含sars病毒rbd抗原的重組蛋白及展示rbd蛋白的桿狀病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了含SARS病毒RBD抗原的重組蛋白及展示RBD蛋白的桿狀病毒，該重組蛋白SP-RBD-TM是由SARS病毒的RBD蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的信號肽SP，C-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM構(gòu)成。表面展示SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒是由SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒并通過轉(zhuǎn)座與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組，然后將重組桿狀病毒基因組轉(zhuǎn)染家蠶細胞，在其內(nèi)包裝得到的重組桿狀病毒。重組桿狀病毒將SARS病毒的RBD蛋白與家蠶桿狀病毒囊膜蛋白GP64融合，實現(xiàn)RBD蛋白在病毒衣殼上的展示，具有良好的免疫原性。
【專利說明】含SARS病毒RBD抗原的重組蛋白及展示RBD蛋白的桿狀病 毒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種含SARS病毒RBD抗原的重組蛋白， 及展示RBD蛋白的重組桿狀病毒。

【背景技術(shù)】
[0002] 嚴重急性呼吸綜合征（Severe Acute Respiratory Syndromes)，又稱傳染性非典 型肺炎，簡稱SARS，是一種因感染SARS冠狀病毒引起的新的呼吸系統(tǒng)傳染性疾病。主要通 過近距離空氣飛沫傳播，以發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、乏力、干咳少痰等為主要臨床表現(xiàn)，嚴重 者可出現(xiàn)呼吸窘迫。本病具有較強的傳染性，在家庭和醫(yī)院有顯著的聚集現(xiàn)象。首發(fā)病例， 也是全球首例，于2002年11月出現(xiàn)在廣東佛山，并迅速形成流行態(tài)勢。2002年11月至 2003年8月5日，29個國家報告臨床診斷病例共8422例，死亡916例。報告病例的平均死 亡率為9. 3%。該病毒很可能來源于動物，由于外界環(huán)境的改變和病毒適應性的增加而跨越 種系屏障傳染給人類，并實現(xiàn)了人與人之間的傳播。
[0003] 雖然SARS已被控制，但SARS病毒不大可能在短期內(nèi)被"消滅"或自動消失，SARS 在人群中再次出現(xiàn)的可能性很大。再次發(fā)生SARS疫情的時間，主要與病毒侵襲人體的時間 有關(guān)，不一定表現(xiàn)為冬春高發(fā)。動物攜帶病毒的季節(jié)性分布、人接觸感染動物的機會等都將 影響再次發(fā)生疫情的時間。動物仍然是病毒的可能來源，人群對SARS病毒仍然普遍易感， 其疫苗仍是目前的研究重點。
[0004] 目前SARS疫苗包括治療性疫苗、滅活疫苗、DNA疫苗、多表位疫苗等，已有一定進 展，但也存在相應的問題，具體見下表。
[0005] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種含SARS病毒RBD抗原的重組蛋白SP-RBD-TM，其特征在于，該蛋白是由SARS病 毒的RBD蛋白的N-端連接桿狀病毒囊膜蛋白GP64的信號肽SP，C-端連接桿狀病毒囊膜蛋 白GP64的跨膜域TM構(gòu)成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含SARS病毒RBD抗原的重組蛋白SP-RBD-TM，其特征在于， 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
3. 權(quán)利要求2所述的含SARS病毒RBD抗原的重組蛋白SP-RBD-TM的編碼基因，其特征 在于，核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
4. 一種表面展不SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒是由權(quán)利要 求3所述重組蛋白SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒并通過轉(zhuǎn)座與穿梭載體Bacmid 的基因組進行同源重組，獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉(zhuǎn) 染家蠶細胞，在家蠶細胞內(nèi)包裝得到所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒，其特征 在于，所述供體質(zhì)粒為pFastBacDual，重組蛋白SP-RBD-TM的編碼基因插入到供體質(zhì)粒 pFastBacDual的pPolh啟動子下，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒后再與穿梭載體Bacmid的基因組進 行同源重組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒，其特征在于， 所述家蠶細胞為家蠶BmN細胞。
7. 權(quán)利要求4飛任一所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒的制備方法， 其特征在于，步驟如下： (1) PCR擴增獲得桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因、SARS病毒的RBD蛋 白的編碼基因和桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因； (2) 通過重疊 PCR擴增的方法拼接步驟（1)獲得的三種基因序列，得到重組蛋白 SP-RBD-TM的編碼基因，再將編碼基因片段連接到載體pFastBacDual的pPolh啟動子下，構(gòu) 建成重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒； (3) 重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞， 進行同源重組，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、X-gal和IPTG的LB培養(yǎng)平板上進行藍 白斑篩選，避光培養(yǎng)4(T48h后挑取白斑，白斑繼續(xù)培養(yǎng)24?48h后抽提重組桿狀病毒基因組 DNA進行PCR鑒定； (4) 取步驟（3)鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質(zhì)體介導法轉(zhuǎn)染家蠶細胞， 發(fā)病后獲得一代病毒懸液，提取病毒基因組再次進行PCR鑒定，鑒定正確的即為表面展示 SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒； 所述PCR鑒定使用如SEQIDN0:3、SEQIDN0:4和SEQIDN0:9所示的引物序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的表面展示SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒的制備方法，其 特征在于，步驟（1)中擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64信號肽SP的編碼基因使用的引物核苷 酸序列如SEQ ID N0:4?5所示；擴增SARS病毒RBD蛋白的編碼基因使用的引物核苷酸序列 如SEQ ID N0:6?7所示；擴增桿狀病毒囊膜蛋白GP64的跨膜域TM的編碼基因使用的引物 核苷酸序列如SEQ ID N0:8?9所示。
9. 權(quán)利要求4~6任一所述的表面展不SARS抗原RBD蛋白的重組桿狀病毒在制備SARS 疫苗中的應用。
【文檔編號】C07K19/00GK104292339SQ201310301896
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】張耀洲, 閆晶晶, 舒特俊, 陳劍清, 蓋其靜 申請人:特菲(天津)生物醫(yī)藥科技有限公司