土鱉蟲(chóng)提取物的兩種三肽、其制備、鎮(zhèn)痛作用及在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了土鱉蟲(chóng)提取物的兩種三肽、其制備、鎮(zhèn)痛作用及在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用。本發(fā)明從土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物發(fā)現(xiàn)的含量最高的Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三肽，公開(kāi)了它們的制備方法，公開(kāi)了它們的鎮(zhèn)痛作用，進(jìn)一步公開(kāi)了它們?cè)谥贫ㄍ流M蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】土鱉蟲(chóng)提取物的兩種三肽、其制備、鎮(zhèn)痛作用及在制定質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 土鱉蟲(chóng)是2010版中國(guó)藥典二部收載的中藥，以鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉或冀地鱉的雌 蟲(chóng)干燥體入藥。本發(fā)明涉及從土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或者水提取物中發(fā)現(xiàn)的含量最高的 Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三肽，涉及它們的制備方法,涉及它們的鎮(zhèn)痛作用，進(jìn)一 步涉及它們?cè)谥贫ㄍ流M蟲(chóng)干粉提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 疼痛不僅是許多疾病的并合癥，而且自身已經(jīng)被看作是一類(lèi)疾病。從疾病層面上 講，由各種各樣的疼痛造成的生活質(zhì)量下降波及了最大量的人群。由于有效的鎮(zhèn)痛劑往往 與依賴性相聯(lián)系，所以發(fā)明新的無(wú)依賴性的鎮(zhèn)痛劑具有重要價(jià)值。
[0003] 土鱉及土鱉干粉在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。土鱉及土鱉干粉在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī) 學(xué)中應(yīng)用時(shí)一方面都是經(jīng)口服給藥，土鱉及土鱉干粉經(jīng)口服給藥的一次劑量在log左右。 這樣大的劑量，以及土鱉及土鱉干粉自身的腥臭使病人服用非常不便。依據(jù)土鱉及土鱉干 粉的蛋白質(zhì)性質(zhì)、蛋白質(zhì)經(jīng)口服進(jìn)入胃可被胃蛋白酶降解為多肽的性質(zhì)，以及多肽的良好 水溶性，發(fā)明人推測(cè)土鱉及土鱉干粉的直接水提物和酶解物有可能在不減弱治療效果的前 提下減少服藥量。發(fā)明人的這兩種認(rèn)識(shí)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證之后，分別獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán) (1.彭師奇，趙明，魏蕾，曹連甲，邵丹，耿承芳，葉發(fā)舜，廖銀根，土鱉干粉酶解物的制備及在 醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，ZL200610140160. 1 ;2.彭師奇，趙明，魏蕾，李春波，毛偉，葉偉東，土鱉干粉 水提取物的制備及應(yīng)用，ZL200910246926. 8)。
[0004] 與本發(fā)明相關(guān)的上述兩項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，分別披露了土鱉干粉酶解物的制備及具 有鎮(zhèn)痛活性的凍干粉的Maldi-TOF指紋圖譜，和土鱉干粉水提取物的制備及具有鎮(zhèn)痛活性 的凍干粉的Maldi-TOF指紋圖譜。雖然根據(jù)Maldi-TOF指紋圖譜，上述兩項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利 從土鱉干粉酶解物或水提取物的鎮(zhèn)痛部位分析了一些多肽序列，但既未能給出土鱉干粉酶 解物或水提取物的鎮(zhèn)痛部位的分離的多肽譜峰，也未能給出土鱉干粉酶解物或水提取物的 鎮(zhèn)痛部位豐度最大的多肽譜峰，還未能給出土鱉干粉酶解物或水提取物的鎮(zhèn)痛部位定義的 多肽的鎮(zhèn)痛作用。針對(duì)上述兩項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利沒(méi)有解決的兩個(gè)問(wèn)題，本發(fā)明披露了從土鱉 干粉酶解物或水提取物的鎮(zhèn)痛部位發(fā)現(xiàn)的豐度最大的兩種三肽，披露了這兩種三肽的鎮(zhèn)痛 作用，進(jìn)一步披露了這兩種三肽在制定土鱉干粉酶解物或水提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一項(xiàng)內(nèi)容是尋找最佳的HPLC-MS條件，定義土鱉干粉酶解物或水提取 物中兩個(gè)最強(qiáng)峰的Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三膚。
[0006] 本發(fā)明的第二項(xiàng)內(nèi)容是按照標(biāo)準(zhǔn)的液相合成方法制備Pro-Ala-Arg和 Val-Ala-Arg兩種三肽，具體可描述為：
[0007] 1)采用液相合成方法，通過(guò)逐步接肽合成Ala-Arg的保護(hù)中間體；
[0008] 2)脫去Arg-Gly的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基；
[0009] 3)把Boc-Pro和Boc-Val分別與N端游離的Arg-Gly的保護(hù)中間體偶聯(lián)，制備 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 的保護(hù)中間體；
[0010] 4)把N端游離的Asp-Val的保護(hù)中間體和C端游離的Arg-Gly保護(hù)中間體偶聯(lián)得 到Arg-Gly-Asp-Val的保護(hù)中間體；
[0011] 5)脫去Arg-Gly-Asp-Val和Arg-Gly-Asp-Val的保護(hù)中間體的保護(hù)基，得到 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 兩種三膚。
[0012] 本發(fā)明的第三項(xiàng)內(nèi)容是描述Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三肽在制定鳘蟲(chóng)干 粉酶解物或水提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的第四項(xiàng)內(nèi)容是描述Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三肽作為鎮(zhèn)痛劑的 應(yīng)用。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1. 土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物的υν-HPLC譜。
[0015] 圖2. 土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物的離子流譜。
[0016] 圖3.離子流譜中保留時(shí)間為12. 07min的峰的質(zhì)譜圖。
[0017] 圖4.離子流譜中保留時(shí)間為13. 825min的峰的質(zhì)譜圖。
[0018] 圖5. 1053的峰應(yīng)當(dāng)是1分子Pro-Ala-Arg肽和2分子Val-Ala-Arg肽形成的雜 三聚體，因?yàn)?1035 = 342+344+344+Na。
[0019] 圖 6. Pro-Ala-Arg 和 Val-Ala-Arg 的液相合成。i)二環(huán)己基羰二亞胺（DCC)，N_ 輕 基苯并三氮唑（Η0ΒΤ)和N-甲基嗎啉（NMM) ;ii)HCl/乙酸乙酯（6M) ;iii)三氟甲磺酸和三 氟乙酸。
[0020] 圖 7.合成的 Pro-Ala-Arg 的 UV-HPLC 譜。
[0021] 圖8.合成的Pro-Ala-Arg的離子流譜。
[0022] 圖9.合成的Pro-Ala-Arg的質(zhì)譜。
[0023] 圖 10.合成的 Val-Ala-Arg 的 UV-HPLC 譜。
[0024] 圖11.合成的Val-Ala-Arg的離子流譜。
[0025] 圖12.合成的Val-Ala-Arg的質(zhì)譜圖。
[0026] 圖13.比較土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的UV-HPLC譜（上）與實(shí)施例2得到的合成 的 Pro-Ala-Arg 的 UV-HPLC 譜（中），及合成的 Val-Ala-Arg 的 UV-HPLC 譜（下）。
[0027] 圖14.合成的Pro-Ala-Arg與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC譜。
[0028] 圖15.合成的Val-Ala-Arg與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC譜。
[0029] 圖16.圖1，圖7,圖14和圖15圖五個(gè)UV-HPLC譜疊加。
[0030] 圖17.合成的Pro-Ala-Arg的鎮(zhèn)痛活性。
[0031] 圖18.合成的Val-Ala-Arg的鎮(zhèn)痛活性。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它 們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0033] 實(shí)施例1. 土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物的多肽組份的HPLC-MS譜 [0034] a)儀器與方法
[0035] HPLC :Waters (自動(dòng)進(jìn)樣器），紫外串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器。色譜柱為Harmony C18柱 (5ym)，250X4. 6_。流動(dòng)相為甲醇：水=5 : 95。流速為0. 25ml/min。UV檢測(cè)波長(zhǎng)為 210nm;質(zhì)譜：Micromass Quattro micro TM API (Waters Co·)。ES+模式。Source Temp 為 12CTC，Desolvent Temp 為 20CTC，Mass(m/z) :2_2000,Cone Voltage 為 30V。
[0036] b)測(cè)定土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物的多肽組分的色譜
[0037] 將土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物用雙蒸水稀釋160倍。按照上面的參數(shù)開(kāi)啟儀 器，進(jìn)樣20 μ L。得到圖1的UV-HPLC譜和圖2的離子流譜。
[0038] c)測(cè)定土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物的多肽組分的質(zhì)譜
[0039] 針對(duì)離子流譜中保留時(shí)間為12. 07min和的13. 825min的峰測(cè)得的質(zhì)譜圖分別為 圖3和圖4。對(duì)圖3進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)了 343和365以及345和367顯示M+H和M+Na兩種關(guān) 系的兩組峰。因?yàn)?43 = 342+H和365 = 342+Na，所以342應(yīng)當(dāng)是Pro-Ala-Arg肽的分子 量。因?yàn)?45 = 344+H和367 = 344+Na，所以344應(yīng)當(dāng)是Val-Ala-Arg肽的分子量。
[0040] 對(duì)圖4進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)了 687的峰。因?yàn)?87 = 342+344+H，所以687應(yīng)當(dāng)是1分 子Pro-Ala-Arg肽和1分子Val-Ala-Arg肽形成的雜二聚體。
[0041] 對(duì)圖5進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)了 1053的峰。因?yàn)?035 = 342+344+344+Na，所以1035應(yīng) 當(dāng)是1分子Pro-Ala-Arg肽和2分子Val-Ala-Arg肽的雜三聚體。
[0042] 實(shí)施例 2.制備 Pro-Ala-Arg
[0043] a)將586mg(3. lmmol)Boc-L-Ala用10ml無(wú)水四氫呋喃溶解，冰浴冷卻，向得到 的溶液中加入430mg(3. lmmol)N_輕基苯并三氣唑（Η0ΒΤ)和640mg(3. lmmol)二環(huán)己基 羰二亞胺（DCC)，將此反應(yīng)液冰浴下攪拌10min。加入958mg(3. lmmoDW-NOfL-Arg-OBzl 和350mg(3. lmmol)N_甲基嗎啉（NMM),室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)混合物過(guò)濾，濾除二環(huán)己基脲 (D⑶)。濾液減壓濃縮，殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5% NaHCOyK 溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，5 % KHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機(jī)相用無(wú)水 Na2S04干燥，過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，殘留物經(jīng)柱層析純化（氯仿/甲醇，30 : 1)得到 1414mg(95%)Boc-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl。ESI-MS(m/e) :481[M+H] +。[a]D25 = -48 (c = 0· 1，CH30H)。
[0044] b)將 960mg(2mmol)Boc-Ala-NG-N02-L-Arg_0Bzl 溶解在 10ml 氣化氧-乙酸乙酉旨 溶液^M)中，冰浴下攪拌反應(yīng)2h，TLC(氯仿/甲醇，5 : 1)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。減壓濃縮，殘留物 加20ml乙酸乙酯溶解，水泵抽干以除去游離HC1，重復(fù)3次。加20ml乙醚將殘留物研磨得 目標(biāo)化合物，直接投下步反應(yīng)。ESI-MS(m/e) :381[M+H] +。
[0045] c)將430mg(2mmol)Boc-L-Pro用10ml無(wú)水四氫呋喃溶解，冰浴冷卻，向得到的 溶液中加入277mg(2mmol)N-輕基苯并三氮唑（Η0ΒΤ)和413mg(2mmol)二環(huán)己基羰二亞 胺（DCC)，將此反應(yīng)液冰浴下攪拌10min。加入TeZmgOmmoDAla-N^NOfL-Arg-OBzl和 226mg(3. lmmol)N_甲基嗎啉（NMM),室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)混合物過(guò)濾，濾除二環(huán)己基脲 (D⑶)。濾液減壓濃縮，殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5 % NaHCOyK 溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，5 % KHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機(jī)相用無(wú)水 Na2S04干燥，過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，殘留物經(jīng)柱層析純化（氯仿/甲醇，30 : 1)得到 1062mg(92% )Boc-Pr〇-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl〇 ESI-MS(m/e) ：578[M+H] + 〇 [ a ]D25 = -63 (c =0· 1，CH3OH)。
[0046] d)0°C將 577mg(lmmol)Boc-Pr〇-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl 用 10ml 三氟甲磺酸 / 三 氟乙酸（1 : l，v/v)溶解，冰浴攪拌4h。反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘留物用無(wú)水乙醚反復(fù)洗， 除去剩余的三氟甲磺酸/三氟乙酸。殘留物用0. 5ml蒸餾水溶解，用G5凝膠色譜柱純化， 冷凍干燥得到 54711^(80% )Pr〇-Ala_Arg。ESI_MS(m/e) :343[M+H]+。[a]D25 = -64 (c = 0· 1，CH30H)。
[0047] 實(shí)施例 3.制備 Val-Ala-Arg
[0048] a)將434mg (2mmol) Boc-L-Val用10ml無(wú)水四氫呋喃溶解，冰浴冷卻，向得到 的溶液中加入277mg(2mmol)N-輕基苯并三氮唑（Η0ΒΤ)和413mg(2mmol)二環(huán)己基羰二 亞胺（DCC)，將此反應(yīng)液冰浴下攪拌 lOmin。加入 762mg(2mmol)Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl 和226mg(3. lmmol)N_甲基嗎啉（NMM),室溫?cái)嚢?4h。反應(yīng)混合物過(guò)濾，濾除二環(huán)己基 脲（D⑶）。濾液減壓濃縮，殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5% NaHC03 水溶液洗，飽和NaCl水溶液洗，5 % KHS04水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機(jī)相用無(wú) 水Na2S04干燥，過(guò)濾、濾液減壓濃縮至干，殘留物經(jīng)柱層析純化（氯仿/甲醇，30 : 1)得 至lj 1077mg(93 % ) Boc-Val_Ala-NG-N02-L-Arg-〇Bzl。ESI-MS (m/e) :580 [M+H]+。[ a ]D25 =-33. 00(c = 0· 1，CH30H)。
[0049] b)0°C將 579mg(lmmol)Boc-Val-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl 用 10ml 三氟甲磺酸 / 三 氟乙酸（1 : l，v/v)溶解，冰浴攪拌4h。反應(yīng)混合物減壓濃縮，殘留物用無(wú)水乙醚反復(fù)洗， 除去剩余的三氟甲磺酸/三氟乙酸。殘留物用0. 5ml蒸餾水溶解，用G5凝膠色譜柱純化，冷 凍干燥得到 578mg(84% )Pr〇-Ala-Arg。ESI-MS(m/e) :345[M+H] +。[a ]D25 = 16(c = 0· 1， CH30H) 〇
[0050] 實(shí)施例4.合成的Pr〇-Ala_Arg和Val-Ala-Arg兩種三膚的HPLC-MS譜
[0051] a) Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 的液相合成
[0052] 采用標(biāo)準(zhǔn)的液相合成方法，按圖6的路線制得純的Pro-Ala-Arg和 Val-Ala-Arg?？删唧w描述為1)將Boc-Ala與N-胍基-N02-Arg-0Bzl偶聯(lián)為保護(hù) 中間體Boc-Ala-W-NOfArg-OBzl (收率96 % ) ;2)用濃度為6M的氯化氫的乙酸乙 酯溶液脫去Boc-Ala-W-NC^-Arg-OBzl的N端保護(hù)基Boc (收率98 % ) ;3)將得到的 Ala-NG-N02_Arg-〇Bzl 與 Boc-Pro 和 Boc-Val 分別偶聯(lián)為 Boc_Pr〇-Ala-NG-N02-Arg-0Bzl 和B〇C-Val-Ala-NG-N02-Arg-0Bzl(收率95%) ;4)用三氟甲磺酸的三氟乙酸溶液脫去 Boc-Pr〇-Ala_NG-N02-Arg-0Bzl 和 Boc-Val-Ala_NG-N02-Arg-0Bzl 的保護(hù)基（收率 90% ); 5)得到的Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg粗品用凝膠色譜柱純化，用高純水洗脫得到 Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三肽的純品（收率80%，HPLC純度為98% )?？偸章蕿?72%。
[0053] b)測(cè)定合成的 Pro-Ala-Arg 的 HPLC-MS 譜
[0054] 將Pro-Ala-Arg用雙蒸水溶解為400 μ g/mL的溶液。按照實(shí)施例1的參數(shù)開(kāi)啟儀 器，進(jìn)樣20 μ L。得到圖7的UV-HPLC譜，圖8的離子流譜和圖9的質(zhì)譜圖。圖9與圖3的 部分質(zhì)譜圖明顯匹配。
[0055] c)測(cè)定合成的 Val-Ala-Arg 的 HPLC-MS 譜
[0056] 將Val-Ala-Arg用雙蒸水溶解為400 μ g/mL的溶液。按照實(shí)施例1的參數(shù)開(kāi)啟儀 器，進(jìn)樣20 μ L。得到圖10的UV-HPLC譜，圖11的離子流譜和圖12的質(zhì)譜圖。圖12與圖 3的部分質(zhì)譜圖明顯匹配。
[0057] 實(shí)施例5.比較UV-HPLC譜
[0058] 將實(shí)施例1得到的土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的UV-HPLC譜（圖1)與實(shí)施例2得 到的合成的Pro-Ala-Arg的UV-HPLC譜（圖7)，及合成的Val-Ala-Arg的UV-HPLC譜（圖 10)進(jìn)行比較，可以看到Pro-Ala-Arg的UV-HPLC譜（圖7)與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的 UV-HPLC譜（圖1)的前面的峰相匹配，Val-Ala-Arg的UV-HPLC譜（圖10)也與土鱉蟲(chóng)酶 解物或水提取物的UV-HPLC譜（圖1)的前面的峰相匹配。
[0059] 實(shí)施例6.合成的Pro-Ala-Arg與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物混合的UV-HPLC譜
[0060] 將合成的Pro-Ala-Arg用雙蒸水溶解為400 μ g/mL的溶液，取100 μ L該溶液與 100 μ L實(shí)施例1制備的土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的水溶液混合。按照實(shí)施例1的參數(shù)開(kāi)啟 儀器，進(jìn)樣20 μ L。得到圖14的UV-HPLC譜。該圖與圖13的上圖相比，土鱉蟲(chóng)酶解物或水 提取物的前面的峰強(qiáng)度明顯增高。
[0061] 實(shí)施例7.合成的Val-Ala-Arg與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物混合的UV-HPLC譜
[0062] 將合成的Val-Ala-Arg用雙蒸水溶解為400 μ g/mL的溶液，取100 μ L該溶液與 100 μ L實(shí)施例1制備的土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的水溶液混合。按照實(shí)施例1的參數(shù)開(kāi)啟 儀器，進(jìn)樣20 μ L。得到圖15的UV-HPLC譜。該圖與圖13的上圖明顯相似。
[0063] 將VAR用雙蒸水溶解為400 μ g/mL的溶液，取100 μ L與100 μ L上面制備的土鱉 蟲(chóng)酶解物的水溶液混合。按照上面的參數(shù)開(kāi)啟儀器，進(jìn)樣20yL。得到圖15的UV-HPLC譜。 該圖與圖13的上圖相比，土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的前面的峰強(qiáng)度也明顯增高。
[0064] 實(shí)施例8.得到的五個(gè)UV-HPLC譜疊加
[0065] 將上面得到的土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物的UV-HPLC譜圖、合成的 Pro-Ala-Arg 的 UV-HPLC 譜圖、合成的 Val-Ala-Arg 的 UV-HPLC 譜圖（圖 13)，合成的 Pro-Ala-Arg與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC譜圖（圖14)，合成的 Val-Ala-Arg與土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC譜圖（圖15)五個(gè)色譜圖疊 力口，得到圖16。這五個(gè)圖良好的匹配性既進(jìn)一步說(shuō)明了土鱉蟲(chóng)酶解物或水提取物的主要組 分是Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg兩種三肽，又說(shuō)明了采用UV-HPLC可以穩(wěn)定地控制土鱉 蟲(chóng)酶解物或水提取物的生產(chǎn)質(zhì)量。
[0066] 實(shí)施例9.合成的Pro-Ala-Arg的鎮(zhèn)痛活性
[0067] 將雄性ICR小鼠（22±2g)分為阿司匹林對(duì)照組（灌胃劑量為167ymol/kg)，以 及Pro-Ala-Arg治療組（灌胃劑量為10 μ mol/kg)分別用0. 3ml生理鹽水溶解。將小鼠置 于特制塑料圓筒內(nèi)，尾部暴露在筒外，室內(nèi)溫度保持在（20 ± 1 °C )，待動(dòng)物穩(wěn)定30min后，以 輻射熱甩尾法測(cè)痛，采用一特制燈罩使其發(fā)出直徑為2mm的光束照在距尾端部約2-3cm處， 調(diào)節(jié)光源電壓使甩尾潛伏期在6. 5-8. 5s，兩次測(cè)甩尾潛伏期的間隔為5min，共測(cè)4次，取 平均值作為基礎(chǔ)閾值。給藥后30min，60min，90min，120min，150min和180min各測(cè)一次閾 值。測(cè)得值與基礎(chǔ)值比較，以變化率表示痛閾變化，即（給藥后的痛閾-基礎(chǔ)痛閾）/基礎(chǔ)痛 閾X 100%，痛閾超過(guò)15s者按15s計(jì)算。測(cè)定的數(shù)據(jù)用圖17表示?？梢钥闯?，在10 μ mol/ kg的口服劑量下合成的Pro-Ala-Arg從30min開(kāi)始顯示強(qiáng)鎮(zhèn)痛活性，60min達(dá)到最佳鎮(zhèn)痛 點(diǎn)。合成的Pro-Ala-Arg的鎮(zhèn)痛作用可維持180min以上。
[0068] 實(shí)施例10.合成的Val-Ala-Arg的鎮(zhèn)痛活性
[0069] 將雄性ICR小鼠（22±2g)分為阿司匹林對(duì)照組（灌胃劑量為167ymol/kg)，以及 Val-Ala-Arg治療組（灌胃劑量為1 μ mol/kg)分別用0. 3ml生理鹽水溶解。將小鼠置于特 制塑料圓筒內(nèi)，尾部暴露在筒外，室內(nèi)溫度保持在（20±1°C )，待動(dòng)物穩(wěn)定30min后，以輻射 熱甩尾法測(cè)痛，采用一特制燈罩使其發(fā)出直徑為2mm的光束照在距尾端部約2-3cm處，調(diào)節(jié) 光源電壓使甩尾潛伏期在6. 5-8. 5s，兩次測(cè)甩尾潛伏期的間隔為5min，共測(cè)4次，取平均值 作為基礎(chǔ)閾值。給藥后60min，90min，120min，150min和180min各測(cè)一次閾值。測(cè)得值與 基礎(chǔ)值比較，以變化率表示痛閾變化，即（給藥后的痛閾-基礎(chǔ)痛閾）/基礎(chǔ)痛閾X 100%， 痛閾超過(guò)15s者按15s計(jì)算。測(cè)定的數(shù)據(jù)用圖18表示?？梢钥闯?，在1 μ mol/kg的口服劑 量下合成的Val-Ala-Arg從60min開(kāi)始顯示強(qiáng)鎮(zhèn)痛活性，90min達(dá)到最佳鎮(zhèn)痛點(diǎn)。合成的 Val-Ala-Arg的鎮(zhèn)痛作用可維持180min以上。
【權(quán)利要求】
1. 從土鱉蟲(chóng)干粉酶解物或者水提取物中發(fā)現(xiàn)的兩種三肽，其特征在于：其氨基酸序列 分別為 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 2 所示。
2. 分離權(quán)利要求1的兩種三肽的LC-MS方法。
3. 制備權(quán)利要求1的兩種三肽的方法，包括： 1) 采用液相合成方法，通過(guò)逐步接肽合成Ala-Arg的保護(hù)中間體； 2) 脫去Arg-Gly的保護(hù)中間體的N端保護(hù)基； 3) 把Boc-Pro和Boc-Val分別與N端游離的Arg-Gly的保護(hù)中間體偶聯(lián)，制備 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 的保護(hù)中間體； 4) 把N端游離的Asp-Val的保護(hù)中間體和C端游離的Arg-Gly保護(hù)中間體偶聯(lián)得到 Arg-Gly-Asp-Val的保護(hù)中間體； 5) 脫去Arg-Gly-Asp-Val和Arg-Gly-Asp-Val的保護(hù)中間體的保護(hù)基，得到 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 兩種三膚。
4. 權(quán)利要求1的兩種三肽在制定鱉蟲(chóng)干粉酶解物或水提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1的兩種三肽作為鎮(zhèn)痛劑的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K1/02GK104250284SQ201310257454
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】彭師奇, 趙明, 唐靜成, 宮權(quán), 李春波, 吳國(guó)峰 申請(qǐng)人:浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠