一種制備多肽藥物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備多肽藥物DiaPep277的方法，包含：將Fmoc-Asp(OtBu)-OH與樹脂P偶聯(lián)，得到Fmoc-Asp(OtBu)-P；將Fmoc-Asp(OtBu)-P采用逐一偶聯(lián)的方式固相合成，得到DiaPep277-P；將DiaPep277-P裂解，得到DiaPep277粗肽。
【專利說明】一種制備多肽藥物的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種制備多肽藥物的方法，具體而言，涉及DiaPep277的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] DiaP印277是源自人熱休克蛋白60 (HSP60)序列上的一段含24個氨基酸的肽段。 DiaP印277的結(jié)構(gòu)如下：
[0003] H-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser -Leu-Thr-Pr〇-Ala-Asn-Glu-Asp-〇H 〇
[0004] 研究證明，DiaPep277能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，使胰島細胞免受破壞并保護胰島素分泌 功能。因此，DiaPep277為自身免疫性糖尿病患者的治療帶來實質(zhì)性的突破，并且可以作為 這種糖尿病發(fā)病高危人群的預防性用藥。這種藥物可以明顯提高I型糖尿病患者的生存質(zhì) 量，延緩或阻止各種并發(fā)癥的發(fā)生，以提高患者的預期壽命。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 對于含有24個氨基酸的短肽，由于固相方法存在操作簡便，溶劑使用量小，易于 自動化等優(yōu)點，因此往往采用常規(guī)的保護氨基酸進行固相順序偶聯(lián)進行合成。但是，經(jīng)分 析DiaPep277的肽鏈后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該肽鏈存在一些特殊的情況，大量的疏水性基團 (特別是N端）及-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)的存在會使合成存在較大的困難。如果采用常規(guī)的 Fmoc-Gly-OH原料容易在合成-Gly-Gly-Gly-結(jié)構(gòu)時產(chǎn)生土Gly的雜質(zhì)等。
[0006] 本發(fā)明的目的在于采用特殊的氨基酸原料來解決上述困難，提高粗肽的純度與收 率。
[0007] 本發(fā)明提供一種制備多肽藥物DiaP印277的方法，包含以下步驟：
[0008] 1)以一種樹脂P作為載體，將Fmoc-Asp(OtBu)-OH與樹脂偶聯(lián)，得到 Fmoc-Asp(OtBu)-P ;
[0009] 2)以Fmoc-Asp(OtBu)-P為原料，采用逐一偶聯(lián)的方式與其他氨基酸原料進行固 相合成，得到DiaP印277-P ;
[0010] 3)將DiaP印277-P裂解，得到DiaP印277粗肽；
[0011] 其中Fmoc為9-芴甲氧羰基，與氨基相連或與羧基所連的碳原子上的氮原子相連，
[0012] 其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中Asp-Ser結(jié)構(gòu)采用的合成原料是 Fmoc-Asp (OtBu) -Ser ( ΨΜε' MePro) -0H，其為一個假脯氨酸二肽，使絲氨酸被保護成五元環(huán)， 結(jié)構(gòu)如下：
[0013]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備多膚藥物DiaP巧277的方法，包含W下步驟： 1. W -種樹脂P作為載體，將Fmoc-Asp(0tBu)-0H與樹脂偶聯(lián)，得到 Fmoc-Asp (0巧11) -P ; 2. W Fmoc-Asp(0巧u)-P為原料，采用逐一偶聯(lián)的方式與其他氨基酸原料進行固相合 成，得到DiaP巧277-P ; 3) 將DiaP巧277-P裂解，得到DiaP巧277粗膚； 其中Fmoc為9-巧甲氧撰基，與氨基相連或與駿基所連的碳原子上的氮原子相連， 其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中Asp-Ser結(jié)構(gòu)采用的合成原料是 Fmoc-Asp (0巧U) -Ser ( vMe' Mepro) -0H，其為一個假脯氨酸二膚，使絲氨酸被保護成五元環(huán)， 結(jié)構(gòu)如下：
其中-Gly-Gly-Gl}f-結(jié)構(gòu)米用的合成原料為 Fmoc-(Hmb)Gl}f-〇H、Fmoc-(Dmb)Gl}f-〇H、 Fmoc-Gly-(Dmb)Gl}f-〇H 或 Fmoc-Gly-(Hmb)Gl}f-〇H 中的一種或兩種。
2. 權(quán)利要求1的方法，還包括純化DiaPep277的步驟，純化優(yōu)選通過重結(jié)晶方法或 HPLC (例如反相HPLC)而進行。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)-3)均在室溫和常壓下進行；步驟1)-2)的偶聯(lián)反 應在固相反應柱中進行。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述樹脂P為2-CTC樹脂或王樹脂；其中所述樹脂P的替 代度為 0.2-1. Ommol / g，優(yōu)選為 0.3-0. 8mmol / g，更優(yōu)選為 0.4-0. 6mmol / g。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟2)所述的逐一偶聯(lián)的方式中-Gly-Gly-Gly-結(jié) 構(gòu)采用的合成原料為選自Fmoc- (Hmb) G1廠0H和Fmoc- 〇)mb) G1廠0H的一種，W及選自 Fmoc-Gly-(Dmb) Gl}f-〇H 和 Fmoc-Gly-(Hmb) Gl}f-〇H 的一種。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)中的偶聯(lián)劑為HOBt / Die ; 步驟。所述的Fmoc-Asp (0巧u) -Ser ( ￥ Me' Mepro) -OH的偶聯(lián)體系為HATU /冊At / DIPEA、PyBOP / HOBt / DIPEA 或 TBTU / HOBt / DIPEA 中的一種； 步驟2)所述的Gly合成原料的偶聯(lián)體系為Die / H0At、HATU / BOAt / DIPEA或 PyBOP / HOBt / DIPEA 中的一種。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中偶聯(lián)中對樹脂的洗涂和溶脹采用DMF進行； 優(yōu)選地，將步驟1)-2)中物質(zhì)中的駿基進行活化，活化優(yōu)選在冰水浴中進行；優(yōu)選活化 劑為DIPEA或DIC。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)-2)中脫除Fmoc的試劑為DBLK ;脫保護反應時間為 5-30分鐘，優(yōu)選10-20分鐘。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟3)中的裂解試劑TFA、H異丙基娃焼和水的混合溶劑， 其中混合溶劑的配比為；TFA體積比為85-90%，H異丙基娃焼的體積比為1-5%，水的體積 比為1-5%，H者之和為100% ; 優(yōu)選地，所述裂解試劑為TFA ;TIS化0 = 95 ;5 ;5 (V ;V)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在氨基酸Fmoc-Asp(0巧U)-0H偶聯(lián)至載體樹脂上之后， 還包括向其中加入一種封閉液除去樹脂中過量的未反應基團的步驟；當所述載體樹脂為 2-CTC樹脂時，所加入的封閉液優(yōu)選為甲醇；當所述載體樹脂為王樹脂時，所加入的封閉液 優(yōu)選為摩爾比為1 ;1的己酸酢和化巧。
【文檔編號】C07K14/47GK104418948SQ201310410636
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】宓鵬程, 潘俊鋒, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司