保守性強的蛋白質往往能引發(fā)較哺乳動物抗體更強烈的抗體反應，成為有關抗體研發(fā)的重要選擇因素。

發(fā)明內容
鑒于現有技術的不足，本發(fā)明旨在于提供一種抗氟苯尼考胺IgY的制備方法。為了實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:一種抗氟苯尼考胺IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟:(I)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，檢測抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成；(2)制備含抗體的免疫蛋，其中，向禽類注射所述免疫抗原，收集所述禽類所生產的蛋，并做標記于4°C保存；(3)提取IgY，其中，從所述收集的蛋分離卵黃和卵清后，提取獲得所述IgY。需要說明的是，所述制備免疫蛋方法如下:向16周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300 μ g,初次免疫后21天進行二次免疫,免疫劑量為250 μ g, 二次免疫后42天進行三次免疫，免疫劑量為250 μ g三次免疫后63天進行四次免疫,免疫劑量為250 μ g,四次免疫后84天進行五次免疫，免疫劑量為250 μ g。需要說明的是，所述提取IgY的方法如下；(I)將所述收集的蛋進行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS按照1:2進行稀釋；(2)向稀釋液加入質量體積比為3.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘；(3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質量體積比為8.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘；(4)將經過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入質量體積比為12%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘，再進行離心，獲得沉淀物；(5)將所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析袋進行透析，使用PBS透析3次，獲得的IgY，并保存在-20度備用。需要說明的是，所述PBS的pH值為7.4。作為一種優(yōu)選的方案，所述禽類為雞。本發(fā)明有益效果在于，可有效增強抗體，具體是，抗氟苯尼考胺IgY在初免2周后，開始產生抗體，在第一次加強免疫后，即第3周，抗體滴度達到1:1280，第四次加強免疫后(14周)，達到最大值 1: 160000，之后，抗體滴度維持在1:160000以上。


圖1為本發(fā)明合成為免疫抗原的反應方程式；圖2為氟苯尼考胺人工抗原合成的紫外分光光度計檢測圖；圖3為抗氟苯尼考胺IgY效價監(jiān)測圖；圖4為抗氟苯尼考胺IgY的電泳圖。
具體實施例方式下面將結合附圖對本發(fā)明作進一步的描述。如圖1所示，本發(fā)明為一種抗氟苯尼考胺IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟:(I)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，檢測抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成；(2)制備含抗體的免疫蛋，其中，向禽類注射所述免疫抗原，收集所述禽類所生產的蛋，并做標記于4°C保存；(3)提取IgY，其中 ，從所述收集的蛋分離卵黃和卵清后，提取獲得所述IgY。需要說明的是，所述制備免疫蛋方法如下:向16周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300 u g,初次免疫后21天進行二次免疫,免疫劑量為250 u g, 二次免疫后42天進行三次免疫，免疫劑量為250 u g,三次免疫后63天進行四次免疫,免疫劑量為250 ii g,四次免疫后84天進行五次免疫,免疫劑量為250 u go需要說明的是，所述提取IgY的方法如下；(I)將所述收集的蛋進行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS按照1:2進行稀釋；(2)向稀釋液加入質量體積比為3.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘；(3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質量體積比為8.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘；(4)將經過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入質量體積比為12%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘，再進行離心，獲得沉淀物；(5)將所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析袋進行透析，使用PBS透析3次，獲得的IgY，并保存在-20度備用。需要說明的是，所述PBS的pH值為7.4。作為一種優(yōu)選的方案，所述禽類為雞。如圖2 4所示，為了更好的理解本發(fā)明，對抗氟苯尼考胺IgY效價進行測定:(I)包被酶標版:用CBS溶液配制蛋白濃度為5 u g/mL的氟苯尼考胺-卵清蛋白溶液，50 u L/孔加入96孔酶標板，37 °C溫育過夜，棄去孔內液體，用PBST洗板3次，每次5分鐘；(2)封閉:用5%脫脂奶粉，滿孔封閉，37°C溫育2h，棄去孔內液體，用PBST洗板3次，每次5分鐘；
(3)加IgY提取液:首先每孔加入50 μ L PBS鋪底，取出分離純化得到的IgY溶液，恢復至室溫后，用稀釋液PBSl: 100稀釋，取50 μ L加入第一孔，吹吸混勻后吸取50 μ L加入第二孔，依次倍比稀釋至1:102400?？瞻纂u蛋提取的IgY50yL為陰性對照(NC)，PBS50yL為空白對照(BC)，37°C溫育lh，棄去孔內液體，洗板；(4)加酶標二抗:辣根過氧化物酶標記的羊抗雞IgY用PBSl:6000稀釋，每孔加入50yL，37°C溫育lh，棄去孔內液體，洗板；(5)顯色:加入新鮮配制的TMB-H2O2底物液50 μ L/孔，室溫避光放置15 20分鐘,棄去孔內液體,洗板；(6)終止:最后加入50 μ L2mol/L的H2SO4終止反應，在450nm波長處用酶標儀測其OD值，每孔重復三次求平均值；(7)結果判定:求樣品孔OD45tl值(P)與陰性對照孔OD45tl值(N)的比值，當P/N彡2.1時，判判為陽性，所對應的抗體最大稀釋倍數即為該抗體效價。結果顯示，抗FFA-1gY在初免2周后，開始產生抗體，在第一次加強免疫后，即第3周，抗體滴度達到1:1280， 第四次加強免疫后(14周)，達到最大值1:160，000，之后，抗體滴度維持在1: 160，000以上。對于本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬于本發(fā)明權利要求的保護范圍之內。
權利要求
1.一種抗氟苯尼考胺IgY的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，檢測抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成； (2)制備含抗體的免疫蛋，其中，向禽類注射所述免疫抗原，收集所述禽類所生產的蛋，并做標記于4°C保存； (3)提取IgY，其中，從所述收集的蛋分離卵黃和卵清后，提取獲得所述IgY。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述制備免疫蛋方法如下:向16周齡禽類進行初次免疫注射，免疫劑量為300 u g,初次免疫后21天進行二次免疫,免疫劑量為250 ii g, 二次免疫后42天進行三次免疫,免疫劑量為250 ii g,三次免疫后63天進行四次免疫，免疫劑量為250 u g,四次免疫后84天進行五次免疫,免疫劑量為250 u g。
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述提取IgY的方法如下； (1)將所述收集的蛋進行卵黃與卵清分離，收集卵黃，將卵黃使用PBS(pH7.4)按照1:2進行稀釋； (2)向稀釋液加入質量體積比為3.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘； (3)將混合液離心，收集上清，過濾，濾液加入質量體積比為8.5%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘； (4)將經過攪拌后的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮，加入質量體積比為12%的PEG-6000，充分攪拌，搖床上室溫作用30分鐘，再進行離心，獲得沉淀物； (5)將所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析袋進行透析，使用PBS透析3次，獲得的IgY，并保存在-20度備用。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述PBS的pH值為7.4。
5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述禽類為雞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗氟苯尼考胺IgY的制備方法，所述方法包括以下步驟(1)氟苯尼考胺人工抗原合成，其中，免疫抗原采用氟苯尼考胺和牛血清白蛋白合成，檢測抗原采用氟苯尼考胺和卵清白蛋白合成；(2)制備含抗體的免疫蛋，其中，向禽類注射所述免疫抗原，收集所述禽類所生產的蛋，并做標記于4℃保存；(3)提取IgY，其中，從所述收集的蛋分離卵黃和卵清后，提取獲得所述IgY。根據所述方法制備的抗氟苯尼考胺IgY為實際中快速檢測氟苯尼考胺提供了一種抗體檢測方法。
文檔編號C07K16/44GK103242450SQ20131021009
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月30日 優(yōu)先權日2013年5月30日
發(fā)明者張小鶯, 劉小爽, 何金鑫 申請人:西北農林科技大學