水稻轉(zhuǎn)錄因子Os02g47744基因CDS序列的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子Os02g47744基因CDS序列的應(yīng)用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os02g47744融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒寬度。對(duì)于詳細(xì)闡明調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因CDS序列的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子〇s〇2g47744基因⑶S序 列的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是我國(guó)和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個(gè)重要的功能基因研究的模式植物。與其相關(guān)的遺傳學(xué)和分子 生物學(xué)研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式。當(dāng)前水 稻增產(chǎn)的研究較依賴于有限的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)的雜交育種優(yōu)勢(shì)正在逐漸減弱，而水稻 轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能發(fā)掘水稻進(jìn)一步增產(chǎn)的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時(shí)也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學(xué)的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個(gè)有次序的、選擇性的基因表達(dá)過 程。而轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)的精確調(diào)控中起到了關(guān)鍵性的作用。
[0004] 禾谷類作物的產(chǎn)量很大程度上取決于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性狀的基因調(diào) 控是重要的研究領(lǐng)域。MYB蛋白是植物體內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控著植物體內(nèi)眾多基因 的轉(zhuǎn)錄，通過MYB結(jié)構(gòu)域與啟動(dòng)子中的順式作用元件（cis-actingelement)結(jié)合，調(diào)控其 靶位基因的表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到非常重要的作用。完整的MYB主要由3部分結(jié) 構(gòu)組成：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain，DBD)、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transactivation domain，TAD)和負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)域（negativeregulatorydomain，NRD)。其中，DNA結(jié)合區(qū)域 (DBD)是MYB最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，通常含有3類不完全重復(fù)因子，用Rl、R2和R3表示，每個(gè)重 復(fù)因子含有51?53個(gè)氨基酸序列，每隔18個(gè)氨基酸中含有一個(gè)色氨酸殘基或其他疏水基 團(tuán)，這些氨基酸序列形成螺旋一轉(zhuǎn)角一螺旋（HTH)結(jié)構(gòu)，以色氨酸殘基為中心形成3維的核 心結(jié)構(gòu)。
[0005] 分子雜交技術(shù)證實(shí)了花器官中普遍存在特異性表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子，包括十字 花科擬南芥中的MYB26和MYB103,茄科煙草（Nic-otianatabacum)中的NtMYBASl和 NtMYBAS2,禾本科玉米（Zeamays)中的ZmMYBP2?；蛲蛔兎治鼋沂玖薓YB類轉(zhuǎn)錄因子在 花粉發(fā)育過程中的功能，包括控制絨毯層的形態(tài)及其細(xì)胞程序性死亡（programmedcell death，PCD)、胼胝質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化、光合產(chǎn)物的運(yùn)輸以及花藥開裂等，花粉發(fā)育相關(guān)的MYB類 轉(zhuǎn)錄因子功能異常均有可能導(dǎo)致部分甚至完全雄性不育（malesterility)。
[0006] MYB轉(zhuǎn)錄因子在花粉發(fā)育過程中起到非常重要的作用。近年來，MYB功能基因組 研究表明，植物小孢子發(fā)生過程和雄配子體發(fā)生過程中MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)相關(guān)功能基 因的表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)一系列的生化反應(yīng)和生理變化，促進(jìn)小孢子母細(xì)胞發(fā)育成正?？捎?花粉。整個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控中如果出現(xiàn)MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常，基因沉默或過量表達(dá)，都會(huì)影響 花藥的正常發(fā)育，形成空泡狀、畸形花粉，導(dǎo)致部分雄性不育甚至完全雄性不育。在植物花 粉發(fā)育過程中，MYB轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控MST家族基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)光合產(chǎn)物的運(yùn)輸。Zhang 等（ZhangH,LiangWQ.etal. (2010)CarbonstarvedantherencodesaMYBdomain proteinthatregulatessugarpartitioningrequiredforricepollendevelopment .)克隆了水稻絨毯層特異性表達(dá)的CSA(carbonstarvedanther)基因，該基因?qū)儆?R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，csa水稻突變體絨氈層中MST8的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，由于光合產(chǎn)物不 能運(yùn)輸?shù)交ㄋ幹?，沒有充足的營(yíng)養(yǎng)保證花粉發(fā)育的正常進(jìn)行，以致出現(xiàn)空泡狀花粉。
[0007] MYB轉(zhuǎn)錄因子在環(huán)境因子、激素以及其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控MYB 轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到控制花粉發(fā)育過程的作用。以MYB80 /UNDEAD為例， 絨氈層P⑶對(duì)于功能性花粉形成具有非常重要的作用，抑制或延遲P⑶導(dǎo)致絨氈層肥大且 液泡化，使其不能正常完成生理功能，致使植株出現(xiàn)雄性不育。總之，控制水稻籽粒發(fā)育是 一個(gè)復(fù)雜過程，涉及到多基因多條途徑的協(xié)調(diào)控制，目前發(fā)現(xiàn)調(diào)控該性狀的基因不多，調(diào)控 籽粒發(fā)育的分子機(jī)理尚未闡明，因此，尋找控制籽粒性狀發(fā)育的基因和新的發(fā)掘手段對(duì)作 物改良并提高作物產(chǎn)量具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因⑶S序列的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，即融合蛋白 (VP16)4-Linker-0s02g47744。
[0010] 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，將4個(gè)VP16功能域基序融合在一起 可構(gòu)成一類增強(qiáng)子，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16)4，即VP64是由4個(gè)VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser為間隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQIDNo. 10和SEQIDNo. 4所示。 [0011] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 9所示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQIDNo. 3所示。
[0012] 上述融合蛋白中涉及的0s02g47744為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744,其氨基酸序列 如SEQIDNo. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因的⑶S序列為：SEQIDNo. 1所示的核苷酸 序列。
[0013] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因，以及在嚴(yán)格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供含有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因的載體、工程菌及細(xì)胞 系。
[0015] 所述載體的構(gòu)建方法如下：
[0016] (1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice,plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s02g47744基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)，其為正向 引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGTTCATCCTGGACAAC-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGG TCTCACTGAAAGTTGTGGTAC-3' 。
[0017] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進(jìn)行PCR， 獲得0s02g47744基因完整的CDS序列。
[0018] (3)將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0019] (4)以植物雙元表達(dá)載體pCambial301_UbiN(圖6)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過體外重組，將ubipromoter-VP64-Gateway表達(dá)單兀、35Spromoter-asRED表達(dá) 單元和35Spromoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQIDNo. 5 所示。
[0020] (5)通過LR反應(yīng)將0s02g47744基因的CDS序列構(gòu)建到其目的基因的5'端連有 VP64編碼基因的植物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄 因子VP64-Linker-0s02g47744 基因的表達(dá)載體ubi:VP64-0s02g47744,其全序列如SEQID No. 6所示。
[0021] 上述表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿 孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998，MethodforPlantMolecular BiologyVIII，AcademyPress，NewYork，第 411-463 頁；Geiserson和Corey，1998，Plant MolecularBiology,2ndEdition)。
[0022] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，具體為：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法， 將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化 后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0023] 本發(fā)明還提供編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒寬及千粒重）中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因⑶S序列的引物對(duì)，包括 正向引物F:5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGTTCATCCTGGACAAC-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGC TGGGTCTCACTGAAAGTTGTGGTAC-3' 。
[0025] 本發(fā)明進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因⑶S序列在調(diào)控水稻籽粒性狀 中的應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64(SEQIDNo. 10)與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744融合 構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中， 從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。
[0026] 前述的應(yīng)用，是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因的⑶S序列構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄因子激活 基序VP64編碼基因（SEQIDNo. 4)的下游，轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀。優(yōu) 選將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 編碼基因的下游。
[0027] 本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻 轉(zhuǎn)錄因子〇s〇2g47744融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基 因轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒寬度增加。對(duì)于詳細(xì)闡明 調(diào)控種子發(fā)育機(jī)理具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，改良水稻的粒型，因此 在生產(chǎn)實(shí)踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0029] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中ubi:VP64-0s02g47744載體圖譜。
[0030] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中PCR檢測(cè)VP64-0s02g47744轉(zhuǎn)基因陽性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，V2155H-ll、V2155H-35 為VP64-0s02g47744 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0031] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的表型寬度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，V2155H-ll、V2155H-35 為VP64-0s02g47744 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0032] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因水稻籽粒性狀的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，V2155H-ll、V2155H-35 為VP64-0s02g47744 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
[0033] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 0s02g47744基因CDS序列的獲得及植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037] 10s02g47744基因CDS序列的獲得
[0038] 在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_ search_locus.shtml)中找到0s02g47744基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，正向引物F: 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGAGTTCATCCTGGACAAC-3' 和反向引物R:5'-CAAGAAAGCTGGGTCTCAC TGAAAGTTGTGGTAC-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和R進(jìn) 行PCR，獲得0s02g47744基因完整的CDS序列（如SEQIDNo. 1所示)。
[0039] 2植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0040] 將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄 因子激活基序VP16編碼基因（如SEQIDNo. 4所示）的下游。
[0041] 2. 1將上述PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體上
[0042] 按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。此過程中包含兩輪 PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptorattB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的 模板用第一輪的PCR產(chǎn)物，并且引物用完整的adaptorattB引物（attB5'adaptor: 5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3'adaptor:5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。將PCR產(chǎn)物克隆到pDONER克隆載體(購自Invitrogen)上， 經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。
[0043] 2. 2植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0044] 以植物雙元表達(dá)載體pCambial301_UbiN(圖6)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過體外重組，將ubipromoter-VP64-Gateway表達(dá)單兀、35Spromoter-asRED表達(dá)單兀和 35Spromoter-hyg表達(dá)單元與之融合構(gòu)建，得到載體nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQID No. 5所示，載體圖譜見圖1。
[0045] 表達(dá)載體nVP64-hyg_asRED含有Gateway重組系統(tǒng)，pDONR帶有目的基因的質(zhì)粒 作為入門載體（Enteryvector),通過LR反應(yīng)可完成目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0046] 通過LR反應(yīng)將0s05g27980基因的CDS序列構(gòu)建到其目的基因的5'端連有VP64 編碼基因的植物表達(dá)載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因 子VP64-Linker-0s05g27980 基因的表達(dá)載體ubi:VP64-0s05g27980,其全序列如SEQID No. 6所示，載體圖譜見圖2。
[0047] LR反應(yīng)體系如下：
[0048] 表達(dá)載體 Ιμ? ( 30-50ng ) 入門載體（pDONR-gene ) Ιμ? ( 30-50ng ) LRClonase Enzyme Mix Ιμ? CldH2O 2μ1 總體積 5μ1
[0049]于25°C反應(yīng)過夜。用反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆。
[0050] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0051] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒 之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長(zhǎng)力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ubi:VP64-0s02g47744轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100μM的 乙酰丁香酮和OD值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組織置 于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長(zhǎng)出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計(jì)算轉(zhuǎn)化所 獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長(zhǎng)。獲得40株轉(zhuǎn)基因苗。
[0052] 本實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基配方如下：
[0053] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0054] 共培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 2后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS(乙酰丁香酮）100?200μg/mL。
[0055] 篩選培養(yǎng)基：N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術(shù)有限公司）。
[0056] 分化培養(yǎng)基：MS無機(jī)+MS-B5微量+MS有機(jī)+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/ LNAA+2.Omg/LKinetin(激動(dòng)素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制， 調(diào)pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0057] 實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因陽性株系的鑒定
[0058] 為檢測(cè)實(shí)施例2獲得的VP64-0s02g47744轉(zhuǎn)基因水稻株系中ubi: VP64-0s02g47744基因在T2代轉(zhuǎn)基因水稻（V2155H-11、V2155H-35)中的過表達(dá)情況，本實(shí) 施例在載體與目的基因接頭處設(shè)計(jì)引物（正向引物：5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC TTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）進(jìn)行PCR檢測(cè)，得到了明 顯的特異性條帶。由圖3可見，擴(kuò)增出的條帶大小在250bp以上，且引物是在載體與目的基 因接頭處設(shè)計(jì)的，擴(kuò)增出的片段大小與目的基因（306bp)基本一致。因此可以說明，實(shí)施例 2獲得的轉(zhuǎn)基因水稻株系V2155H-1UV2155H-35中含有VP64-0s02g47744融合基因。
[0059] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析和考種分析
[0060] 將實(shí)施例2獲得的轉(zhuǎn)基因水稻株系V2155H-1UV2155H-35和野生型水稻種子進(jìn)行 比較，從表型上可以明顯的看出，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因材料的籽粒明顯變寬（圖4)?？挤N數(shù)據(jù)分析表 明（圖5)，本發(fā)明獲得的VP64-0s02g47744轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的寬顯著大于野生型水稻籽粒。
[0061] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于，其為融合蛋白（VP16)4-Linker-〇s02g47744 ； 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4個(gè)VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser為間隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s02g47744為水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s02g47744,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1所述組成型水稻轉(zhuǎn)錄因子的基因。
3. 含有權(quán)利要求2所述基因的載體。
4. 含有權(quán)利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉(zhuǎn)基因水稻植株的構(gòu)建方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求 3所述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導(dǎo)劑和農(nóng)桿菌的AAM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的 材料經(jīng)過共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉(zhuǎn)基因水稻植株。
6. 權(quán)利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
7. 用于擴(kuò)增水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因CDS序列的引物對(duì)，其特征在于， 包括正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGAG ITCATCCTGGACAAC-3' 和反向引物 R : 5'-CAAGAAAGCTGGGT CTCACTGAAAGTTGTGGTAC-3' ； 其中，水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因CDS序列在調(diào)控水稻籽粒性狀中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64與水稻 轉(zhuǎn)錄因子〇s〇2g47744融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并將編碼所述組成型轉(zhuǎn)錄因子的基 因轉(zhuǎn)化水稻，從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s02g47744基因 的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64編碼基因的下游，轉(zhuǎn)化水稻， 從而改良轉(zhuǎn)基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104341525SQ201310347011
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】趙濤, 張傳玉, 李宏宇, 劉斌, 劉軍, 林辰濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所