一種人凝血因子Ⅷ的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人凝血因子Ⅷ的制備方法，包括冷沉淀溶解、聚乙二醇沉淀、離心分離、滅活、第二次聚乙二醇沉淀、第二次離心分離、沉淀溶解、凍干及第二次病毒滅活等步驟。本發(fā)明所用全部試劑均為常規(guī)試劑，價格便宜，用肝素鈉作為溶解液，提高了活性的回收率，且不使用氫氧化鋁作為沉淀劑，避免了最終產(chǎn)品中殘留鋁。本發(fā)明操作簡便、整個過程時間短、適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】-種人凝血因子WI的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種人凝血因子W的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 甲型血友病又稱為抗血友病球蛋白缺乏癥或第W因子缺乏癥，是一種由于基因缺 陷引起的凝血功能障礙性遺傳病。患者多為男性，病人因體內(nèi)缺乏凝血因子w而經(jīng)常發(fā)生 內(nèi)出血，僅靠自身機能難以止血。
[0003] 凝血因子W是一種血漿高分子糖蛋白，由2332個氨基酸殘基組成，在內(nèi)源性凝血 體系中起了十分重要的作用，是激活凝血因子IX的輔助因子。凝血因子W替代療法是治療 甲型血友病及預(yù)防急性出血發(fā)作最有效的措施，常用的替代品包括血漿、濃縮凝血因子W 及重組凝血因子W等。
[0004] 按我國現(xiàn)有甲型血友病患者5-10萬計算，每年維持國內(nèi)患者治療至少需要人凝 血因子W制品約80萬瓶（200IU/瓶)，每年缺口約40萬瓶（200IU/瓶)。盡管目前市場上有 進口基因重組凝血因子W產(chǎn)品，但其價格是國內(nèi)血漿類產(chǎn)品的4倍。
[0005] 國內(nèi)大多數(shù)廠家在制備人凝血因子W的過程中，使用柱層析，成本高。此外，使用 氫氧化鋁進行沉淀，容易導(dǎo)致最終產(chǎn)品中殘留鋁。
[0006] 因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)出一種低成本、高收率的人凝血因子W制備方法，簡單可 行，且能規(guī)模生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種人凝血因子W的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種人凝血因子W的制備方法，所述方法包括以下步 驟：
[0009] (a)將冷沉淀用40-80IU/ml肝素鈉溶解液溶解，調(diào)節(jié)pH至6. 1-6. 5,溶液溫度維 持在 20-35 °C ;
[0010] (b)將聚乙二醇溶液加入到步驟a)獲得的溶液中混合均勻，得到聚乙二醇濃度為 2. 5%-4. 5%(wt/v〇l)的混合溶液，所述混合溶液的溫度維持在20-30°C ;
[0011] (c)對步驟b)獲得的混合溶液進行離心，取上清液；
[0012] (d)將磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步驟c)獲得的上清液中混合均勻得到混 合溶液，并對所述混合溶液進行滅活；
[0013] (e)將聚乙二醇溶液加入到步驟d)獲得的溶液中混合均勻，得到聚乙二醇濃度為 10%-14%(wt/v 〇l)的混合溶液，所述混合溶液的溫度維持在10-20°C ;
[0014] (f)對步驟e)獲得的混合溶液進行離心，收集沉淀；
[0015] (g)對步驟f)獲得的沉淀進行洗滌，所述洗滌是指將所述沉淀溶解于1. 5-2. 5M甘 氨酸洗滌液中，攪拌后進行離心；
[0016] (h)將步驟g)獲得的沉淀溶解于溶解液后冷凍干燥得到所述人凝血因子W，其 中，每10千克所述溶解液內(nèi)含枸櫞酸三鈉4. 5-8. 5克及甘氨酸70-110克。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述肝素鈉溶解液的重量是所述冷沉淀的重量的1-4倍。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟a)中所述冷沉淀的溶解過程中，溶液的溫度控制在 25-32。。。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟a)中，采用0· 1-0. 5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6. 1-6. 5。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟b)中加入20_40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，較佳地， 加入25-35%(wt/v 〇l)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/v〇l)的聚乙二醇溶液，最 佳地，加入30%(wt/vol)的聚乙二醇溶液。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟c)中離心分離流量為20_50L/hr，離心出液溫度為 12-17。。。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟d)獲得的混合溶液中磷酸三丁酯的濃度為0. 3vol%， 聚山梨酯-80的濃度為1. Ovol%。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟d)中將所述混合溶液置于24_26°C持續(xù)6hr，對所述混 合溶液進行滅活。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟e)中加入20_40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，較佳地， 所述步驟e)中加入25-35%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/vol)的聚 乙二醇溶液，最佳地，加入30%的聚乙二醇溶液。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟f)中離心分離流量為40_70L/hr，離心出液溫度為 7-12。。。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，步驟g)中，按1 :15-1 :20的比例（即1重量份沉淀加入15-20 重量份1. 5-2. 5M甘氨酸洗滌液）將所述沉淀充分溶解于1. 5-2. 5M甘氨酸洗滌液中，攪拌 30-60分鐘使沉淀得到充分溶解，攪拌使洗滌充分，之后于6-11 °C以3000-5000轉(zhuǎn)/分鐘的 離心速度離心10-25分鐘獲得洗滌后的沉淀。本發(fā)明中所述甘氨酸洗滌液優(yōu)選為甘氨酸的 水溶液。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟h)中將沉淀溶解于10-20倍量(重量)的溶解液中。本 發(fā)明中，所述溶解液優(yōu)選為枸櫞酸三鈉及甘氨酸的水溶液。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述冷凍干燥的條件如下：
[0029] 升溫至-45?_40°C，保持15-20小時；
[0030] 升溫至-15?-10°C，保持10-15小時；
[0031] 升溫至0?5°C，保持10-15小時；
[0032] 升溫至10?15°C，保持8-10小時；
[0033] 升溫至30°C?33°C，保持6-8小時。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括對步驟h)獲得的所述人凝血因子W進行滅活 的步驟。在另一優(yōu)選例中，所述滅活是指將所述人凝血因子W置于98-KKTC水浴中30min 進行干熱病毒滅活處理。
[0035] 本發(fā)明的方法，保持了溶解時的活性，避免了常規(guī)方法中氫氧化鋁沉淀造成的鋁 殘留，工藝簡單，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0036] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【具體實施方式】
[0037] 本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次研發(fā)出一種人凝血因子W的制備方 法，采用肝素鈉溶解液溶解冷沉淀，且采用聚乙二醇沉淀，避免了常規(guī)方法中氫氧化鋁沉淀 造成的鋁殘留，工藝簡單，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0038] 術(shù)語
[0039] 本發(fā)明中，人凝血因子W和人凝血因子W制品具有相同的含義，均是指本發(fā)明方 法獲得的制品。
[0040] 本發(fā)明中，冷沉淀（cryoprecipitation ;cryoprecipitate ;cryoprecitation)是 指血漿冷沉淀中含有W因子及纖維蛋白原。
[0041] 制備方法
[0042] 本發(fā)明的人凝血因子W的制備方法，包括冷沉淀溶解、聚乙二醇沉淀、離心分離、 滅活、第二次聚乙二醇沉淀、第二次離心分離、沉淀溶解、凍干及第二次病毒滅活等步驟。
[0043] 在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中，人凝血因子W的制備方法包括以下步驟：
[0044] (1)、冷沉淀的溶解：經(jīng)粉碎的冷沉淀倒入1?4倍冷沉淀量的40?80IU/ml肝素 鈉溶解液內(nèi)，溶解過程中溶液的溫度應(yīng)控制在25?32°C，攪拌至沉淀完全溶解為止；
[0045] (2)、酸沉淀反應(yīng)：用0· 1?0· 5mol/L鹽酸將溶液的pH值矯正至6. 1?6. 5,攪拌 均勻，pH值矯正后，將溫度控制在20?30°C，持續(xù)攪拌20?40分鐘；
[0046] (3)、聚乙二醇沉淀：按最終聚乙二醇濃度為2. 5%?4. 5%(wt/v〇l)的比例加入 30%(wt/vol)聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完畢，溶液溫度應(yīng)控制在20?30°C，并持 續(xù)攪拌反應(yīng)20?40分鐘；
[0047] (4)、離心分離：采用離心機(如AS-26離心機）進行離心分離，流量控制在20? 50L/小時，離心過程中出液溫度應(yīng)控制在12?17°C ;
[0048] (5)、S/D滅活處理：使溶液最終內(nèi)含磷酸三丁酯0. 3%及聚山梨酯-801. 0%，攪拌均 勻，加溫至24?26°C，并持續(xù)保溫6小時；
[0049] (6)、二次聚乙二醇沉淀：按最終聚乙二醇濃度為10%?14%(wt/vol)的比例加入 30%(wt/vol)聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完畢，溶液溫度應(yīng)控制在10?20°C，并持 續(xù)攪拌反應(yīng)20?40分鐘；
[0050] (7)、二次離心分離：采用離心機(如AS-26離心機）進行離心分離，流量控制在 40?70L/小時，離心過程中出液溫度應(yīng)控制在7?12°C ;
[0051] (8)、沉淀洗滌：將離心后收集的沉淀稱重計量，按1 :15?1 :20的比例（即1份沉 淀加入15?20份1. 5?2. 5M甘氨酸洗滌液）充分溶解于1. 5?2. 5M甘氨酸洗滌液中， 攪拌30?60分鐘使沉淀得到充分溶解，將溶解后得到的溶液進行粉碎攪拌，使洗滌充分， 爾后于6?11°C溫度下以3000?5000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度離心10?25分鐘；
[0052] (9)、沉淀的溶解：最終沉淀充分溶解于10?20倍量的溶解液中，每10千克溶解 液內(nèi)含枸櫞酸三鈉4. 5?8. 5克及甘氨酸70?110克；
[0053] (10)、凍干
[0054] 低溫升華，設(shè)定值為_45°C，時間設(shè)定值為15小時；
[0055] 加熱升華，設(shè)定值為-15°C，時間設(shè)定值為10小時；
[0056] 加熱升華，設(shè)定值為0°C，時間設(shè)定值為10小時；
[0057] 加熱升華，設(shè)定值為10°C，時間設(shè)定值為8小時；
[0058] 加熱升華，設(shè)定值為31°C -33°C，時間設(shè)定值6小時；
[0059] (11)、干熱病毒滅活處理：人凝血因子W的沸水浴滅活溫度標(biāo)準(zhǔn)：98?KKTC，保 溫時間：30分鐘。
[0060] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0061] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0062] (1)采用國際先進的二次病毒滅活工藝對人凝血因子W進行病毒滅活，操作簡便、 整個過程時間短、能規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)工藝所用全部試劑均為常規(guī)試劑，價格便宜；
[0063] (2)不使用大多數(shù)廠家使用的氫氧化鋁，避免了最終產(chǎn)品中殘留鋁；
[0064] (3)用肝素鈉作為溶解液，提高了活性的回收率。
[0065] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。wt/vol是指質(zhì)量體積濃度，就 是每100ml溶液含的溶質(zhì)的質(zhì)量。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0066] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0067] 通用方法
[0068] 根據(jù)《中國藥典》2010年版或本領(lǐng)域慣用的方法測定效價、蛋白質(zhì)含、活性、活性收 率、比活性及澄明度。
[0069] 實施例1
[0070] 人凝血因子W的制備
[0071] (1)、冷沉淀的溶解：經(jīng)粉碎的冷沉淀倒入2倍冷沉淀量的60IU/ml肝素鈉溶解液 內(nèi)，溶解過程中溶液的溫度應(yīng)控制在28±2°C，攪拌至沉淀完全溶解為止；
[0072] (2)、酸沉淀反應(yīng)：用0. lmol/L鹽酸將溶液的pH值矯正至6. 2,攪拌均勻，pH值矯 正后，將溫度控制在25 土 1°C，持續(xù)攪拌30分鐘；
[0073] (3)、聚乙二醇沉淀：按最終聚乙二醇濃度為3%(wt/vol)的比例加入30%(wt/vol) 聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完畢，溶液溫度應(yīng)控制在25 ±1°C，持續(xù)攪拌30分鐘；
[0074] (4)、離心分離：采用離心機(如AS-26離心機）進行離心分離，流量控制在35L/小 時，離心過程中出液溫度應(yīng)控制在14±1°C ;
[0075] (5)、S/D滅活處理：使溶液最終內(nèi)含磷酸三丁酯0. 3%及聚山梨酯-801. 0%，攪拌均 勻，加溫至24?26°C，并持續(xù)保溫6小時；
[0076] (6)、第二次聚乙二醇沉淀：按最終聚乙二醇濃度為12%(wt/vol)的比例加入 30%(wt/v〇l)聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完畢，溶液溫度應(yīng)控制在15土1°C，持續(xù)攪 拌30分鐘；
[0077] (7)、二次離心分離：采用離心機(如AS-26離心機）進行離心分離，流量控制在 55L/小時，離心過程中出液溫度應(yīng)控制在9± 1°C ;
[0078] (8)、沉淀洗滌：將離心后收集的沉淀稱重計量，按1 :18的比例（即1重量份沉淀 加入18重量份2. 0M甘氨酸洗滌液）充分溶解于2. 0M甘氨酸洗滌液中，攪拌40分鐘使沉 淀得到充分溶解，將溶解后得到的溶液進行粉碎攪拌，使洗滌充分，爾后于8± 1°C溫度下以 4000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度離心18分鐘；
[0079] (9)、沉淀的溶解：最終沉淀充分溶解于15倍量的溶解液中，每10千克溶解液內(nèi)含 枸櫞酸三鈉6. 5克及甘氨酸90克；
[0080] (10)、凍干
[0081] 低溫升華，設(shè)定值為_45°C，時間設(shè)定值為15小時；
[0082] 加熱升華，設(shè)定值為_15°C，時間設(shè)定值為10小時；
[0083] 加熱升華，設(shè)定值為0°C，時間設(shè)定值為10小時；
[0084] 加熱升華，設(shè)定值為10°C，時間設(shè)定值為8小時；
[0085] 加熱升華，設(shè)定值為32°C，時間設(shè)定值6小時；
[0086] (11)、干熱病毒滅活處理：人凝血因子W的沸水浴滅活溫度標(biāo)準(zhǔn)：98?KKTC，保 溫時間：30分鐘。
[0087] 經(jīng)檢測，本實施例制得的人凝血因子W制品的各項性能指標(biāo)均符合《中國藥典》的 規(guī)定。
[0088] 實施例2
[0089] 冷沉淀溶解液的確定
[0090] 以現(xiàn)有冷沉淀為起始原料，一分為二，分別按相同比例加入60IU/ml肝素溶解液 和Tris-HCl溶解液，在30°C溶解攪拌lhr，采用0. lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6. 5,然后進行 聚乙二醇(加入30%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，加入后聚乙二醇的濃度為3. 5%(wt/vol))沉 淀，離心收集上清，并對上清中人凝血因子W的活性及比活性進行測定，結(jié)果如表1所示。
[0091] 表1活性、比活的比較（X n=8)
[0092]

【權(quán)利要求】
1. 一種人凝血因子w的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (a) 將冷沉淀用40-80IU/ml肝素鈉溶解液溶解，調(diào)節(jié)pH至6. 1-6. 5,溶液溫度維持在 20-35。。； (b) 將聚乙二醇溶液加入到步驟a)獲得的溶液中混合均勻，得到聚乙二醇濃度為 2. 5%-4. 5%(wt/v〇l)的混合溶液，所述混合溶液的溫度維持在20-30°C ; (c) 對步驟b)獲得的混合溶液進行離心，取上清液； (d) 將磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步驟c)獲得的上清液中混合均勻得到混合溶 液，并對所述混合溶液進行滅活； (e) 將聚乙二醇溶液加入到步驟d)獲得的溶液中混合均勻，得到聚乙二醇濃度為 10%-14%(wt/v〇l)的混合溶液，所述混合溶液的溫度維持在10-20°C ; (f) 對步驟e)獲得的混合溶液進行離心，收集沉淀； (g) 對步驟f)獲得的沉淀進行洗滌，所述洗滌是指將所述沉淀溶解于1. 5-2. 5M甘氨酸 洗滌液中，攪拌后進行離心； (h) 將步驟g)獲得的沉淀溶解于溶解液后冷凍干燥得到所述人凝血因子W，其中，每 10千克所述溶解液內(nèi)含枸櫞酸三鈉4. 5-8. 5克及甘氨酸70-110克。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝素鈉溶解液的重量是所述冷沉淀的 重量的1-4倍。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟c)中離心分離流量為20-50L/hr， 離心出液溫度為12-17°C。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d)獲得的混合溶液中磷酸三丁酯 的濃度為〇. 3vol%，聚山梨酯-80的濃度為1. Ovol%。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟f)中離心分離流量為40-70L/hr， 離心出液溫度為7-12°C。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷凍干燥的條件如下： 升溫至-45?-40°C，保持15-20小時； 升溫至-15?-10°C，保持10-15小時； 升溫至0?5°C，保持10-15小時； 升溫至10?15°C，保持8-10小時； 升溫至30°C?33°C，保持6-8小時。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對步驟h)獲得的所述人凝 血因子W進行滅活的步驟。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述滅活是指將所述人凝血因子W置于 98-100°C水浴中30min進行干熱病毒滅活處理。
【文檔編號】C07K14/755GK104250299SQ201310257462
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月25日
【發(fā)明者】鄭炎, 何毅明, 陳紅霞, 薛鐳, 費梅芳 申請人:上海生物制品研究所有限責(zé)任公司