表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA，序列如SEQ：1。該DNA表達(dá)的抗菌肽及其衍生物可用于水產(chǎn)病害防治，具有廣泛用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】表達(dá)新型defens in抗菌肽的DNA
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及表達(dá)抗菌肽的DNA 。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，由于過(guò)度追求經(jīng)濟(jì)效益，高密度、集約化的珍珠養(yǎng)殖模式快速發(fā)展，使得養(yǎng)殖病害日趨嚴(yán)重，各種病害頻繁爆發(fā)，已成為淡水珍珠養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的主要瓶頸。各類(lèi)農(nóng)藥、抗生素盲目無(wú)序和頻繁使用，不僅對(duì)病害的預(yù)防與治療沒(méi)有起到明顯作用，而且，由于這些藥物的大量使用嚴(yán)重破壞了自然生態(tài)環(huán)境，藥品的殘留已經(jīng)直接威脅到人類(lèi)的健康，因此，發(fā)現(xiàn)和尋找通用性強(qiáng)、防治效果好、廣譜無(wú)污染的新型病害預(yù)防和治療藥物，成為人們亟待解決的重要課題之一。抗菌肽(Defensin)又稱(chēng)抗微生物肽，是參與動(dòng)物先天性免疫防御功能的重要組分，具有廣譜殺菌、抑病毒、抑真菌、抑寄生蟲(chóng)等作用的一類(lèi)膜活性多肽，不易引進(jìn)微生物的耐藥性，成為抗生素藥物的理想替代品。抗菌肽作用機(jī)理非常獨(dú)特，研究表明，抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜發(fā)生穿孔，破壞膜的完整性，使細(xì)菌因不能保證正常滲透壓而死亡(Park, Y., Biochim Biophys Acta.2003, 1645(2):172-182)。
[0003]Defensin是貝類(lèi)抗菌肽中的一大類(lèi)群，其典型特征是分子內(nèi)具有6個(gè)或8個(gè)保守的半胱氨酸殘基組成的二硫鍵，二級(jí)結(jié)構(gòu)包括一個(gè)α螺旋和兩個(gè)反向平行的β折疊，分子量約 3-5 kDa。在紫貽貝(M.galloprovincialis)、太平洋牡販(Crassostrea gigas)、海灣扇貝(Argopecten irradians)和菲律賓給仔(Ruditapes phiIippinarum)等海水貝類(lèi)中都有研究過(guò)Defensins。研究表明，病原菌刺激貽貝(Mytilus.galloprovincialis)后可增強(qiáng)defensin在血淋巴中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。從牡販(Crassostrea gigas)的觸組織中分離純化到defensin蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均具有較強(qiáng)抑菌活性(Seo, et al., BiochemBiophys Res Commun, 2005, 338 (4): 1998-2004)。此外，已證明無(wú)論是化學(xué)合成或體外重組表達(dá)的一些海水貝類(lèi)defensins均能表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌功效(Adhya, et al., CompBiochem Physiol B.2012, 161 (1):25-31; Gueguen, et al., J Biol Chem, 2006,281(1): 313-23; Xu and Faisal, Molecular Immunology, 2010, 47: 2138-2147;Zhao, et al., Molecular Immunology, 2007, 44 (4): 360-368; Zhao, et al., PLoSOne, 2010, 5(10): el3480)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明涉及一種表達(dá)新型Defensin抗菌肽的DNA,所表達(dá)出的新型Defensin抗菌肽具有良好的抗菌性能。
[0005]具體技術(shù)方案如下:
表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA,序列如SEQ:1所示。
[0006]所述DNA編碼的新型defensin抗菌肽:(a)其氨基酸序列如SEQ: 2所示；或(b)將(a)中的序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，缺失或添加具有抗菌肽功能的由(a)衍生的新型defensin抗菌肽。
[0007]本發(fā)明還涉及:
表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA的載體。
[0008]所述表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA的載體為pGEX-4T-l_defensin。
[0009]由于抗菌肽天然資源有限，鑒于化學(xué)合成肽類(lèi)成本高，而基因工程方法大量生產(chǎn)抗菌肽的途徑較為現(xiàn)實(shí)，并顯示出良好應(yīng)用前景。本發(fā)明主要是在一種淡水珍珠貝類(lèi)鑒定發(fā)現(xiàn)了一種抗菌肽Defensin基因序列，并采用一種基因工程手段獲得了其產(chǎn)物，抑菌實(shí)驗(yàn)分析證明其能夠顯示出較強(qiáng)抑菌活性。因此，我們有望通過(guò)較廉價(jià)大規(guī)模的基因工程重組方法獲得大量的此類(lèi)抗菌肽，將其應(yīng)用在淡水珍珠養(yǎng)殖過(guò)程中既能有效地防治的各種疾病的發(fā)生，又可避免了濫用抗生素帶來(lái)的日益嚴(yán)重的微生物對(duì)抗生素的耐藥性問(wèn)題，同時(shí)極大地降低了珍珠養(yǎng)殖過(guò)程中用于其病害防治的藥物經(jīng)濟(jì)成本。
[0010]池蝶蛘可用于獲取該分子的天然材料。從嗜水氣單胞菌誘導(dǎo)池蝶蛘血細(xì)胞cDNA文庫(kù)中，應(yīng)用通用引物M13進(jìn)行文庫(kù)篩查，PCR擴(kuò)增，測(cè)序，所得序列同源比對(duì)及蛋白三維建模等生物信息學(xué)分析鑒定為池蝶蛘抗菌肽Defensin基因。病原菌脅迫進(jìn)一步表明其參與了池蝶蛘免疫防御反應(yīng)，通過(guò)重組方法能夠表達(dá)其重組蛋白分子(附圖3)。該重組蛋白抑菌試驗(yàn)分析表明其具有較強(qiáng)的抑菌活性(附圖4)。該產(chǎn)物可用于淡水珍珠蛘天然免疫防御機(jī)制的理論研究，也可作為病害治療藥物、飼料添加劑、免疫增強(qiáng)劑以及珍珠插核手術(shù)時(shí)用作抗感染藥物等在生產(chǎn)方面進(jìn)行應(yīng)用。
[0011]與現(xiàn)有的各類(lèi)農(nóng)藥、抗生素等藥劑用于水產(chǎn)病害防控和治療相比，本發(fā)明的積極效果是: (I)本發(fā)明充分利用了天然抗菌肽具有廣譜殺菌、抑病毒、抑真菌等作用且不易引進(jìn)微生物的耐藥性等生物特征，在掌握該抗菌肽的基因序列和已證明其表現(xiàn)出較強(qiáng)抑菌作用的基礎(chǔ)上，可應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉，可用于珍珠養(yǎng)殖及手術(shù)育珠過(guò)程中的各種病害防治，尤其是重組抗菌肽的在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用不會(huì)產(chǎn)生任何水環(huán)境污染事件。
[0012](2)本發(fā)明充分利用了同為帆蛘屬且均作為淡水育珠蛘源的池蝶蛘抗病力優(yōu)于三角帆蛘的生物特征(徐毛喜，等。南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版)，2004，28 (3):262-269)，從池蝶蛘中鑒定到其抗菌肽defensin序列，且證明其重組蛋白表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，其產(chǎn)品可應(yīng)用除池蝶蛘外的其他淡水珍珠蛘的病害防控。
[0013](3)本發(fā)明不同于已報(bào)道的池蝶蛘抗菌肽Defensin序列(Peng K，et al.,Aquaculture, 2012, 334-337:45 - 50)，兩序列差異性比較如圖 9:
因此，本發(fā)明作為用于淡水珍珠養(yǎng)殖或水產(chǎn)養(yǎng)殖病害治療藥物、飼料添加劑、免疫增強(qiáng)劑以及淡水珍珠插核手術(shù)時(shí)用作抗感染藥物等，同源也可應(yīng)用于淡水珍珠蛘天然免疫防御機(jī)制的理論研究。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1池蝶蛘基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0015]圖2池蝶蛘Defensin氨基酸序列同其他物種抗菌肽defensin同源比較
池蝶蛘，Hyriopsis schlegelii defensin (本發(fā)明)；牡販，Crassostrea gigasdefensin: ACQ76287 ;給，phiIippinarum defensin:AFP50003 ;長(zhǎng)角血蝶，Haemaphysalis longicornis defensin: ABW08117。
[0016]圖3池蝶蛘中鑒定到抗菌肽Defensin同其他物種抗菌肽Defensin蛋白同源建模分析
池蝶蛘，Hyriopsis schlegelii, defensin (本發(fā)明)；牡販，Crassostrea gigasdefensin: ACQ76287 ;給，phiIippinarum defensin:AFP50003 ;長(zhǎng)角血蝶，Haemaphysalis longicornis defensin: ABW08117。
[0017]圖4嗜水氣單胞菌刺激后抗菌肽在池蝶蛘血淋巴中轉(zhuǎn)錄變化。
[0018]圖5 PCR 擴(kuò)增獲得 Defensin-ORF 片段。
[0019]圖6重組質(zhì)粒pGEX-4T-l_defensin的雙酶切驗(yàn)證。
[0020]圖7池蝶蛘抗菌肽defensin重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
[0021]M:Protein Marker 1:未誘導(dǎo)的宿主菌所表達(dá)的蛋白量2，3，4:分別表示宿主菌在2h、4h、6h誘導(dǎo)后所表達(dá)的蛋白量，箭頭所指為目的蛋白。
[0022]圖8抑菌效果圖。
[0023]圖9本發(fā)明序列與已報(bào)道現(xiàn)有序列對(duì)比。 【具體實(shí)施方式】
[0024]材料
池蝶蛘
池蝶蛘取自江西撫州市洪門(mén)水庫(kù)開(kāi)發(fā)公司池蝶蛘良種養(yǎng)殖基地，外殼完好，噴水有力；殼長(zhǎng)為(107±6.5) mm。蛘置實(shí)驗(yàn)室水族箱充氣水中暫養(yǎng)一周，水溫為18 — 25°C。
[0025]菌株與載體。
[0026]嗜水氣單胞菌購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心、大腸桿菌BL21 (DE3)表達(dá)菌珠購(gòu)自TAKARA寶生物工程(大連)有限公司。pGEX-4t-l表達(dá)載體購(gòu)自Amersham公司。
[0027]主要酶和試劑
Ex Taq酶(TaKaRa)、DNA快速回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN)、限制性?xún)?nèi)切酶(TaKaRa)；T4 DNA連接酶、MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Progmeg公司)、TRIZ0L Reagent (Invitrogen公司)均為進(jìn)口原裝試劑。其余試劑均為常規(guī)試劑，不再贅述。
[0028]實(shí)施例1
1.2.1 cDNA文庫(kù)PCR篩查(注:基因工程應(yīng)用生產(chǎn)重組蛋白則直接從1.2.4步驟開(kāi)
始)
池蝶蛘血細(xì)胞cDNA文庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用Creator? SMARTTM cDNA LibraryConstruction Kit (Clontech)已構(gòu)建(謝凱，等。水生生物學(xué)報(bào)。2011,35 (5):783_789)。
[0029]本發(fā)明中，應(yīng)用M13引物對(duì)文庫(kù)菌液涂板后挑單克隆搖菌取菌液進(jìn)行PCR大規(guī)模篩查，具體實(shí)施如下:取稀釋后的文庫(kù)菌液涂布平板，挑取單克隆利用菌液PCR檢測(cè)插入片段的大小。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min; 94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 90s, 33個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠跑電泳參照分子Marker鑒定大小、對(duì)選定一定大小的片段送上海生工測(cè)序。測(cè)序獲得序列利用NCBI vecscreen和BLASTN
2.2.21+程序識(shí)別并去除測(cè)序結(jié)果中的載體序列。[0030]M13引物設(shè)計(jì)如下:
M13-F: 5， GTAAAACGACGGCCAGT3，；
M13-R: 5’ AACAGCTATGACCATG3’ ；
1.2.2池蝶蛘抗菌肽defensin基因序列確定及蛋白分析
利用NCBI的ORF Finder程序?qū)θコd體序列的樣品序列做開(kāi)放閱讀框分析，并翻譯所得氨基酸序列在NCBI網(wǎng)上進(jìn)行BLASTP比對(duì)鑒定其同源序列。運(yùn)用ClustalW方法對(duì)序列對(duì)應(yīng)蛋白與其他物種同源序列進(jìn)行蛋白保守性分析，用Mega4.1軟件NJ(NeighbourJoining)算法產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用SWISS-MODEL(版本3.5)程序做同源建模分析。
【權(quán)利要求】
1.表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA,序列如SEQ:1所示。
2.權(quán)利要求1所述DNA編碼的新型defensin抗菌肽:(a)其氨基酸序列如SEQ:2所示；或(b)將(a)中的序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，缺失或添加具有抗菌肽功能的由(a)衍生的新型defensin抗菌肽。
3.包含權(quán)利要求1表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA的載體。
4.如權(quán)利要求3所述表達(dá)新型defensin抗菌肽的DNA的載體為pGEX-4T-l_defensin。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK103642811SQ201310301542
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】彭扣, 洪一江, 王軍花, 盛軍慶 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)