栝樓瓤微生物發(fā)酵提取l-瓜氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種栝樓瓤提取L-瓜氨酸的方法，屬于中藥化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括接入乳酸菌發(fā)酵、過濾、吸附交換、濃縮、結(jié)晶得到L-瓜氨酸。本方法結(jié)合了發(fā)酵法和酶法，使栝樓瓤中的L-精氨酸在乳酸桿菌產(chǎn)生的脫亞氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸，使收率有很大程度的提高，整個(gè)分離過程中不加入任何有害溶劑，所得產(chǎn)品天然安全，有利于展開保健品及藥品方面的開發(fā)研究。
【專利說明】栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種提取L-瓜氨酸的方法，特別涉及一種栝樓瓤提取L-瓜氨酸的方法，屬于中藥化學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]瓜氨酸最早發(fā)現(xiàn)于野西瓜葉子中，是一種非必需氨基酸。L-瓜氨酸具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能有效清除人體內(nèi)的自由基。西瓜中的L-瓜氨酸被譽(yù)為“綠色偉哥”，可有效提高男性性欲，促進(jìn)男性生殖生育能力，維護(hù)男性正常的生殖健康。瓜氨酸還具血管擴(kuò)張作用，對(duì)心血管系統(tǒng)具有良好的保健作用。此外，瓜氨酸能有效的改善人體的抗疲勞能力，增強(qiáng)人體的肌肉強(qiáng)度，提高體能，在運(yùn)動(dòng)保健方面具有良好的作用。目前國外已經(jīng)利用西瓜中提取的L-瓜氨酸或者其它方法生產(chǎn)者的L-瓜氨酸相繼開發(fā)出了諸如美國天然維他命公司的Stimulin產(chǎn)品和HERBALIFE公司的夜寧新等產(chǎn)品，分別用于男性性功能和心血管系統(tǒng)保健。目前生產(chǎn)瓜氨酸的方法主要是發(fā)酵法、酶法、合成法和提取法。發(fā)酵法和酶法生產(chǎn)的L-瓜氨酸目前是市場上L-瓜氨酸的主要生產(chǎn)方式，這些方法均存在著瓤中L-精氨酸轉(zhuǎn)化率不高、工藝復(fù)雜、環(huán)境不友好等缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為提供一種栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法。
[0004]本發(fā)明所提供的一種栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，以鮮栝樓瓤為原料，包括以下步驟:
(a)將鮮栝樓瓤接入乳酸桿菌，在溫度18— 35°C發(fā)酵15-40天生物轉(zhuǎn)化后滅菌，過濾后得到濾液；
(b)將濾液微濾、超濾、脫水、納濾，得到納濾透過液；
(c)將納濾透過液調(diào)節(jié)PH值至5.0-3.0后通入大孔型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱交換吸附氨基酸；
(d)交換吸附完畢后，用氨水對(duì)離子交換柱進(jìn)行等度洗脫，，洗脫終點(diǎn)為洗出液茚三酮反應(yīng)為陰性；
(e)將洗脫液濃縮、脫氨、脫色；
(f)濃縮液用低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸結(jié)晶，過濾干燥后得到瓜氨酸。進(jìn)一步的，步驟(b)中將步驟(a)所得濾液先用微濾膜，再用超濾膜分別進(jìn)行錯(cuò)流膜過濾，得到超濾清液，其中微濾膜的孔徑為0.1—1.0微米，超濾膜的孔徑為10000—4000分子量，將所得超濾清液先用截留分子量為50—80反滲透膜濃縮脫水，然后用截留分子量為1000—500納濾膜過濾，得到納濾透過液，進(jìn)一步的，步驟(d)中交換吸附完畢后，用0.1-1.0N氨水對(duì)離子交換柱進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.5-1.0BV/h，進(jìn)一步的，將步驟f中所得的瓜氨酸用水溶解后，再用低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸重結(jié)晶，得到純天然瓜氨酸，進(jìn)一步的，微濾膜孔徑為0.2微米的管式膜，超濾膜孔徑為5000分子量的卷式膜，進(jìn)一步的，所述反滲透膜的截留分子量為60，納濾膜截留分子量為600，納濾膜過濾流量為45升/分，壓力1.5MPa，得到納濾透過液，進(jìn)一步的，所述的低分子有機(jī)醇為甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，所述的低分子有機(jī)酸為甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
[0005]本發(fā)明所使用的方法，結(jié)合了發(fā)酵法和酶法，使栝樓瓤中的L-精氨酸在乳酸桿菌產(chǎn)生的脫亞氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為L-瓜氨酸使收率有很大程度的提高，本方法以栝樓瓤發(fā)酵液為提取原料，通過發(fā)酵、滅菌過濾、膜澄清、膜分離和離子交換樹脂分離等清潔的生產(chǎn)方式，在原料和生產(chǎn)工藝的安全性收率上都有明顯的優(yōu)勢(shì)，分離過程中采用了微濾、超濾、反滲透、納濾聯(lián)用的技術(shù)，顯著降低了工藝的能耗與時(shí)間并有效的提高了終端產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)量，所得瓜氨酸純度高。一次分離可使瓜氨酸的純度達(dá)到80%以上,經(jīng)純化后純度可達(dá)到98.5%—99.9%。產(chǎn)品性狀好:整個(gè)分離過程中不加入任何有害溶劑，所得產(chǎn)品天然安全；得到的L-瓜氨酸在食品、保健品和藥品開發(fā)上，具有明顯的安全性優(yōu)勢(shì)，有利于展開保健品及藥品方面的開發(fā)研究。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0006]圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。

【具體實(shí)施方式】
[0007]為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例，這些實(shí)施實(shí)例僅僅是對(duì)本發(fā)明的闡述，不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中的栝樓瓤，采用河南、河北、山東等地區(qū)的栝樓瓤均可適用于本工藝。
[0008]栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，以鮮栝樓瓤為原料，包括以下步驟:
(a)將鮮栝樓瓤接入乳酸桿菌，在溫度18— 35°C發(fā)酵15-40天生物轉(zhuǎn)化后滅菌，過濾后得到濾液；
(b)將濾液微濾、超濾、脫水、納濾，得到納濾透過液；
(c)將納濾透過液調(diào)節(jié)PH值至5.0-3.0后通入大孔型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱交換吸附氨基酸；
(d)交換吸附完畢后，用氨水對(duì)離子交換柱進(jìn)行等度洗脫，，洗脫終點(diǎn)為洗出液茚三酮反應(yīng)為陰性；
(e)將洗脫液濃縮、脫氨、脫色；
(f)濃縮液用低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸結(jié)晶，過濾干燥后得到瓜氨酸。
[0009]進(jìn)一步的，步驟(b)中將步驟(a)所得濾液先用微濾膜，再用超濾膜分別進(jìn)行錯(cuò)流膜過濾，得到超濾清液，其中微濾膜的孔徑為0.1 — 1.0微米，超濾膜的孔徑為10000—4000分子量，將所得超濾清液先用截留分子量為50—80反滲透膜濃縮脫水，然后用截留分子量為1000— 500納濾膜過濾，得到納濾透過液。
[0010]進(jìn)一步的，步驟(d)中交換吸附完畢后，用0.1 — 1.0N氨水對(duì)離子交換柱進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.5-1.0BV/h，進(jìn)一步的，將步驟f中所得的瓜氨酸用水溶解后，再用低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸重結(jié)晶，得到純天然瓜氨酸。
[0011]進(jìn)一步的，微濾膜孔徑為0.2微米的管式膜，超濾膜孔徑為5000分子量的卷式膜。進(jìn)一步的，所述反滲透膜的截留分子量為60，納濾膜截留分子量為600，納濾膜過濾流量為45升/分，壓力1.5MPa，得到納濾透過液。
[0012]進(jìn)一步的，所述的低分子有機(jī)醇為甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，所述的低分子有機(jī)酸為甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
[0013]進(jìn)一步的，所述強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂為苯乙烯系大孔型或凝膠型樹脂。
[0014]進(jìn)一步的，步驟(C)中，上柱流速為l_2BV/h，樹脂預(yù)處理成氫型，PH值為5，柱床的長徑比為4一2:1。
[0015]進(jìn)一步的，在上述步驟(e)中，減壓濃縮的溫度為40°C—80°C，優(yōu)選50°C。
[0016]進(jìn)一步的所述低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸的濃度為90-100%，為與水的溶液。
[0017]實(shí)施例:
1、切分:將2公斤鮮栝樓用水清洗干凈后，再用切碎機(jī)切碎；
2、皮瓤籽分離:用膠棒軟分離機(jī)和兩道分離機(jī)組進(jìn)行一次和二次分離，使皮和瓤和籽徹底分開；
3、發(fā)酵:栝樓瓤中接入0.2% — 0.3%的乳酸桿菌，密閉發(fā)酵18天；
4、分離:發(fā)酵結(jié)束升溫至70°C，滅菌1.5小時(shí)，過濾；
5、澄清:將濾液合并，依次過0.2微米的微濾膜和5000分子量超濾膜澄清，微濾膜可采用KOCH公司生產(chǎn)的4.3’ SuperCorHFMl80管式膜元件，超濾膜可采用8338卷式膜元件，進(jìn)料的流量為100升/分，過濾壓力為1.5MPa，先后除去固形不溶物和大分子類雜質(zhì)，得到超濾清液；
6、納濾:超濾清液先用截留分子量為60的反滲透膜脫水，再用截留分子量為600的納濾膜濃縮，流量為45毫升/分，壓力1.5MPa，得到納濾透過液；
7、PH值調(diào)節(jié):納濾透過用氨水調(diào)節(jié)PH值至3.5 ；
8、上柱:將D61大孔型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂預(yù)處理成氫型，PH為5，柱床的長徑比為4:1,將調(diào)節(jié)好的PH為3.5的濾液以2BV/h流速上柱，使之全部通過2升陽離子交換樹脂后，用2升水洗樹脂柱，BV/h指單位時(shí)間水或液體中一個(gè)質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)的距離；
9、洗脫:用1.0N氨水等度洗脫，洗脫劑流速lBV/h，洗脫終點(diǎn)為洗出液茚三酮反應(yīng)為陰性，收集茚三酮反應(yīng)陽性部分約2升；
10、濃縮:將洗脫液用單效降膜蒸發(fā)器減壓濃縮至1/3體積，濃縮溫度采用60°C；
11、脫色:將濃縮液用活性炭脫色，使?jié)饪s液無色；
12、結(jié)晶:在脫色液中加入質(zhì)量濃度為90%的乙醇析晶，經(jīng)高效液相檢測(cè)，得到L-瓜氨酸白色結(jié)晶產(chǎn)品，過濾干燥后得到瓜氨酸含量為85.5%的產(chǎn)品，產(chǎn)率為栝樓瓤重量的1.5% ；
13、精制:將上述85.5%瓜氨酸產(chǎn)品用水溶解后，再用95%乙醇重結(jié)晶，得到98.5%的純度瓜氨酸。
[0018]鑒別所得產(chǎn)品是瓜氨酸的方法如下:
取白色結(jié)晶廣品0.1克加水定溶到100暈升；
1、取上述溶液5ml，加入1ml，1%茚三酮溶液，水浴加熱3分鐘，產(chǎn)生紫紅色；
2、取上述溶液2ml，加入4ml濃鹽酸和0.5ml，3% 二乙酰一肟加熱，產(chǎn)生桔黃色；
3、取上述溶液2ml，加入1ml于10ml乙醇中含有2%的對(duì)二甲替基苯甲醛混合溶液，和1ml濃鹽酸，產(chǎn)生黃綠色；
依次通過上述三種方法，可鑒別得到所制得的產(chǎn)品為瓜氨酸。經(jīng)檢測(cè):產(chǎn)品的熔點(diǎn)為201.2— 202.0 ;旋光率24.9°，而L-瓜氨酸的熔點(diǎn)為201_203°C ;旋光率[a]D2°+24.5—+26.5° (8克/100毫升6NHCL)，因此，通過本發(fā)明方法制得的產(chǎn)品是L-瓜氨酸。
[0019]瓜氨酸含量測(cè)定方法:
由于L-瓜氨酸無紫外吸收和熒光發(fā)射特性，因此要提高L-瓜氨酸分析檢測(cè)的靈敏度和分離選擇特性，通常將L-瓜氨酸衍生后進(jìn)行定量分析。本發(fā)明中采用的就是上述方法測(cè)定從天然西瓜中提取制得的L-瓜氨酸含量，采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)柱前衍生化法J，將L-瓜氨酸衍生后用HPLC進(jìn)行定量分析。具體方法如下:
衍生化方法:精密稱取瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0500g，用去離子水溶解并定容(定容到25ml)。準(zhǔn)確吸取配好的標(biāo)準(zhǔn)品1ml，放入1ml棕色容量瓶中，加入配制好的Na⑶3_NaHC03緩沖液Iml ( 0.5mol/l、PH為9.0)，再加入Iml的2，4-二硝基氟苯乙腈溶液后搖勻，60°C水浴加熱Ih后，用K2HP04-KH2P04緩沖液定容至1ml (0.lmol/l、PH為7.0)，樣品溶液的衍生化方法與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同，只是將Iml的標(biāo)準(zhǔn)品換為Iml的樣品溶液。
[0020]分析方法:使用大連依利特公司C-18色譜柱(250mm*4.6mm),流動(dòng)相A為乙腈水B為含N，N- 二甲基甲酰胺的0.05mol/lNaAC-HAC緩沖溶液，進(jìn)樣量5ul.A:B=25%: 75%，流速lml/min。
[0021]在詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)的人士可清楚地了解，在不脫離上述申請(qǐng)專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍，且本發(fā)明亦不受限于說明書中所舉實(shí)例的實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1.栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，以鮮栝樓瓤為原料，其特征在于:包括以下步驟: (a)將鮮栝樓瓤接入乳酸桿菌，在溫度18— 35°C發(fā)酵15-40天生物轉(zhuǎn)化后滅菌，過濾后得到濾液； (b)將濾液微濾、超濾、脫水、納濾，得到納濾透過液； (c)將納濾透過液調(diào)節(jié)PH值至5.0-3.0后通入大孔型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱交換吸附氨基酸； (d)交換吸附完畢后，用氨水對(duì)離子交換柱進(jìn)行等度洗脫，洗脫終點(diǎn)為洗出液茚三酮反應(yīng)為陰性； (e)將洗脫液濃縮、脫氨、脫色； (f)濃縮液用低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸結(jié)晶，過濾干燥后得到瓜氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:步驟(b)中將步驟(a)所得濾液先用微濾膜，再用超濾膜分別進(jìn)行錯(cuò)流膜過濾，得到超濾清液，其中微濾膜的孔徑為0.1-1.0微米，超濾膜的孔徑為10000— 4000分子量，將所得超濾清液先用截留分子量為50— 80反滲透膜濃縮脫水，然后用截留分子量為500—1000納濾膜過濾，得到納濾透過液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:步驟Cd)中交換吸附完畢后，用0.1-1.0N氨水對(duì)離子交換柱進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速為0.5-1.0BV/ho
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:將步驟f中所得的瓜氨酸用水溶解后，再用低分子有機(jī)醇或低分子有機(jī)酸重結(jié)晶，得到純天然瓜氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從植物組織發(fā)酵液中提取L-瓜氨酸的工業(yè)方法，其特征在于:所述的微濾膜孔徑為0.2微米的管式膜，所述的超濾膜孔徑為5000分子量的卷式膜。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從發(fā)酵液中提取L-瓜氨酸的工業(yè)方法，其特征在于:所述反滲透膜的截留分子量為60，納濾膜截留分子量為600，納濾膜過濾流量為45升/分，壓力1.5MPa,得到納濾透過液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的栝樓瓤微生物發(fā)酵提取L-瓜氨酸的方法，其特征在于:所述的低分子有機(jī)醇為甲醇或乙醇或丙醇或丁醇，所述的低分子有機(jī)酸為甲酸或乙酸或丙酸或丁酸。
【文檔編號(hào)】C07C273/18GK104418774SQ201310411791
【公開日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】楊保成, 謝書軒 申請(qǐng)人:安陽天尊生物工程有限公司