雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白領(lǐng)域，特別涉及雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體，分泌α干擾素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述生物保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201242；其分泌的單克隆抗體可作為檢測(cè)α干擾素的診斷試劑；本雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體效價(jià)高；所制備的單克隆抗體，被HRP標(biāo)記后，可作為酶標(biāo)抗體；所述單克隆抗體可作為包被抗體；用制備的單克隆抗體制備的ELISA試劑盒，特異性高，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性，可大規(guī)模檢測(cè)，投入?。贿_(dá)到更加方便快捷檢測(cè)干擾素活性的目的；本單克隆抗體效價(jià)高可檢測(cè)中和抗體，并進(jìn)一步判斷患者對(duì)IFN治療無(wú)反應(yīng)或復(fù)發(fā)的可能行。
【專利說(shuō)明】雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白領(lǐng)域，特別涉及單克隆抗體的制備。
【背景技術(shù)】
[0002]a干擾素,具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用。a干擾素的免疫調(diào)節(jié)作用很強(qiáng)，還有增強(qiáng)免疫對(duì)病毒感染細(xì)胞的免疫殺傷活性。a干擾素還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和細(xì)胞毒活性。臨床治療劑量為300萬(wàn)~500萬(wàn)單位，每周3次，療程3~6個(gè)月。持久療效為25%~40%。常見的不良反應(yīng)為流感樣癥狀，如:發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)及肌肉酸痛等。聚乙二醇干擾素是相對(duì)于常規(guī)干擾素在藥代動(dòng)力學(xué)和用藥頻次上有很大改進(jìn)的一種干擾素，臨床研究結(jié)果顯示聚乙二醇干擾素在治療慢性乙型肝炎方面顯示出了令人鼓舞的效果。a干擾素至少有15個(gè)亞型，彼此之間有78-98%的同源性，其均能和I型受體結(jié)合。每種亞型之間，因其自身結(jié)構(gòu)的微小差異而導(dǎo)致各自的生物活性差異。
[0003]a干擾素的單抗在研究細(xì)胞因子的功能上有許多用途。如結(jié)構(gòu)與功能的研究，定性和定量的檢測(cè)，及純化工藝。a干擾素的高同源性為單抗的應(yīng)用提供了廣闊的空間，但是，a干擾素的高同源性也提高了制備雜交瘤細(xì)胞和單抗難度。
[0004]另外，傳統(tǒng)a干擾素活性檢測(cè)法為細(xì)胞病變抑制法，該方法耗時(shí)多，結(jié)果可重復(fù)性差。操作要求較高，投入較大，且具有生物危險(xiǎn)性。
[0005]另外，仍有部分患者對(duì)IFN治療無(wú)反應(yīng)或僅有短暫反應(yīng)后再次復(fù)發(fā)。原因之一與機(jī)體產(chǎn)生了抗干擾素的抗體，特別是能夠中和IFN生物學(xué)活性的中和抗體(NA)有關(guān)。國(guó)內(nèi)有關(guān)生物學(xué)方法測(cè)定IFN-a中和抗體的研究不多。
[0006]本發(fā)明是針對(duì)上述問題改進(jìn)得到的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供雜交瘤細(xì)胞，其能穩(wěn)定分泌a干擾素單克隆抗體。本發(fā)明的目的之二在于提供a干擾素單克隆抗體及其應(yīng)用，單克隆抗體效價(jià)高；本發(fā)明的目的之三在于提供診斷試劑盒及其應(yīng)用方法，其可以用于檢測(cè)a干擾素；該方法操作簡(jiǎn)單，適用于大批量的臨床檢測(cè)。
[0008]分泌a干擾素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述生物保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201242。
[0009]由所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的a干擾素單克隆抗體。
[0010]所述的a干擾素單克隆抗體制備檢測(cè)a干擾素的診斷試劑中的應(yīng)用。
[0011]含有酶標(biāo)所述的a干擾素單克隆抗體的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括:固相載體，用于包被所述固相載體的抗體，能與檢測(cè)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體，顯色底物，洗滌液和封閉液，所述用于包被所述固相載體的抗體為抗a干擾素多克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)a干擾素單克隆抗體。
[0012]進(jìn)一步，所述顯色底物為TMB，所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的a干擾素單克隆抗體。[0013]檢測(cè)a干擾素的方法，具體包括以下步驟:
[0014]A含有包被抗體的固相載體的制備
[0015]將抗a干擾素多克隆抗體包被至固相載體上，用洗滌液洗去雜質(zhì)；
[0016]B 孵育
[0017]將樣本添加至固相載體中，與所述a干擾素單克隆抗體孵育至充分結(jié)合，形成抗原-抗體結(jié)合物；將所述酶標(biāo)抗體與所述抗原-抗體結(jié)合物孵育至充分結(jié)合，洗去雜質(zhì)；
[0018]C 檢測(cè)
[0019]加入顯色底物，檢測(cè)光強(qiáng)度。
[0020]進(jìn)-步，所述的檢測(cè)a干擾素的方法，步驟A中，所述a干擾素多克隆抗體的包被濃度 2 ii g/mL。
[0021]進(jìn)一步，所述的檢測(cè)a干擾素的方法，步驟B中，所述樣本為血清作50倍體積稀釋；進(jìn)一步，所述的檢測(cè)a干擾素的方法，所述方法設(shè)置有同樣本平行的標(biāo)準(zhǔn)品組、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組；進(jìn)一步，所述的檢測(cè)a干擾素的方法，檢測(cè)OD 值。
[0022]含有所述的a干擾素單克隆抗體的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括:固相載體，用于包被所述固相載體的抗體，能與檢測(cè)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體，顯色底物，洗滌液和封閉液，所述用于包被所述固相載體的抗體為所述的單克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)a干擾素多克隆抗體。
[0023]兩種抗體的聯(lián)合應(yīng)用，抗a干擾素多克隆抗體作和酶標(biāo)的所述a干擾素單克隆抗體聯(lián)合在檢測(cè)a干擾素的間接 競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于:1)本雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體效價(jià)高；2)所制備的單克隆抗體，被HRP標(biāo)記后，可作為酶標(biāo)抗體；3)所述單克隆抗體可作為包被抗體；4)用制備的單克隆抗體制備的ELISA試劑盒，特異性高，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性，可大規(guī)模檢測(cè)，投入小。達(dá)到更加方便快捷檢測(cè)干擾素活性的目的。5)本單克隆抗體效價(jià)高可檢測(cè)中和抗體，并進(jìn)一步判斷患者對(duì)IFN治療無(wú)反應(yīng)或復(fù)發(fā)的可能行。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為單克隆抗體能特異性抑制干擾素受體及信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵分子STAT1，JAK3 的磷酸化 WESTERN-B0LT 圖。
[0026]本發(fā)明涉及的雜交瘤細(xì)胞，送于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，本保藏中心保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201242 ;培養(yǎng)物名稱為雜交瘤細(xì)胞2D8，于2012年3月29日送往保藏中心，2012年11月13日檢測(cè)完畢，結(jié)果為存活。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如分子克隆:實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(沈關(guān)心周汝麟主編)中所述的條件或制造商建議的條件進(jìn)行或配置，未注明來(lái)源的產(chǎn)品均可通過市場(chǎng)途徑獲得。
[0028]實(shí)施例1表位肽及其衍生物的制備[0029]所述的B細(xì)胞表位肽的序列來(lái)自生物信息學(xué)分析結(jié)果，綜合分析a干擾素的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、可及性及柔韌性，對(duì)各區(qū)段進(jìn)行分析評(píng)分，選取得分高的區(qū)域作為B細(xì)胞表位區(qū)域。具體的,利用Chou & Fasman預(yù)測(cè)0轉(zhuǎn)角、Emini法預(yù)測(cè)抗原表面可及性、Karplus& Schulz法預(yù)測(cè)蛋白柔韌性、Kolaskar & Tongaonkar進(jìn)行蛋白質(zhì)抗原性分析、Parker法進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水分析和Bepipred進(jìn)行線性抗原表位預(yù)測(cè)等,綜合分析獲取的技術(shù)參數(shù)，獲得人a干擾素中潛在的B細(xì)胞表位肽氨基酸序列。把a(bǔ)干擾素的B細(xì)胞表位肽進(jìn)行化學(xué)合成。
[0030]實(shí)施例2抗a干擾素B細(xì)胞表位肽免疫Balb/c小鼠及血清效價(jià)測(cè)定
[0031]將實(shí)施例1化學(xué)合成的B細(xì)胞表位肽抗原從_80°C冰箱取出作免疫原，溶解后過濾。選取6周齡、體重約20g的雌性Balb/c小鼠免疫?？乖榛x用雙注射器互推法。首次免疫時(shí)，將a干擾素B細(xì)胞表位肽衍生物抗原與等體積的弗氏完全佐劑乳化混合，得抗原混合物，每只小鼠按100 u g的量皮內(nèi)多點(diǎn)加腹腔注射。第14和第28天分別進(jìn)行第2次第3次免疫，佐劑改用不完全弗氏佐劑，抗原量、注射體積和途徑不變，第3次免疫后間接ELISA法測(cè)定效價(jià)。融合前3天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐劑的100μg表位肽衍生物，3天后細(xì)胞融合。第3次免疫后10天從小鼠尾靜脈取血檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
[0032]效價(jià)的測(cè)定如下:
[0033]將新購(gòu)酶標(biāo)板用雙蒸水浸泡過夜，晾干后備用；用包被液(0.05mol/L碳酸鈉緩沖液:0.16g Na2CO3,0.293g NaHCO3,0.02g NaN3，加去離子水溶解定容100ml)。將商品化重組a干擾素(市售，美國(guó)R&D Systems)稀釋為最佳工作濃度5 ii g/mL,每孔加100 ii L抗原稀釋液，37°C溫育I小時(shí)后，以膠帶封口，于4°C過夜，倒盡板孔中液體，吸干孔內(nèi)殘余反應(yīng)液，加滿洗滌液過一次，再注滿洗滌液緩緩晃動(dòng)2min，傾去，反復(fù)五次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。自然干燥后以膠帶封口，此為重組a干擾素包被的酶標(biāo)板，加封閉液300iU，37°C孵育1.5小時(shí)，洗滌5次；采血及稀釋血清:捏住鼠尾，75%酒精消毒后用剪刀在尾靜脈剪一缺口，取血20 u L, 2000rpm離心30min，取上清I y L加入999 y L抗體稀釋液混勻，并進(jìn)行體積倍比稀釋，從1: 100至1: 3200，將稀釋的被檢血清每孔加入100 yL，同時(shí)取小鼠免疫前血清1: 100稀釋做陰性對(duì)照，抗體稀釋液做空白對(duì)照。37°C孵育I~1.5小時(shí)，洗滌5次。將辣根過氧化物酶羊抗小鼠IgG (上海億欣生物科技有限公司)稀釋到1: 10000，每孔加100μ L，37°C孵育1.5小時(shí)，洗滌5次；加鄰苯二胺溶液100 y L/孔，室溫暗處15分鐘，每孔加終止液100 u L觀察結(jié)果，OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄492nm讀數(shù)，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值大于陰性對(duì)照OD值的5倍，可用于細(xì)胞融合。
[0034]實(shí)施例3小鼠脾細(xì)胞懸液和SP2/0細(xì)胞懸液的制備
[0035]取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血處死，眼血離心后收集血清作ELISA的陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌操作取出脾臟，放入盛有10mL不完全培養(yǎng)基的玻璃皿中，洗滌，小心剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織和脂肪組織，換一玻璃皿，將脾臟撈出，置于200目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨，不時(shí)用不完全培養(yǎng)基沖洗，使脾細(xì)胞穿過網(wǎng)孔進(jìn)入溶液中，將脾細(xì)胞移至IOmL玻璃離心管中，800rpm水平離心10min，去上清。同法用不完全培養(yǎng)基10mL洗滌細(xì)胞I次，離心收集沉淀的細(xì)胞，將細(xì)胞用10mL不完全培養(yǎng)基重懸混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)約為1 X108個(gè)細(xì)胞。將SP2/0細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37°C水浴中，不斷搖晃，直至細(xì)胞溶液完全溶解，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到IOmL離心管中，800rpm水平離心lOmin，棄上清，IOmL完全培養(yǎng)液重懸沉淀，把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50mL培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后用含8-AG的選擇培養(yǎng)基篩選細(xì)胞一周；融合前2天，將I瓶細(xì)胞傳至4瓶，則融合當(dāng)天細(xì)胞正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力正好，細(xì)胞大小均勻，圓而透亮，融合當(dāng)天，用彎頭滴管將SP2/0細(xì)胞從管壁上輕輕吹下，收集于離心管中，離心，棄上清，沉淀用不完全培養(yǎng)基洗滌后，IOmL不完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，約為5.5X107。
[0036]取一只未免疫的Balb/c小鼠，摘眼球放血處死，體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡消毒5min,剪開小鼠皮膚，用鑷子提起腹膜，用剪刀剪一小口，彎頭滴管吸取預(yù)冷的不完全培養(yǎng)基沖洗腹腔，將洗液吸至50mL離心管中。同法用不完全培養(yǎng)基沖洗腹腔3次，收集洗液，室溫下1000rpm水平離心IOmin,去上清，IOmL不完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。
[0037]融合前將PEG1500置于37 °C培養(yǎng)箱中預(yù)溫，吸取IX IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞懸液和I X IO8個(gè)脾臟B淋巴細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)1: 10)至一個(gè)50mL離心管中，補(bǔ)加30mL不完全培養(yǎng)基，充分混勻，1000rpm離心lOmin，棄上清，輕彈管底，使細(xì)胞團(tuán)松散成糊狀，將離心管37°C水浴，用滴管吸取0.8ml預(yù)溫的50% PEG1500溶液，在離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細(xì)胞中，邊加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，在Imin左右加完，然后靜置90s，逐滴加入37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)基30ml終止融合，3min之內(nèi)加完，速度先慢后快，動(dòng)作輕柔，將離心管在37°C培養(yǎng)箱中靜置5min，取出離心管，1000rpm離心5min，棄去上清，加入IOmL HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打，混勻，將融合細(xì)胞接種至已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按IOOii L/孔，每塊培養(yǎng)板留6孔接種SP2/0細(xì)胞，作為HAT選擇的陰性對(duì)照，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038]融合后第5天即可在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基100 y L，第14天換HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。融合后10~14天，待細(xì)胞長(zhǎng)到滿培養(yǎng)孔的1/2孔底時(shí)，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清，篩選陽(yáng)性克??；將商品化重組a干擾素(市售，美國(guó)R&D Systems)包被酶標(biāo)板(0.5 ii g/孔),4°C過夜,洗漆緩沖液洗漆5次,每次5min,拍干液體，每孔加入封閉液300iU，37°C孵育2h，加入IOOii L細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性對(duì)照選小鼠的免疫血清，陰性對(duì)照選SP2/0培上清，空白對(duì)照用洗滌液，37°C孵育2h ;洗滌酶標(biāo)板:每孔加A IOOuL效價(jià)為1: 10000 (體積)稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IG抗體，37°C孵育2h ;洗漆，拍干液體，加新鮮配制的鄰苯二胺溶液100 u L/孔，室溫暗處反應(yīng)10~15分鐘，加終止液每孔100 U L終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值。
[0039]結(jié)果為以a干擾素的表位肽段為抗原，免疫BALB/C小鼠，融合成功后，經(jīng)克隆化和ELISA篩選后，得到分泌a干擾素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)達(dá)到1: 51200。這株雜交瘤細(xì)胞經(jīng)數(shù)次凍存，體外傳代培養(yǎng)3個(gè)月以上仍能穩(wěn)定分泌抗體。
[0040]如上所示的篩選出陽(yáng)性克隆后，立即采用有限稀釋法將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，制備飼養(yǎng)細(xì)胞，用IOmL不完全培養(yǎng)基重懸，收集陽(yáng)性克隆細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用不完全培養(yǎng)基將陽(yáng)性克隆細(xì)胞稀釋到100個(gè)/20mL，取一塊預(yù)先已加有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入200 u L細(xì)胞懸液，將剩下的陽(yáng)性克隆細(xì) 胞轉(zhuǎn)移到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞液氮凍存，同時(shí)將培養(yǎng)板在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第3天后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，10天后用ELISA法檢測(cè)效價(jià)，并將最強(qiáng)的陽(yáng)性克隆再次克隆化，直至細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)100%，即可定株；測(cè)取定株的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價(jià)后再將定株的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),并送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO:C201242，其可穩(wěn)定分泌所述單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞的凍存要求細(xì)胞每支安瓿含IXlO6以上，采用專用細(xì)胞凍存液保存；細(xì)胞復(fù)蘇是在Imin內(nèi)于37°C水浴中快速使凍存的細(xì)胞解凍，并將細(xì)胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次后，移入已制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)；細(xì)胞傳代在細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)兩天左右后，細(xì)胞開始快速分裂生長(zhǎng)，隔天1: 4比例傳代。傳代時(shí)不需要胰酶，在傳代過程中得到的上清培養(yǎng)液可以與最后抗體收集液的一起進(jìn)行抗體純化。抗體的純選用HiTrap rProtein A HP柱接入AKTA Explorer純化抗體，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度大于95%。純化的抗體用間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)達(dá)1: 128000，初步說(shuō)明獲得的單克隆抗體對(duì)a干擾素分子有較高結(jié)合能力，分裝冷凍保存，待后續(xù)使用。[0041]應(yīng)用商品化重組a干擾素(市售,美國(guó)R&D Systems)作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品,通過免疫印跡方法鑒定所制備單抗的有效性，結(jié)果顯示抗a干擾素單抗結(jié)合a干擾素處可見清洗條帶。本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)步驟詳見《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(沈關(guān)心周汝麟主編)。
[0042]實(shí)施例4中和抗體的檢測(cè)
[0043]50例慢性病毒性肝炎患者，a IFN治療包括使用a IFN2a25例，a IFN2b25例。治療劑量均為3mU/次，每周3次，肌肉注射。療程6個(gè)月，隨訪6個(gè)月。治療前及治療開始后每月末定期采血，直到隨訪結(jié)束。并以20名健康人血清作對(duì)照。測(cè)定細(xì)胞采用人羊膜Wish細(xì)胞株，攻擊病毒選用水泡性口炎病毒(VSV)。a IFN2a (Referon):瑞士 Roch公司生產(chǎn)；a IFN2b (Intron A):美國(guó) Scheing-Plough 公司生產(chǎn)。
[0044]一傳統(tǒng)檢測(cè)方法
[0045]測(cè)定干擾素中和抗體采用抗病毒中和生物測(cè)定法，以VSV攻擊Wish細(xì)胞，觀察干擾素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞病變程度分為0~4級(jí)，以細(xì)胞出現(xiàn)3級(jí)或3級(jí)以上病變?yōu)殛?yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，血清最高稀釋倍數(shù)作為其效價(jià)。并設(shè)置有關(guān)對(duì)照。對(duì)治療血清予以相應(yīng)亞型的a IFN進(jìn)行中和試驗(yàn)，以測(cè)定中和抗體，對(duì)照組則以上述2種亞型的a IFN進(jìn)行中和試驗(yàn)以測(cè)定中和抗體。對(duì)結(jié)果采用四格表的X2檢驗(yàn)及確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
[0046]干擾素中和抗體的產(chǎn)生率，對(duì)照組20名健康人中，中和抗體全部陰性。治療組50例患者中，共有8例NA陽(yáng)性，總檢出率為16%。
[0047]二本發(fā)明的方法
[0048]檢測(cè)抗INF- a中和抗體試劑盒的制備:采用競(jìng)爭(zhēng)法原理進(jìn)行試劑盒的制備。具體方法為:調(diào)節(jié)抗INF- a的所述多克隆抗體濃度2 u g/ml進(jìn)行酶標(biāo)板(聚苯乙烯)包被，用10%小牛血清進(jìn)行封閉，并用HRP標(biāo)記的抗INF-a生物學(xué)活性的單克隆抗體(所述雜交瘤細(xì)胞分泌)作為檢測(cè)標(biāo)志物，采用一步法進(jìn)行檢測(cè)；所述HRP標(biāo)記的酶標(biāo)a干擾素多克隆抗體稀釋度為1: 10000條件下性價(jià)比最高。
[0049]干擾素中和抗體的產(chǎn)生率，對(duì)照組20名健康人中，中和抗體全部陰性。治療組50例患者中，共有8例NA陽(yáng)性，總檢出率為16%。
[0050]實(shí)施例5信號(hào)傳導(dǎo)通路
[0051]在得到保藏號(hào)為CCTCC NO:C201242的雜交瘤細(xì)胞株后，將其分泌的單克隆抗體能特異性抑制干擾素受體及信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵分子STAT1，JAK3的磷酸化作用，進(jìn)行干擾信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)驗(yàn)，通過WB實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定其生物學(xué)特異性。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，圖1-A為關(guān)鍵分子STATl的Western-Blot圖，條帶“Ab”人羊膜細(xì)胞經(jīng)濃度為100ng/mL的a -干擾素和IOii g/mL的單克隆抗體誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物，條帶為人羊膜細(xì)胞僅經(jīng)濃度為100ng/mL的a -干擾素誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物；圖1-B為關(guān)鍵分子JAK3的Western-Blot圖，條帶“Ab”人羊膜細(xì)胞經(jīng)濃度為lOOng/mL的a -干擾素和10 u g/mL的單克隆抗體誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物，條帶為人羊膜細(xì)胞僅經(jīng)濃度為lOOng/mL的a-干擾素誘導(dǎo)后的裂解產(chǎn)物。[0052]實(shí)施例6 a干擾素單克隆抗體作為包被抗體的試劑盒
[0053]含有所述的a干擾素單克隆抗體的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括:固相載體，用于包被所述固相載體的抗體，能與檢測(cè)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體，顯色底物，洗滌液和封閉液，所述用于包被所述固相載體的抗體為所述的單克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)a干擾素多克隆抗體。
[0054]用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋所述a干擾素單克隆抗體包被酶標(biāo)板，IOOiil/孔，4°C 過夜，用洗液(0.05% PBST，pH7.4)洗 3 次；5% BSA 封閉，200 iil/孔，37°C孵育2h后洗3次；加入商品化a干擾素抗原和待測(cè)血清樣本，100 iU/孔，標(biāo)準(zhǔn)品做倍比稀釋。37°C孵育Ih后洗3次；加入抗a干擾素多抗，IOOy L/孔，37°C孵育Ih后洗3次；再加入HRP標(biāo)記的a干擾素多克隆抗體(上海億欣生物科技有限公司)，37°C孵育45min后用洗滌液(0.1% PBST，pH7.4)洗 6 次；加 TMB 底物，100 U I/ 孔，37°C顯色 IOmin,以 2mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)板450nm處測(cè)吸光度值(OD45tl)。
[0055]用棋盤滴定法確定各抗體的最佳工作濃度，將所述a干擾素單克隆抗體按照I: 2000、I: 1000OU: 50000稀釋3個(gè)濃度包被酶標(biāo)板，陽(yáng)性對(duì)照(0.5 ii g/ml市售重組a干擾素為標(biāo)準(zhǔn)品)和陰性對(duì)照(PBS)為樣品，多抗按1: 2000、1: 5000,1: 10000稀釋3個(gè)濃度，HRP標(biāo)記的a干擾素多克隆抗體按實(shí)際說(shuō)明書推薦稀釋度，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟操作，確定抗體的最佳工作濃度。然后將HRP標(biāo)記的a干擾素多克隆抗體倍比稀釋，再次做棋盤滴定。陽(yáng)性對(duì)照OD45tl值在1.5左右，陰性對(duì)照OD45tl值小于0.1的條件下為最佳，初次結(jié)果不理想，可進(jìn)一步縮小或擴(kuò)大稀釋度以取得抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。結(jié)果:在捕獲抗體(a干擾素單抗)稀釋度為1: 10000、和所述HRP標(biāo)記的酶標(biāo)a干擾素多克隆抗體稀釋度為1: 5000條件下該ELISA檢測(cè)方法的性價(jià)比最高。
[0056]在上述優(yōu)化條件下，對(duì)20例以上應(yīng)用INF- a治療的臨床標(biāo)本(血清)，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。
[0057]用不同方法(生物學(xué)活性抗體檢測(cè)法與細(xì)胞病變抑制法)檢測(cè)INF- a生物學(xué)活性及其中和抗體，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析兩種方法的優(yōu)越性與可靠性。
[0058]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.分泌抗人a干擾素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于:所述生物保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201242o
2.由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的a干擾素單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的a干擾素單克隆抗體制備檢測(cè)a干擾素的診斷試劑中的應(yīng)用。
4.含有酶標(biāo)權(quán)利要求2所述的a干擾素單克隆抗體的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括:固相載體，用于包被所述固相載體的抗體，能與檢測(cè)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體，顯色底物，洗滌液和封閉液，其特征在于:所述用于包被所述固相載體的抗體為抗a干擾素多克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)a干擾素單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的診斷試劑盒，其特征在于:所述顯色底物為TMB，所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的a干擾素單克隆抗體。
6.檢測(cè)a干擾素的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: A含有包被抗體的固相載體的制備 將抗a干擾素多克隆抗體包被至固相載體上，用洗滌液洗去雜質(zhì)； B孵育 將樣本添加至固相載體中，與所述a干擾素單克隆抗體孵育至充分結(jié)合，形成抗原-抗體結(jié)合物；將所述酶標(biāo)抗體與所述抗原-抗體結(jié)合物孵育至充分結(jié)合，洗去雜質(zhì)； C檢測(cè) 加入顯色底物，檢測(cè)光強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)a干擾素的方法，其特征在于:步驟A中，所述a干擾素多克隆抗體的包被濃度≤1g/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)a干擾素的方法，其特征在于:步驟B中，所述樣本為血清作50倍體積稀釋。
9.含有權(quán)利要求2所述的a干擾素單克隆抗體的診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包括:固相載體，用于包被所述固相載體的抗體，能與檢測(cè)抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體，顯色底物，洗滌液和封閉液，其特征在于:所述用于包被所述固相載體的抗體為權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，所述酶標(biāo)抗體為酶標(biāo)a干擾素多克隆抗體。
10.兩種抗體的聯(lián)合應(yīng)用，其特征在于:抗a干擾素多克隆抗體作和酶標(biāo)的權(quán)利要求2所述a干擾素單克隆抗體聯(lián)合在檢測(cè)a干擾素的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/24GK103484434SQ201310270514
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日
【發(fā)明者】朱艮苗 申請(qǐng)人:朱艮苗