蛋白質(zhì)分離純化的方法及回收裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)分離純化的方法及回收裝置，包括等電聚焦電泳和SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，在等電聚焦電泳中不使用還原劑，在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳中凝膠用含有SDS的緩沖液處理，SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0-1%。蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置包括蛋白質(zhì)洗脫板和分子半透膜，蛋白質(zhì)洗脫板底部通過噴膠粘有分子半透膜。本發(fā)明能夠有效地分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物為單一的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提高了蛋白質(zhì)的分離和純化效率并且保持了蛋白質(zhì)的功能或酶活性，操作簡(jiǎn)便。
【專利說明】蛋白質(zhì)分離純化的方法及回收裝置

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)分離純化的方法及回收裝 置。

【背景技術(shù)】
[0002] 在蛋白質(zhì)的生物化學(xué)研究中，電泳可以根據(jù)不同的電荷差異(在沒有變性的凝膠 電泳中）或者蛋白質(zhì)的分子量的大小(在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）將蛋白混合 物分離而成為不同蛋白條帶。在一維凝膠電泳中，變性凝膠電泳的主要用途是從凝膠中檢 測(cè)和定位蛋白質(zhì)，同時(shí)也可以用來從混合物中進(jìn)一步分離純化蛋白質(zhì)。一維凝膠電泳中使 用最廣泛的是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)。在典型的SDS-PAGE中，樣 品用還原劑β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT)和高濃度的SDS(2%)進(jìn)行處理。還原劑可以 使由二硫鍵連接起來的蛋白質(zhì)分解，SDS將結(jié)合到蛋白質(zhì)基團(tuán)上。經(jīng)過這些處理，蛋白質(zhì)將 按照其分子量在電場(chǎng)中移動(dòng)。同非變性凝膠電泳相比，SDS-PAGE有更高的分辨率，更重要的 是提供了一個(gè)可靠的方法來判斷蛋白質(zhì)分子量的大小。雖然SDS-PAGE和非變性凝膠電泳 已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于生物化學(xué)研究，但是它們有幾個(gè)不同點(diǎn)。首先，非變性凝膠電泳分辨率比 較低，從而限制了它的使用。其次，在收集活性蛋白質(zhì)和研究蛋白質(zhì)的催化性能的試驗(yàn)中， 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)都被固定到聚丙烯酰胺凝膠中，所以蛋白質(zhì)在凝膠中的催化效率不如在溶液狀 態(tài)下高。第三，因?yàn)樵S多蛋白質(zhì)在通常條件下是以聚合體的形式存在，所以在非變性凝膠電 泳中很難評(píng)價(jià)單個(gè)蛋白質(zhì)的性能。換句話說，SDS-PAGE提供了一個(gè)更好的純化蛋白質(zhì)的方 法，但是如果需要觀察離散的蛋白條帶，電泳過程仍然僅限于部分純化蛋白質(zhì)的制備。如果 從微生物、植物或動(dòng)物中制備一種蛋白質(zhì)，那么樣品中就有成千上萬種蛋白質(zhì)，所以幾乎不 可能將如此多的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離成離散的條帶并純化出來。此外，在SDS-PAGE 中蛋白質(zhì)樣品的處理第一步通常是使蛋白質(zhì)變性。樣品的處理過程通常是添加高濃度的還 原劑和去污劑，并在l〇〇°C下水浴5分鐘。大多數(shù)蛋白質(zhì)在這些條件下會(huì)變性，這樣會(huì)使我 們感興趣的蛋白質(zhì)的功能鑒定變的非常困難。因此非變性凝膠電泳和SDS-PAGE都不適合 從蛋白質(zhì)混合物中直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化和功能鑒定。
[0003] 二維凝膠電泳（Two Dimensional Gel Electrophoresis, 2-DE)起源于上世紀(jì) 70 年代。在二維凝膠電泳中，蛋白質(zhì)從兩個(gè)維度進(jìn)行分離。在第一個(gè)維度蛋白質(zhì)按照其等電點(diǎn) 分離。蛋白質(zhì)混合物在電場(chǎng)中被施加一個(gè)pH梯度，蛋白質(zhì)移動(dòng)到與它們電荷相符的位置， 此處它們的電荷為零(等電點(diǎn));在第二個(gè)維度，蛋白質(zhì)按照它們的分子量進(jìn)行分離。通常的 一維SDS-PAGE的過程與此相似。因?yàn)榈谝痪S度和第二維度的分離參數(shù)彼此不同，二維電泳 相對(duì)于一維電泳在分離蛋白質(zhì)方面有較高的分辨率。雖然利用二維電泳技術(shù)不能從細(xì)胞粗 提液中分離所有蛋白質(zhì)，但是二維電泳已經(jīng)是眾所周知的最有效、最簡(jiǎn)單的分離技術(shù)。經(jīng)過 多年的改進(jìn)，二維電泳已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)在分析復(fù)雜生物系統(tǒng)方面強(qiáng)有力的工具，尤其是 當(dāng)每個(gè)凝膠的二維電泳的分辨率超過10000種蛋白質(zhì)時(shí)它的優(yōu)勢(shì)更為明顯。二維電泳另一 個(gè)主要的進(jìn)步是固定化PH梯度凝膠的發(fā)明，這個(gè)固定化pH梯度凝膠提供了一種高分辨率 的分離方法，更重要的是固定化pH梯度凝膠具有高度可重復(fù)性。當(dāng)前二維電泳分離的蛋白 質(zhì)可以通過微量測(cè)序、質(zhì)譜或者二者結(jié)合的方式對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。二維電泳在生命科學(xué) 研究中的重要性表現(xiàn)為以下幾個(gè)方面。首先，它提供了一個(gè)在確定的生理階段和條件下的 生物體相對(duì)完整的生物化學(xué)圖像，特別是基因表達(dá)相對(duì)比較高的蛋白質(zhì)都能在二維電泳中 進(jìn)行分析。這在系統(tǒng)生物學(xué)研究中非常有用，因?yàn)槲覀冎阑虮磉_(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)沒有明 顯的關(guān)聯(lián)，而蛋白質(zhì)的表達(dá)更能反映生物體內(nèi)的生物化學(xué)狀態(tài)。產(chǎn)生這種基因表達(dá)和蛋白 質(zhì)表達(dá)沒有明顯關(guān)聯(lián)現(xiàn)象的原因是復(fù)雜的，但其中有許多明顯的原因如mRNA轉(zhuǎn)錄、個(gè)體基 因啟動(dòng)子的強(qiáng)度和蛋白質(zhì)合成的相對(duì)穩(wěn)定性等。其次，二維電泳有助于對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修 飾的系統(tǒng)研究。蛋白質(zhì)的修飾是對(duì)生物體基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的補(bǔ)充，而且這些蛋白質(zhì)是直接參 與保證生物體正確運(yùn)轉(zhuǎn)的體內(nèi)組分。
[0004] "蛋白質(zhì)組學(xué)"這個(gè)詞表示對(duì)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的系統(tǒng)研究，因此蛋白質(zhì)組 學(xué)是系統(tǒng)研究生物體蛋白質(zhì)的科學(xué)。一個(gè)生物體只有一個(gè)基因組，但是可能有很多種蛋白 質(zhì)組，因?yàn)榛蚪M在不同條件下表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量和種類不同。在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，二 維電泳是一個(gè)非常重要的工具。典型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究包括從生物樣本中進(jìn)行蛋白質(zhì)的提 取，通過二維電泳分離展示蛋白質(zhì)組，通過質(zhì)譜、順序測(cè)定或二者聯(lián)用來對(duì)感興趣的蛋白質(zhì) 進(jìn)行系統(tǒng)研究。從生物化學(xué)的觀點(diǎn)來看，目前應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的二維電泳技術(shù)仍然 不能滿足功能研究的要求，也就是現(xiàn)在的二維電泳技術(shù)還不可能監(jiān)測(cè)到構(gòu)成蛋白質(zhì)組的每 種蛋白質(zhì)的生物活性。
[0005] 二維電泳后蛋白質(zhì)研究的主要挑戰(zhàn)之一是從聚丙烯酰胺凝膠中獲取蛋白質(zhì)。因?yàn)?直接從聚丙烯酰胺凝膠中測(cè)定蛋白質(zhì)催化活性效率很低，所以從聚丙烯酰胺凝膠中獲取蛋 白質(zhì)特別重要。據(jù)記載超聲波法被用于從聚丙烯酰胺凝膠中回收蛋白質(zhì)。但是沒有報(bào)道指 出可以用超聲波法從二維電泳凝膠中直接回收活性蛋白質(zhì)。
[0006] 從二維電泳凝膠中獲取蛋白質(zhì)廣泛使用的方法是電洗脫法（Electroelution)。一 種Bio-Rad制造的叫做Rotofor Cell的裝置可以從等電聚焦位置獲得活性蛋白質(zhì)。這個(gè)裝 置使用等電聚焦法將蛋白質(zhì)分離到不同的位置，然后進(jìn)行回收。這個(gè)裝置的缺點(diǎn)之一是只 能應(yīng)用于一維電泳凝膠，也就是等電點(diǎn)凝膠，相對(duì)于二維電泳凝膠分辨率將大大降低。這個(gè) 裝置的另一個(gè)缺點(diǎn)是用試管來收集洗脫液，因?yàn)槭占囊后w體積比較大，這使裝置的分辨 率變的非常有限。目前市場(chǎng)上電洗脫的第二種裝置是Bio-Rad生產(chǎn)的Whole Gel Eluter。 同樣的，這個(gè)裝置只能應(yīng)用于一維電泳，裝置的分辨率也不夠好，所用試管數(shù)量也非常有 限。第三種裝置是Biometra公司生產(chǎn)的Blotelutor電洗脫系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)用半干法從 二維電泳凝膠中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到576孔平板中，該平板用透析膜和6毫米厚的12. 5%的聚 丙烯酰胺凝膠組合在平板的底部，沒有數(shù)據(jù)來證明這個(gè)裝置的回收效率。該平板只有60% 的回收區(qū)域是有效的，這意味著在這個(gè)回收過程中二維電泳凝膠中40%的蛋白質(zhì)沒有被回 收。更重要的是在一個(gè)樣品中存在成百乃至上千種蛋白質(zhì)，平板的分辨率無法為從粗提液 中獲得純的蛋白質(zhì)提供足夠的機(jī)會(huì)，而蛋白質(zhì)組學(xué)研究和蛋白質(zhì)純化的二維電泳的核心又 是高分辨率。這個(gè)裝置的另一個(gè)問題是透析膜和聚丙烯酰胺凝膠的平板底部的密封，在此 裝置用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移和回收過程中蛋白質(zhì)是否擴(kuò)散不清楚，假如研究需要的是純化的蛋白 質(zhì)，這些參數(shù)就很要緊。這個(gè)裝置最后的問題是不能適用于比較復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，如果 有必要從樣本中分離出幾百種蛋白質(zhì)并測(cè)試樣品中每一種蛋白質(zhì)的生物活性，得到純化的 蛋白質(zhì)將非常重要，生產(chǎn)商已經(jīng)終止了這類裝置的生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)分離純化的方法，能在保持蛋白質(zhì)活性的同時(shí)實(shí) 現(xiàn)二維凝膠電泳的高分辨率；同時(shí)提供一種蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，能將復(fù)雜的蛋白 質(zhì)混合物分離成單一的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)分離純化的方法，包括等電聚焦電泳和SDS -聚丙烯酰胺凝 膠電泳，在等電聚焦電泳中不使用還原劑，在SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳中凝膠用含有SDS 的緩沖液處理，SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0-1%，優(yōu)選SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%。
[0009] 本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)分離純化的方法，具體步驟如下：
[0010] (1)等電聚焦電泳：將蛋白質(zhì)樣品加到等電聚焦條帶中，等電聚焦過夜，凝膠不使 用還原劑處理；
[0011] (2) SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳：用含有SDS的緩沖液處理步驟（1)所得凝膠，將 處理后的凝膠放在濃縮膠上，蛋白質(zhì)在濃縮膠上被濃縮后進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離；
[0012] (3)先將含有分離的蛋白質(zhì)的凝膠置于蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置上，再將蛋白 質(zhì)分離純化的回收裝置放在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移裝置里進(jìn)行蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，最后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分 析平板中進(jìn)行分析。
[0013] 所述的還原劑是β -巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT)中的一種。
[0014] 所述的含有SDS的緩沖液為每升溶液含有：
[0015] Tris 3. 03 克；
[0016] Glycine 14. 4 克；
[0017] SDS 0-10 克；
[0018] 剩余雙蒸水補(bǔ)足。
[0019] 所述的含有SDS的緩沖液優(yōu)選為每升溶液含有：
[0020] Tris 3. 03 克；
[0021] Glycine 14. 4 克；
[0022] SDS 1 克；
[0023] 剩余雙蒸水補(bǔ)足。
[0024] 所述的濃縮膠中聚丙烯酰胺濃度為6%，配方如下：
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白質(zhì)分離純化的方法，包括等電聚焦電泳和SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳，其 特征在于在等電聚焦電泳中不使用還原劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分離純化的方法，其特征在于在SDS -聚丙烯酰胺凝 膠電泳中凝膠用含有SDS的緩沖液處理，SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0-1%，優(yōu)選SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0· 1%。
3. -種權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于包括蛋白質(zhì)洗脫板 和分子半透膜，蛋白質(zhì)洗脫板底部通過噴膠粘有分子半透膜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于所述的蛋白質(zhì)洗脫 板的長(zhǎng)度為50-350毫米，寬度為40-300毫米，厚度為1-8毫米。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于所述的蛋白質(zhì)洗脫 板上有96-10000個(gè)孔，優(yōu)選1536個(gè)孔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于所述的蛋白質(zhì)洗脫 板由4塊24-2500孔微平板組成，優(yōu)選由4塊384孔微平板組成。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于所述的孔為正方形 孔、圓形孔或長(zhǎng)方形孔中的一種，優(yōu)選正方形孔；正方形孔的邊長(zhǎng)為2-8毫米，圓形孔的直 徑為2-8毫米，長(zhǎng)方形孔的長(zhǎng)和寬分別為2-8毫米，孔與孔的間距為0. 2-0. 9毫米。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于所述的蛋白質(zhì)洗脫 板的材料為聚丙烯、聚乙烯或聚苯乙烯中的一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置的方法，其特征在于所述的分子 半透膜為聚酰胺半透膜、乙酸纖維素半透膜、聚砜樹脂半透膜或聚醚砜樹脂半透膜中的一 種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)分離純化的回收裝置，其特征在于所述的噴膠為美 國 3M 公司的 Super77、Super74、Super80 或 Super90 中的一種。
【文檔編號(hào)】C07K1/28GK104292296SQ201310296231
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】王星 申請(qǐng)人:淄博云橋生物技術(shù)有限公司