白介素-6的結(jié)合成員的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供結(jié)合白介素-6(IL-6)和中和其生物學(xué)作用的結(jié)合成員，如人抗體分子。本發(fā)明還提供IL-6的結(jié)合成員在醫(yī)療，例如治療與IL-6有關(guān)的炎性疾病和腫瘤中的應(yīng)用。
【專利說明】白介素-6的結(jié)合成員
[0001]本申請是2007.11.28提交的0吧00780044214.7，題為“白介素-6的結(jié)合成員”的
分案申請。
[0002]本發(fā)明涉及抑制IL-6的生物學(xué)作用的結(jié)合成員，特別是抗體分子。該結(jié)合成員可用于治療與IL-6有關(guān)的疾病，包括炎性疾病和腫瘤。
[0003]白介素6(IL_6)是各種細(xì)胞類型，包括刺激的成纖維細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的26kDa多效促炎細(xì)胞因子，它們構(gòu)成了 IL-6的主要體內(nèi)來源。細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成骨細(xì)胞和幾種其它細(xì)胞受刺激后可產(chǎn)生IL-6。IL-6也由腫瘤細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞，例如肺癌、前列腺癌、骨髓瘤、腎上腺樣瘤和心臟粘液瘤的細(xì)胞表達(dá) [I, 2]。在非炎癥條件下，IL-6由脂肪組織分泌[3]。
[0004]IL-6表達(dá)的調(diào)節(jié)取決于產(chǎn)生它的細(xì)胞。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，IL-6似乎以正反饋環(huán)路起作用-刺激細(xì)胞生長和產(chǎn)生更多的IL-6 [4，5]。在其它細(xì)胞類型中，IL-6似乎能抑制細(xì)胞的生長和激活，并可用作一些促炎細(xì)胞因子的負(fù)調(diào)節(jié)物。
[0005]為了啟動細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，IL-6以低親和力結(jié)合跨膜受體IL-6受體a (也稱為 IL-6Ra、11-61^、11-61?4口80或0)126)，形成 〃IL_6:1L_6Ra〃 復(fù)合物。這種復(fù)合物與 gpl30 信號受體結(jié)合；IL-6Ra和gP130 —起形成高親和IL-6結(jié)合位點，并誘導(dǎo)形成由IL-6、 IL-6Ra和gpl30各兩拷貝組成的六聚體[6]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不需要IL_6Ra的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，因為IL-6Ra也存在可溶分泌形式(SIL-6R或sIL-6Ra)?？扇苁荏w由IL_6Ra信使的差異剪接或蛋白質(zhì)水解脫落產(chǎn)生。SIL-6R能夠與IL-6形成配體-受體復(fù)合物〃IL-6:sIL-6Ra〃。 這種復(fù)合物可結(jié)合細(xì)胞上的gpl30，從而在gpl30陽性細(xì)胞中啟動細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，即使這些細(xì)胞不表達(dá)IL-6Ra。因此，SIL-6R具有加寬IL-6響應(yīng)性細(xì)胞的范圍的潛能，認(rèn)為它在 IL-6-介導(dǎo)的炎癥中起到重要作用[7]。
[0006]人IL-6配體的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明[6]。也已得到了人IL_6Ra胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)[8]和IL-6/IL-6R/gpl30復(fù)合物的六聚體結(jié)構(gòu)[9]。將這些結(jié)構(gòu)與誘變`研究相結(jié)合后，在IL-6表面上鑒定到參與IL-6與各種受體組分形成復(fù)合物的功能活性的三個位點。位點I殘基參與IL-6和IL-6Ra的相互作用。位點2殘基參與IL-6和gpl30細(xì)胞因子結(jié)合域的相互作用。IL-6的位點3殘基參與與六聚體復(fù)合物中第二個gpl30的Ig-樣結(jié)構(gòu)域的相互作用。也已鑒定到IL-6上的第四個位點，在該位點上IL-6與IL-6/IL-6R/gpl30六聚體復(fù)合物中的第二個IL-6分子相互作用[10]。
[0007]已經(jīng)分離到許多抗-1L-6配體單克隆抗體。已經(jīng)進(jìn)行作圖研究，研究顯示它們結(jié)合于人IL-6表面上如上所述的不同結(jié)合位點[11，12，13，14，15]。
[0008]也已產(chǎn)生許多抗-1L_6Ra單克隆抗體，對它們在IL_6Ra上的結(jié)合位點繪圖 [16，14，15，17]。
[0009]IL-6屬于細(xì)胞因子家族，該家族包括白介素-1 I (IL-11)、睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(CNTF)、制瘤素M(OsM)、白血病抑制因子(LIF)、心肌營養(yǎng)素樣細(xì)胞因子(CLC)和心肌營養(yǎng)素l(CT-l)。該家族的各成員具有其自身的特定受體a亞基，并與共同受體亞基gpl30 形成復(fù)合物。對胚胎而言，靶向破壞gpl30基因是致死性的[18，19]。所有IL-6家族成員均可誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)急性期蛋白質(zhì)。
[0010]IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括通過JAK家族激酶的酪氨酸磷酸化，接著激活兩種主要的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，即SHP2/ERK MAPK和STAT1/3通路，通過NF-1L-6和AP-1導(dǎo)致基因表達(dá)[18，20]。[0011]IL-6顯示出廣譜生物學(xué)功能，包括:造血、誘導(dǎo)急性期反應(yīng)、T細(xì)胞激活、刺激抗體分泌、抵御感染的宿主防御、骨髓瘤細(xì)胞和破骨細(xì)胞激活[21，22]。有關(guān)IL-6效應(yīng)的綜述參見參考文獻(xiàn)[23]。IL-6最初鑒定為T細(xì)胞產(chǎn)生的B細(xì)胞分化因子[24]，但隨后鑒定為許多細(xì)胞類型的強效激活物和生長促進(jìn)因子。它誘導(dǎo)B細(xì)胞最終成熟為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，是T 細(xì)胞活化和增殖的必需輔助因子。研究證明，IL-6參與了自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的活化以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖和分化。已證明，IL-6作為輔因子參與了造血過程，引起造血干細(xì)胞的活化和分化。IL-6對急性期反應(yīng)的作用也有記錄[25]。IL-6誘導(dǎo)人肝細(xì)胞產(chǎn)生各種急性期蛋白質(zhì)，包括纖維蛋白原、a-抗-糜蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A和C-反應(yīng)性蛋白質(zhì)。急性期蛋白質(zhì)控制免疫應(yīng)答和炎癥，并對組織重建有影響。在各種疾病中，IL-6的血清水平與C反應(yīng)性蛋白質(zhì)的血清水平良好相關(guān)，這提示IL-6在急性期反應(yīng)中的病因作用。 也已證明，IL-6可由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，似乎參與破骨細(xì)胞活化和骨再吸收[26，27，28]。自相矛盾的是，提示IL-6不僅可用作促炎細(xì)胞因子，而且在某些情況和細(xì)胞類型中可削弱其它促炎細(xì)胞因子的作用，導(dǎo)致炎癥減輕。
[0012]由于IL-6具有多種生物學(xué)作用，所以IL-6水平升高可能是各種疾病病癥中的關(guān)鍵細(xì)胞因子。已證明，在多種疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、卡斯特爾曼代病(Castleman’ s disease)、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病[29]中循環(huán)IL_6水平升高。因此，IL_6參與驅(qū)動這些炎性病癥的病理。而且，已證明IL-6能刺激多種腫瘤類型，包括黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏肉瘤、卵巢癌、淋巴瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤和前列腺癌[30]。另外，已報道在若干癌癥中IL6循環(huán)水平升高。在一些癌癥病癥中，IL-6水平升高已用作該疾病的預(yù)后指標(biāo)。
[0013]由于IL-6在疾病中的作用，已經(jīng)開發(fā)了多種鼠和嵌合抗-人IL-6單克隆抗體作為潛在療劑。
[0014]US5856135描述衍生自小鼠單克隆抗體〃SK2〃的IL-6的重構(gòu)人抗體。
[0015]JP-10-66582報道IL-6的嵌合抗體，它能夠識別IL-6的螺旋D區(qū)(位點I)。
[0016]W02004/020633 (EP1536012)記載了用噬菌體展示技術(shù)分離的IL-6的人scFv抗體分子。據(jù)報道，scFv的親和力為13nM。
[0017]鼠抗-1L-6抗體艾思莫單抗(elsilimomab)(也稱為B-E8)已經(jīng)用于治療多發(fā)性骨髓瘤[31，32]、腎細(xì)胞癌[33]和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[34]患者，在所治療的所有三種疾病的患者中觀察到某些診斷標(biāo)記有改進(jìn)。BE-8也已用于治療HIV-陽性的免疫母細(xì)胞或多形大細(xì)胞淋巴瘤[35]患者，在約50%患者中全身癥狀(即發(fā)熱、發(fā)汗、惡病質(zhì))緩解和淋巴瘤的自發(fā)生長受抑制。
[0018]然而，此種抗體的快速清除和由于對艾思莫單抗產(chǎn)生人抗-小鼠抗體(HAMA)而可能引起過敏反應(yīng)限制了它的臨床應(yīng)用[36]。
[0019]通常，鼠單克隆抗體的臨床應(yīng)用受限，因為這種抗體常常誘導(dǎo)HAMA。常常對小鼠免疫球蛋白的Fe部分產(chǎn)生HAMA，導(dǎo)致抗-1L-6mAb快速清除和可能的過敏反應(yīng)[36]。也知道，小鼠抗體在人體中的藥代動力學(xué)特性不同于人抗體，其半衰期較短，清除率提高。
[0020]為了降低鼠抗體在人體內(nèi)的免疫原性，構(gòu)建具有小鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。已經(jīng)用嵌合的人-小鼠抗-1L-6抗體cCLB8(稱為CNT0328)治療多發(fā)性骨髓瘤患者 [5，37]，在大部分患者中觀察到疾病穩(wěn)定下來。
[0021]然而，雖然嵌合抗體的免疫原性低于鼠MAb，但已報道人抗-嵌合抗體(HACA)反應(yīng)
[38]。
[0022]對cCLB8進(jìn)行作圖研究，該研究顯示，它是IL-6活性的位點I抑制劑。Brakenhoff 等[39]證明，cCLB8能結(jié)合IL-6氨基端缺失變體Pro46、Ser49、Glu51、Ile53、Asp54,也能結(jié)合缺失變體Asp62和Met77(雖然親和力降低)。同一作者證明，在B9細(xì)胞增殖實驗中 cCLB8抑制野生型IL-6，但不抑制C末端缺失5，cCLB8不結(jié)合最后4個C末端氨基酸殘基缺失的IL-6del C-4。這些數(shù)據(jù)表明，cCLB8結(jié)合包含IL-6的C末端殘基的表位。
[0023]Kalai 等[17]證明，cCLB8 無法識別 IL-6 突變體 F106E、F102E/F106E 或 R207E/ R210E。然而，該抗體能識別IL-6突變體R207E和R207W。cCLB8與突變體R207W和R207E 的結(jié)合性能約為野生型的50%，這表明殘基F106和R210參與了 cCLB8結(jié)合表位，殘基R207 參與結(jié)合但影響低于殘基F106和R210。cCLB8結(jié)合IL-6位點-1突變體R196M、K199N/ Q203L和Q203L，與野生型相比其活性為100%。Brakenhoff等[13]證明，cCLB8結(jié)合以下 IL-6 變體:Q182H、N183K、W185Q、W185G、W185R、T190P、Q182H/Q184P、W185R/S197N、Q187E/ T190P、I164L/L186R/M189I，這并不令人驚訝，因為其中大部分與IL-6位點I殘基相隔甚遠(yuǎn)。
[0024]使用人源化的抗-1L_6Ra抗體托珠單抗(也稱為hPM_l、MRA和Actemra)進(jìn)一步強調(diào)了在癌癥和炎性疾病中抑制IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的有利作用。這是人源化的鼠抗_IL6Ra抗體PM-1。用這種抗體治療患者對多種疾病有效，這些疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病、骨髓增殖性疾病、卡斯特爾曼代病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[40]。
[0025]我們已經(jīng)成功地分 離到IL-6的高效、高親和力結(jié)合成員。由于本發(fā)明結(jié)合成員親和力和功效高，以及在本文所述功能研究中的性能，所以本發(fā)明結(jié)合成員特別適用于人體或動物體的治療性和診斷性治療。
[0026]結(jié)合成員可用于治療與IL-6有關(guān)的疾病，如本文其它地方詳述。
[0027]與現(xiàn)有方法相比，用于治療炎性疾病和癌癥的人抗-1L-6抗體具有顯著優(yōu)點。例如，與非人或嵌合抗體相比，人抗體不誘導(dǎo)HAMA或HACA反應(yīng)并且體內(nèi)半衰期較長。
[0028]我們也認(rèn)識到，與IL_6Ra的結(jié)合成員相比IL_6結(jié)合成員具有顯著優(yōu)點，特別是在體內(nèi)給藥和治療方面，如本文其它地方所述。
[0029]如實施例部分更詳細(xì)描述的，我們分離含有如表7所示一組CDR序列的親代抗體分子(CAN022D10)。通過優(yōu)化，我們產(chǎn)生了一組抗體克隆:抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、
18、19、21、22和23，⑶R序列衍生自親代⑶R序列且在表7所示位置上含有取代。
[0030]因此，例如，從表7可觀察到，抗體2具有Kabat殘基35被Thr取代的親代HCDRl 序列(SEQ ID NO:13)?？贵w14和22在HCDR3中含有額外殘基，即氨基酸插入:在Kabat殘基100D處含有He，親代HCDR3序列SEQ ID NO: 5中沒有這個殘基?？贵w7、8、10、16_19、21 和23的LCDR3中不含Kabat殘基95，而親代LCDR3 (SEQ ID NO: 10)在Kabat殘基95上含有 Pro。所有抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和 23 的親代 HCDR3 和 HCDR3 序列均在Kabat殘基95上含有Trp，在Kabat殘基101上含有Asp，這表明H95Trp和HlOIAsp 可能促進(jìn)本發(fā)明結(jié)合成員對IL-6的結(jié)合和/或功效。
[0031]親代抗體0六腸22010和本文所述抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和 23的VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域和CDR序列見所附序列表。
[0032]如下文所詳述，本發(fā)明結(jié)合成員能夠高效地中和IL-6。中和表示抑制IL-6的生物學(xué)活性。本發(fā)明的結(jié)合成員可以中和IL-6的一種或多種生物學(xué)活性。被抑制的生物學(xué)活性一般是IL-6與一種或多種其結(jié)合伙伴結(jié)合。例如，被抑制的生物學(xué)活性可以是IL-6與跨膜和/或可溶性IL-6Rci的結(jié)合。這在以下試驗中得到證實，這里簡單描述了這些試驗， 其詳述見下文:TF-1試驗證明，本發(fā)明結(jié)合成員抑制IL-6與膜IL-6Ra的結(jié)合，因為TF-1細(xì)胞似乎不產(chǎn)生可溶性IL_6Ra。同樣，本發(fā)明結(jié)合成員抑制IL-6與膜受體的結(jié)合。在滑膜成纖維細(xì)胞試驗中，本發(fā)明結(jié)合成員抑制IL-6與可溶性IL-6Ra的結(jié)合，因為需要將sIL_6Ra 加入該試驗中它才能起作用。加入的IL-1 ^誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)源性IL-6，被本發(fā)明結(jié)合成員抑制時能防止產(chǎn)生VEGF。
[0033]按照本發(fā)明，人或非人靈長動物如短尾猴的IL-6與IL-6Ra的結(jié)合可被抑制，例如結(jié)合成員可抑制成熟的人IL-6與IL_6Ra的結(jié)合。
[0034]可以部分或完全抑制生物學(xué)活性。與不存在結(jié)合成員時的活性相比，結(jié)合成員可以將IL-6生物學(xué)活性抑制100%，或至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少 70%、至少60%或至少50%。
[0035]可測定結(jié)合成員的中和效力。除非另有表述，效力通常表示為以nM計的IC5tl值。 在功能試驗中，IC5tl是將生物學(xué)反應(yīng)從其最高值降低50%的結(jié)合成員濃度。在配體結(jié)合研究中，IC5tl是使配體-受體復(fù)合物形成水平降低最大特異性結(jié)合水平的50%的濃度?？赏ㄟ^繪制最高生物學(xué)反應(yīng)％與log(結(jié)合成員濃度)的函數(shù)圖，利用諸如圖墊公司(GraphPad) 的Prism或起源實驗室(Origin Labs)的Origin等軟件程序來計算IC5tl,從而能根據(jù)數(shù)據(jù)擬合S形函數(shù)以產(chǎn)生IC5tl值?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知或本文所述或述及的一種或多種試驗測定或檢測效力。
[0036]在本文所述試驗，如TF-1增殖試驗或其它下述細(xì)胞試驗中結(jié)合成員中和IL-6活性表明該結(jié)合成員能結(jié)合和中和IL-6?？捎糜跍y定結(jié)合成員與IL-6的結(jié)合的其它方法包括ELISA、Western印跡、免疫沉淀、親和層析和生化實驗。
[0037]本文所述結(jié)合成員能夠結(jié)合和中和內(nèi)源性人IL-6的生物學(xué)作用，如本文實施例1.7和2.7中所報道的抑制人滑膜成纖維細(xì)胞響應(yīng)內(nèi)源性人IL-6而釋放VEGF的試驗所證實的。在本試驗中，來自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞響應(yīng)IL-1P和可溶性 IL-6R a刺激產(chǎn)生IL-6，導(dǎo)致IL-6誘導(dǎo)的VEGF分泌。因此，人滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6 代表內(nèi)源性人IL-6。內(nèi)源性IL-6是對人進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療的分子靶點，因此中和內(nèi)源性IL-6 是結(jié)合成員治療潛能的重要指標(biāo)。由于利用獲自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行該試驗，所以結(jié)果與使用結(jié)合成員治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特別相關(guān)。VEGF釋放試驗中檢測的優(yōu)化抗體分子的中和效力超過了已知的抗IL-6抗體CNT0-328。
[0038]在用0.6pM人IL-1 ^和2.4nM可溶性人IL-6R a刺激的人滑膜成纖維細(xì)胞釋放 VEGF的抑制試驗中本發(fā)明結(jié)合成員的IC5tl可能小于50nM，例如小于5nM，例如小于InM。
[0039]已知內(nèi)源性IL-6是糖基化和非糖基化形式的混合物。在滑膜成纖維細(xì)胞試驗中證明了本發(fā)明結(jié)合成員與內(nèi)源性IL-6的結(jié)合，因為該試驗利用人滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的 IL-6，即內(nèi)源性IL-6。
[0040]本發(fā)明結(jié)合成員可抑制IL-6誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖。TF-1是從紅白血病患者建立的人早幼粒細(xì)胞系(premyeloid cell line) (Kitamura等，1989)。TF-1細(xì)胞系的存活和增殖需要存在生長因子。TF-1細(xì)胞可響應(yīng)的各生長因子包括IL-6、GM-CSF和制瘤素M。 在抑制TF-1細(xì)胞對20pM人IL-6起反應(yīng)而增殖的試驗中，本發(fā)明結(jié)合成員的IC5tl可能小于 IOOnM,例如小于 20nM、10nM 或 InM，例如小于 100pM、70pM、50pM、40pM、30pM、20pM 或 10pM。 如本文所述(參見實施例1.5)，已證明親代IgG〃CAN022D10〃在TF-1增殖實驗中的IC5tl為約93nM，我們隨后產(chǎn)生效力顯著提高的CAN022D10的優(yōu)化變體(IC5tl通常小于IOOpM)，如實施例2.2,2.5和2.6所示(分別為表3、4和5)。尤其是一些優(yōu)化克隆的IC5tl值檢測為低至5pM或更低，例如種系化的IgG抗體7、抗體17和抗體18，這表示這些抗體的中和效力極聞。
[0041]本發(fā)明結(jié)合成員可抑制IL-6誘導(dǎo)的B9細(xì)胞增殖。B9細(xì)胞是根據(jù)對IL_6的特異性應(yīng)答選擇的鼠B-細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系B13.29的亞克隆。B9細(xì)胞的存活和增殖需要IL-6， 對極低濃度的IL-6起反應(yīng)。因此，可評估IL-6抗體存在下這些細(xì)胞的增殖，并測定抗體的親和力。本文所述實施例2.10證明，抗體18能抑制B9細(xì)胞響應(yīng)于IL-6的增殖，并在此實驗中顯不聞未和力。
[0042]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中產(chǎn)生的自身抗體主要是IgM類型的抗體。SKW6.4是分泌IgM的克隆的人類淋巴母細(xì)胞B細(xì)胞系。用IL-6刺激后，這些細(xì)胞分泌IgM，因此認(rèn)為該實驗與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有關(guān)?？赏ㄟ^測定對IL-6起反應(yīng)而分泌IgM的抑制，利用SKW6.4細(xì)胞測定結(jié)合成員中和IL-6的功效。在抑制對IOOpM人IL-6起反應(yīng)而分泌IgM的SKW6.4細(xì)胞測定中，本發(fā)明結(jié)合成員的IC5tl可以小于IOpM,例如小于5pM。已證明在該實驗中抗體18能中和IL-6的作用-參見實施例2.11 (表9)。
[0043]本發(fā)明提供人IL-6的高親和結(jié)合成員。也顯示與短尾猴的IL-6的高親和力。本發(fā)明結(jié)合成員可結(jié)合人IL-6和/或短尾猴IL-6，其Kd不超過InM，例如不超過100pM、50pM、 30pM或10pM?？赏ㄟ^表面等離振子共振,例如BIAcore?測定Kd。利用BIAcore?測定親和力的方法如本文實施例2.9所述。明顯的是，發(fā)現(xiàn)抗體7和18的親和力超過利用BIAcore? 設(shè)備的測量極限，因此表明Kd值低于10pM。
[0044]如本文它處所述，表面等離振子共振包括使分析物在液相中流過與支持物相連的配體，并測定分析物與配體之間的結(jié)合情況。例如，可使得IL-6在液相中流過與支持物相連的結(jié)合成員來實施等離振子共振?？蓪⒈砻娴入x振子共振數(shù)據(jù)擬合至單價分析物數(shù)據(jù)模型。可采用`單價分析物數(shù)據(jù)模型通過表面等離振子共振測定速度常數(shù)之比kd/ka，由該速度常數(shù)之比計算親和力常數(shù)Kd。
[0045]或者，可通過席爾德(Schild)分析計算結(jié)合成員與IL-16的親和力，例如根據(jù)抑制TF-1細(xì)胞對不同濃度人IL-6起反應(yīng)而增殖的實驗。經(jīng)過席爾德分析計算，本發(fā)明結(jié)合成員的親和力可小于IOpM,例如小于lpM。如本文實施例2.10所報道,通過席爾德分析計算的抗體18與人IL-6的親和力為0.4pM。
[0046]任選地，本發(fā)明結(jié)合成員可不與以下一種或多種、或者全部物質(zhì)交叉反應(yīng):白血病抑制因子(LIF)、睫狀節(jié)神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)因子(CNTF)、IL-1l或制瘤素M。[0047]任選地，本發(fā)明結(jié)合成員可不與大鼠IL-6、小鼠IL-6和/或犬IL_6交叉反應(yīng)。
[0048]可在(例如)抑制人IL-6與支持物上固定的結(jié)合成員結(jié)合的時間分辨熒光實驗， 如實施例16所述的DELFIA?表位競爭實驗中檢測結(jié)合成員結(jié)合其它蛋白質(zhì)或非人IL-6 的交叉反應(yīng)性。例如，在抑制標(biāo)記人IL-6與支持物上固定的結(jié)合成員結(jié)合的時間分辨熒光實驗中，可能1正、0見^、11-11、制瘤素1大鼠IL-6和小鼠IL-6中任何一個或全部均不顯示抑制、小于50%抑制，或者IC5tl大于0.5mM或大于ImM。例如，在檢測交叉反應(yīng)性的時間分辨熒光實驗中，可能1正、0見^、11-11、制瘤素1大鼠IL-6和小鼠IL-6中任何一個或全部均不顯示抑制，或者IC5tl比未標(biāo)記人IL-6高至少10倍或100倍。在該實驗中，以與結(jié)合成員相互作用的Kd相等的終濃度使用標(biāo)記的成熟野生型人IL-6。
[0049]本發(fā)明結(jié)合成員可與短尾猴IL-6交叉反應(yīng)。在上述時間分辨熒光實驗中，通過標(biāo)記人IL-6與支持物上固定的結(jié)合成員結(jié)合的抑制，測定交叉反應(yīng)性。例如，在此時間分辨的熒光實驗中，短尾猴IL-6的IC5tl可以小于5nM，例如小于2.5nM，例如約InM。在此實驗中，短尾猴IL-6的IC5tl與未標(biāo)記人IL-6的IC5tl的差異可以小于10倍,例如小于5倍。
[0050]材料和方法章節(jié)提供了測定交叉反應(yīng)性的時間分辨熒光實驗的詳細(xì)方案。本實驗獲得的交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)的例子見實施例1.6的表2。
[0051]如實施例2.8所報道，本文所述結(jié)合成員與短尾猴IL-6有高交叉反應(yīng)性，而與大鼠、小鼠或犬IL-6無交叉反應(yīng)性或交叉反應(yīng)性有限。
[0052]交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)表明，本文所述結(jié)合成員結(jié)合在人和短尾猴IL-6序列之間保守，而與人序列相比在小鼠、大鼠和犬IL-6序列中不同的IL-6表位。
[0053]相信本文所述結(jié)合成員能結(jié)合IL-6的〃位點1〃區(qū)，該區(qū)是與IL-6RCI相互作用的區(qū)域。因此,本發(fā)明結(jié)合成員可競爭性抑制IL-6與IL-6Ra的結(jié)合，從而中和IL_6Ra 介導(dǎo)的IL-6的生物學(xué)作用。
[0054]我們研究了本文所述抗體之一一抗體18結(jié)合在位點I殘基上經(jīng)工程改造產(chǎn)生突變的突變型人IL-6的能力。如實施例3所述，我們鑒定到人IL-6中導(dǎo)致抗體18結(jié)合能力下降的突變，表明這些突變殘基參與了抗體18的識別，并可能形成該抗體結(jié)合的IL-6表位的一部分。
[0055]例如，在抑制標(biāo) 記野生型人IL-6與支持物上固定的抗體18結(jié)合的時間分辨熒光實驗中，用Arg207Glu突變型人IL_6(SEQ ID NO:177)沒有觀察到抑制，這表明抗體18能結(jié)合人IL-6的殘基Arg207。
[0056]由于抗體18和抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、19、21、22和23均衍生自親代抗體CAN22C10，且均具有結(jié)構(gòu)相關(guān)的CDR，預(yù)計所有這些抗體分子能結(jié)合相同或非常相似的重疊表位。因此，也預(yù)計用抗體18獲得的表位作圖結(jié)果能代表CAN22D10，本文所述的另一優(yōu)化抗體。
[0057]本發(fā)明結(jié)合成員可結(jié)合人IL-6的？1^102和/或56^04。本發(fā)明結(jié)合成員也可結(jié)合人IL-6的Arg207。任選地，除結(jié)合Phel02和/或Ser204外，結(jié)合成員還可結(jié)合IL-6分子中的側(cè)接殘基或結(jié)構(gòu)相鄰殘基。按照慣例，殘基編號對應(yīng)于全長人IL-6 (SEQ ID NO: 161)。 然而，可利用成熟的人IL-6測定結(jié)合。通過如下所述的定點誘變測定與IL-6殘基的結(jié)合。
[0058]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知為將結(jié)構(gòu)與活性相聯(lián)系而誘變蛋白質(zhì)的單個氨基酸和多個區(qū)域，該方法用于確定蛋白質(zhì)中與抗體結(jié)合的區(qū)域[41]?？衫媒Y(jié)合和/或中和突變型人IL-6來評估結(jié)合成員是否結(jié)合Phel02、Ser204和/或Arg207。與野生型相比，與突變型 IL-6不能結(jié)合或中和，或結(jié)合或中和作用顯著降低表明結(jié)合成員結(jié)合該突變殘基。
[0059]可以在抑制標(biāo)記的野生型人IL-6與支持物上固定的結(jié)合成員結(jié)合的時間分辨熒光實驗中，利用所選殘基突變的IL-6測定與IL-6殘基的結(jié)合，其中標(biāo)記的野生型成熟人 IL-6的終濃度等于它與該結(jié)合成員相互作用的Kd。實施例3中說明了這種實驗的例子和獲得的競爭數(shù)據(jù)，結(jié)果見表10。當(dāng)突變型IL-6不抑制標(biāo)記的野生型IL-6與結(jié)合成員的結(jié)合時，或者當(dāng)突變型IL-6的IC50大于未標(biāo)記的野生型IL-6時(例如超過10倍或100倍)， 表明突變殘基與結(jié)合成員結(jié)合。[0060]在抑制標(biāo)記的野生型人IL-6與支持物上固定的本發(fā)明結(jié)合成員的結(jié)合的時間分辨熒光實驗中，Phel02Glu 突變型人 IL-6(SEQ ID NO: 175)、Ser204Glu 突變型人 IL-6 (SEQ ID N0:176)和/或Arg207Glu突變型人IL-6(SEQ ID NO:177)可能顯示無抑制，或者其 IC50比野生型人IL-6(SEQ ID NO:165)的IC5tl高100倍，其中標(biāo)記的野生型人IL-6的終濃度等于它與結(jié)合成員相互作用的Kd。
[0061]任選地，本發(fā)明結(jié)合成員可以不結(jié)合和/或中和在殘基Phel02、Ser204和/或 Arg207 處含有突變，例如突變 Phel02Glu、Ser204Glu、Ser204Tyr 和 / 或 Arg207Glu 的突變型人IL-6。突變型人IL-6序列的例子是SEQ ID NO:175_177。因此，本發(fā)明結(jié)合成員可能不抑制一種或多種這些突變型IL-6分子與IL-6Ra的結(jié)合。
[0062]本發(fā)明結(jié)合成員可包含抗體分子，例如人抗體分子。結(jié)合成員通常包含抗體VH和 /或VL結(jié)構(gòu)域。結(jié)合成員的VH和VL結(jié)構(gòu)域也作為本發(fā)明的部分提供。各VH和VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)是互補決定區(qū)(“⑶R”)和構(gòu)架區(qū)(“FR”)。VH結(jié)構(gòu)域包含一組HCDR，VL結(jié)構(gòu)域包含一組IXDR?？贵w分子可包含含有VH⑶R1、⑶R2和⑶R3及構(gòu)架區(qū)的抗體VH結(jié)構(gòu)域?；蛘咂溥€可包含含有VL⑶R1、⑶R2和⑶R3及構(gòu)架區(qū)的抗體VL結(jié)構(gòu)域。VH或VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)包含散布有⑶R的四個構(gòu)架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4，結(jié)構(gòu)如下:
[0063]FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
[0064]本發(fā)明的抗體VH和VL結(jié)構(gòu)域以及CDR的例子見隨附的構(gòu)成本文一部分的序列表。其它⑶R見下文和表7。本文披露的所有VH和VL序列XDR序列、多組⑶R和多組HCDR 及多組IXDR代表著本發(fā)明的諸方面和實施方式。本文所述的“⑶R組”包括⑶R1、⑶R2和 CDR3。因此，一組 HCDR 指 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3，一組 LCDR 指 LCDRl、LCDR2 和 LCDR3。除非另有表述，“⑶R組”包括HCDR和IXDR。本發(fā)明的結(jié)合成員通常是單克隆抗體。
[0065]本發(fā)明的結(jié)合成員可包含非抗體分子內(nèi)的抗原結(jié)合位點，通常由非抗體蛋白質(zhì)支架中的一個或多個⑶R，如一組⑶R提供，下文將進(jìn)一步討論。
[0066]本文描述了包含母體CAN022D10的表7所示親代組⑶R的結(jié)合成員，其中HCDRl是 SEQ ID NO: 3 (Kabat 殘基 31-35)、HCDR2 是 SEQ ID NO: 4 (Kabat 殘基 50-65)、HCDR3 是 SEQ ID NO: 5 (Kabat 殘基 95-102)、LCDRl 是 SEQ ID NO: 8 (Kabat 殘基 24-34)、LCDR2 是 SEQ ID NO: 9 (Kabat 殘基 50-56)和 LCDR3 是 SEQ ID NO: 10 (Kabat 殘基 89-97)。
[0067]本發(fā)明結(jié)合成員可包含本文所述一個或多個⑶R，例如⑶R3，還任選包含⑶Rl和 ⑶R2，從而形成一組⑶R。⑶R或⑶R組可以是親代⑶R或親代⑶R組，或者可以是抗體2、
3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23中任一種的CDR或CDR組，或者可以是其變體， 如本文所述。[0068]例如，本發(fā)明的結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域可包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:120的 LCDR3。
[0069]結(jié)合成員可包含親代抗體或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23 中任何抗體的H和/或L⑶R組，所述H和/或L⑶R組中含有一個或多個氨基酸突變。氨基酸突變是一個氨基酸的取代、缺失或插入。例如，H和/或L⑶R組內(nèi)可能有至多20個， 例如至多12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個突變，如取代。例如，HCDR3中可能有至多6、5、
4、3或2個突變，例如取代，和/或IXDR3中可能有至多6、5、4、3或2個突變，例如取代。任選地，與所述的H和/或IXDR組相比，HCDR3和/或IXDR3可含有一個氨基酸的插入或缺失。例如，取代可以是在抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或23中任何抗體中取代的位置，如表7所示。因此，取代可以任選地發(fā)生在選自下組的Kabat編號上:
[0070]HCDRl 中的 Kabat 殘基 35 ；
[0071 ] HCDR2 中的 Kabat 殘基 M ；
[0072]HCDR3 中的 Kabat 殘基 96、97、98、99、100、100A、100B、100C 和 / 或 102 ；
[0073]LCDRl 中的 Kabat 殘基 34 ；
[0074]LCDR3 中的 Kabat 殘基 89、90、91、92、93、94、96 或 97。
[0075]氨基酸突變可包含表7所示的突變，例如所示氨基酸取代。
[0076]例如，本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基Ile35被Thr或Val取代的親代HCDRl。
[0077]本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基Lys64被Arg取代的親代HCDR2。
[0078]結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含含一個或多個以下突變的親代HCDR3:`[0079]Kabat 殘基 Ala96 被 Glu 取代；
[0080]Kabat 殘基 Asp97 被 Glu 或 Asn 取代；
[0081]Kabat 殘基 Asp98 被 Gly、Glu 或 His 取代；
[0082]Kabat 殘基 His99 被 Gly 或 Thr 取代；
[0083]Kabat 殘基 TyrlOO 被 Pro、Asn、Arg、Trp 或 Ala 取代；
[0084]Kabat 殘基 TyrlOOA 被 Ala、Arg、Thr> Gly、Asn、Pro 或 Ser 取代；
[0085]Kabat 殘基 100B 被 His、Trp> Gin、Pro 或 Thr 取代；
[0086]Kabat 殘基 IlelOOC 被 Ala、Val、His、Tyr 或 Leu 取代；
[0087]Ile 插入 Kabat 殘基 100D ；
[0088]Kabat 殘基 Vall02 被 Leu、His、Met 或 Ile 取代。
[0089]因此，本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基100D是Ile或Kabat殘基 100D不存在的HCDR3。
[0090]本發(fā)明結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基Ala34被Thr取代的親代IXDRl。
[0091]本發(fā)明VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可包含含有一個或多個以下突變的親代IXDR3:
[0092]Kabat 殘基 Gln89 被 Met 或 Ala 取代；
[0093]Kabat 殘基 Gln9O 被 Asn、Ser 或 Ala 取代；
[0094]Kabat 殘基 Ser91 被 Asn、Gly、Ala 或 His 取代；
[0095]Kabat 殘基 Tyr92 被 Trp、Ser > Lys 或 Phe 取代；
[0096]Kabat 殘基 Ser93 被 Leu、Lys> Arg 或 Ala 取代；[0097]Kabat 殘基 Thr94 被 Ala、Gly 或 Pro 取代；
[0098]Kabat 殘基 Pro95 缺失；
[0099]Kabat 殘基 Trp96 被 Gly 取代；
[0100]Kabat 殘基 Thr97 被 Ser 取代。
[0101]因此，本發(fā)明結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基95是Pro或Kabat殘基95 不存在的IXDR3。
[0102]本發(fā)明提供分離的人IL-6結(jié)合成員，其包含一組⑶R:HCDR1、HCDR2、HCDR3、 IXDR1、IXDR2和IXDR3，其中該組⑶R含有來自一組⑶R的22個或更少的氨基酸改變，例如至多 21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1 個改變或無改變，其中:
[0103]HCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:3 ；
[0104]HCDR2含有氨基酸序列SEQ ID NO:4 ；
[0105]HCDR3 含有氨基酸序列 SEQ ID NO: 115 ；
[0106]LCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:8 ；
[0107]LCDR2含有氨基酸序列SEQ ID N0:9 ;和
[0108]LCDR3 含有氨基酸序列 SEQ ID NO: 120。
[0109]氨基酸改變可以是取代、插入或缺失。下面討論可取代的Kabat位置的例子和殘基取代的例子，表7說明一些取代。
[0110]如表7所示，在本文所述不同優(yōu)化抗體之間，HCDR3和IXDR3的長度有差異。相對于CAN022D10的親代⑶R，在一些抗體中觀察到Kabat殘基100至102之間的插入(如表7 所示，Kabat殘基100D)，在其它抗體中觀察到Kabat殘基92至97之間的缺失。Kabat殘基 95的缺失并未與插入同時出現(xiàn)。因此，對較長的12殘基HCDR3序列與較長的9殘基LCDR3 序列組合可能有利，且對較短的11殘基HCDR3序列與較短的8殘基IXDR3序列組合可能有利。
[0111]按照Kabat編號系統(tǒng)，IXDR3的殘基編號為89至97。Kabat編號系統(tǒng)沒有考慮短于9個殘基的LCDR3序列。在本發(fā)明中，結(jié)合成員可能含有短于9個殘基的LCDR3，例如 IXDR3的長度可能是8個殘基，如表7所示。我們將IXDR3的8個殘基分別編號為89、90、 91、92、93、94、96和97。因此，在表7中，缺失出現(xiàn)在Kabat殘基95上。然而應(yīng)理解，缺失的作用是縮短IXDR3序列，原則上認(rèn)為缺失可以在殘基89至97，例如殘基92至97中的任何殘基上發(fā)生。
[0112]在HCDR3中，Kabat編號系統(tǒng)通過在Kabat殘基100和101之間延伸編號系統(tǒng)而能容納⑶R長度變化，例如適當(dāng)?shù)匕埢?00A是9個殘基的HCDR3，加上100B是10個殘基的HCDR3，加上100C是11個殘基的HCDR3，加上100D是12殘基的HCDR3。在表1中， 相對于親代HCDR3在一些優(yōu)化克隆的HCDR3中插入額外氨基酸顯示在Kabat殘基100D處。 然而應(yīng)理解，原則上認(rèn)為這種插入可以在Kabat殘基100至102中的任何位置上發(fā)生。
[0113]如本文所述，結(jié)合成員的一個或多個⑶R，例如HCDR3和/或IXDR3中可能出現(xiàn)一個或多個插入或缺失。例如，本發(fā)明結(jié)合成員可包含抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、 19、21、22和23中任何抗體或其變體(本文所述)的一組⑶R，其中各⑶R任選包含插入以使該CDR延長一個殘基，或者包含一個殘基的缺失以使該CDR縮短一個殘基?？梢栽贖CDRs和/或IXDR，例如HCDR3和/或IXDR3中產(chǎn)生插入和/或缺失。
[0114]例如，結(jié)合成員可包含含有20個或更少的氨基酸取代的一組⑶R，其中:
[0115]HCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:3 ；
[0116]HCDR2含有氨基酸序列SEQ ID NO:4 ；
[0117]HCDR3 含有氨基酸序列 SEQ ID NO: 115 ；
[0118]LCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:8 ；
[0119]LCDR2含有氨基酸序列SEQ ID N0:9 ;和
[0120]LCDR3 含有氨基酸序列 SEQ ID NO: 120 ；
[0121 ] 其中結(jié)合成員任選含有一個殘基的插入以使HCDR3延長一個殘基，或者包含一個殘基的缺失以使HCDR3縮短一個殘基，和/或
[0122]含有一個殘基的插入以使IXDR3延長一個殘基，或者包含一個殘基的缺失以使 LCDR3縮短一個殘基。
[0123]本發(fā)明結(jié)合成員可以在HCDR3SEQ ID NO: 115中包含一個殘基的插入和/或在 LCDR3SEQ ID NO: 120中包含一個殘基的插入。
[0124]插入或缺失可以在⑶R中任何位點上產(chǎn)生。例如，在HCDR3中，插入或缺失可以出現(xiàn)在Kabat殘基95-102的任何位置，例如Kabat殘基100 -102的任何位置上。例如，在 IXDR3中，插入或缺失可以出現(xiàn)在Kabat殘基89至97的任何位置，例如Kabat殘基92至 97的任何位置上。
[0125]本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基35是lie、Thr或Val的HCDR1。
[0126]本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基64是Lys或Arg的HCDR2。
[0127]本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基95是Trp和/或Kabat殘基101 是 Asp 的 HCDR3。
[0128]本發(fā)明結(jié)合成員或VH結(jié)構(gòu)域可包含H⑶R3，其中:
[0129]Kabat 殘基 96 是 Ala 或 Glu ；
[0130]Kabat 殘基 97 是 Asp、Glu 或 Asn ;
[0131]Kabat 殘基 98 是 Asp、Gly、Glu 或 His ；
[0132]Kabat 殘基 99 是 His、Gly 或 Thr ;
[0133]Kabat 殘基 100 是 Pro> Tyr> Asn、Arg、Trp 或 Ala ；
[0134]Kabat 殘基 100A 是 Pro> Tyr> Ala、Arg、Thr、Gly、Asn、Pro 或 Ser ；
[0135]Kabat 殘基 100B 是 Trp、Tyr> His、Gin、Pro 或 Thr ；
[0136]Kabat 殘基 IOOC 是 lie、Ala、Val、His、Tyr 或 Leu ;和
[0137]Kabat 殘基 102 是 Leu、Val、His、Met 或 lie。
[0138]本發(fā)明結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域可包含Kabat殘基34是Ala或Thr的IXDRl。
[0139]本發(fā)明結(jié)合成員或VL結(jié)構(gòu)域可包含IXDR3，其中:
[0140]Kabat 殘基 89 是 Gin、Met 或 Ala ;
[0141]Kabat 殘基 90 是 Gin、Asn、Ser 或 Ala ；
[0142]Kabat 殘基 91 是 Ser、Asn、Gly、Ala 或 His ;
[0143]Kabat 殘基 92 是 Trp、Tyr> Ser、Lys 或 Phe ；
[0144]Kabat 殘基 93 是 Leu> Ser、Lys> Arg 或 Ala ；[0145]Kabat 殘基 94 是 Gly、Thr> Ala 或 Pro ；
[0146]Kabat 殘基 96 是 Gly 或 Trp ;和
[0147]Kabat 殘基 97 是 Ser 或 Thr。[0148]本發(fā)明提供包含親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的 HCDRUHCDR2 和 / 或 HCDR3 和 / 或親代或抗體 2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、 21,22和23中任何抗體的IXDR1、IXDR2和/或IXDR3，例如表1所示的親代或抗體2、3、4、
5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的一組CDR的結(jié)合成員。
[0149]例如，本發(fā)明結(jié)合成員可包含一組CDR:HCDRU HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和 LCDR3，其中:
[0150]HCDRl 是 SEQ ID NO:113 ;HCDR2 是 SEQ ID NO:114 ;HCDR3 是 SEQ ID NO:115 ; LCDRl 是 SEQ ID NO:118 ；LCDR2 是 SEQ ID NO:119 ;和 LCDR3 是 SEQ ID NO: 120，代表抗體 18 的 CDR0
[0151]結(jié)合成員可包含這些抗體之一的一組VH⑶R。其還可任選包含這些抗體之一的一組VL⑶R，所述VL⑶R可以來自與VH⑶R相同或不同的抗體。
[0152]本發(fā)明也提供包含親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的一組HCDR的VH結(jié)構(gòu)域，和/或包含親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、 19、21、22和23中任何抗體的一組IXDR的VL結(jié)構(gòu)域。
[0153]VH結(jié)構(gòu)域通常與VL結(jié)構(gòu)域配對以提供抗體抗原-結(jié)合位點，雖然如下文進(jìn)一步討論的，VH或VL結(jié)構(gòu)域可單獨用于結(jié)合抗原?？贵w2VH結(jié)構(gòu)域可與抗體2VL結(jié)構(gòu)域配對， 從而形成同時包含抗體2VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體抗原-結(jié)合位點。提供了本文所述其它VH 和VL結(jié)構(gòu)域的類似實施方式。在其它實施方式中，抗體2VH與該抗體VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對。本領(lǐng)域熟知輕鏈混雜。本發(fā)明還提供了本文所述其它VH和VL結(jié)構(gòu)域的類似實施方式。
[0154]因此，親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的乂11 可與親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的VL配對。
[0155]結(jié)合成員可以包含在抗體構(gòu)架中具有一個或多個⑶R，例如一組⑶R的抗體分子。 例如，可以將抗體的一個或多個CDR或一組CDR嫁接入構(gòu)架(例如，人構(gòu)架)以提供抗體分子。構(gòu)架區(qū)可以來自人種系基因區(qū)段序列。因此，可以將構(gòu)架種系化(germlined)，從而將構(gòu)架內(nèi)的一個或多個殘基更換以與大多數(shù)相似的人種系構(gòu)架中等價位置處的殘基相匹配。 技術(shù)人員可以選擇序列最接近種系化之前的抗體構(gòu)架序列的種系區(qū)段，并在本文所述試驗中測試該抗體的親和力或活性以證實種系化未明顯降低抗原結(jié)合或效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知人種系基因區(qū)段序列，可通過例如Vbase編譯(軟件)存取。
[0156]本發(fā)明結(jié)合成員可以是具有人種系構(gòu)架區(qū)中包含一組HCDR的VH結(jié)構(gòu)域，例如 Vh3_DP-86_(3-66)的分離的人抗體分子。因此，VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)FR1、FR2和/或FR3可包含人種系基因區(qū)段Vh3_DP-86_(3-66)的構(gòu)架區(qū)，和/或可通過突變構(gòu)架殘基以匹配這種人種系基因區(qū)段的構(gòu)架殘基而種系化。FR4可包含人種系j區(qū)段JH2的構(gòu)架區(qū)。VH FRl的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 167。VH FR2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:168。VH FR3 的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 169。VH FR4的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 170。
[0157]結(jié)合成員通常還具有VL結(jié)構(gòu)域，其包含例如人種系構(gòu)架區(qū)，如Vkl_L12中的一組IXDR。因此，該VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)可包含人種系基因區(qū)段Vkl_L12的構(gòu)架區(qū)FR1、FR2和/或 FR3，和/或可通過突變構(gòu)架殘基以匹配這種人種系基因區(qū)段的構(gòu)架殘基而種系化。FR4可包含人種系j區(qū)段JK2的構(gòu)架區(qū)。VL FRl的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 171。VL FR2的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 172。VL FR3的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 173。VL FR4 的氨基酸序列可以是SEQ ID NO: 174。
[0158]種系化的VL結(jié)構(gòu)域可以在一個或多個微調(diào)殘基(Vernier residue)處種系化或不在一個或多個微調(diào)殘基處種系化，但通常不在一個或多個微調(diào)殘基處種系化。
[0159]本發(fā)明的抗體分子或VH結(jié)構(gòu)域可包含下組重鏈構(gòu)架區(qū):
[0160]FRlSEQ ID NO:167 ；
[0161]FR2SEQ ID NO:168 ；
[0162]FR3SEQ ID NO: 169 ；
[0163]FR4SEQ ID NO: 170 ；
[0164]或者，包含的所述一組重鏈構(gòu)架區(qū)含有1、2、3、4或5個氨基酸改變，例如取代。
[0165]本發(fā)明的抗體分子或VL結(jié)構(gòu)域可包含下組輕鏈構(gòu)架區(qū):
[0166]FRlSEQ ID NO:171 ；
[0167]FR2SEQ ID NO: 172 ；
[0168]FR3SEQ ID NO: 173 ；
[0169]FR4SEQ ID NO:174 ；
`[0170]或者，包含的所述一組輕鏈構(gòu)架區(qū)可含有1、2、3、4或5個氨基酸改變，例如取代。
[0171]氨基酸改變可以是取代、插入或缺失。
[0172]例如，本發(fā)明抗體分子可包含一組重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)，其中:
[0173]重鏈FRl 是 SEQ ID NO: 167 ；
[0174]重鏈FR2 是 SEQ ID NO: 168 ；
[0175]重鏈FR3 是 SEQ ID NO: 169 ；
[0176]重鏈FR4 是 SEQ ID NO: 170 ;
[0177]輕鏈FRl 是 SEQ ID NO:171 ;
[0178]輕鏈FR2 是 SEQ ID NO:172 ；
[0179]輕鏈FR3 是 SEQ ID NO: 173 ;
[0180]輕鏈FR4 是 SEQ ID NO:174 ；
[0181]或者，包含的所述一組重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)含有10個或更少，例如5個或更少的氨基酸改變，例如取代。例如，在所述一組重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)中可以有I或2個氨基酸取代。
[0182]與種系化抗體分子相比，未種系化的抗體分子具有相同的CDR，但構(gòu)架不同。在本文所附序列表的抗體序列中，7、10、17和18號抗體的序列是種系化的?？赏ㄟ^種系化這些抗體中本文所示VH和VL結(jié)構(gòu)域序列的構(gòu)架區(qū)產(chǎn)生種系化抗體2-5、8、14、16、19和21-23。
[0183]這些抗體的表達(dá)的scFv和IgG序列中包含抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、
19、21、22和23的K VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸和氨基酸序列中顯示的3’ cgt密碼子和相應(yīng)的精氨酸殘基。該序列的C末端精氨酸殘基對應(yīng)于Kabat殘基108。下文解釋此殘基的來源和其編碼二聯(lián)體cgt。
[0184]為表達(dá)IgG的輕鏈，提供了編碼抗體輕鏈的核苷酸序列，包含編碼VL結(jié)構(gòu)域的第一外顯子，編碼CL結(jié)構(gòu)域的第二外顯子，將第一外顯子與第二外顯子隔開的內(nèi)含子。在正常情形下，細(xì)胞mRNA加工機制剪接掉內(nèi)含子，從而使第一外顯子的3’端與第二外顯子的5’ 端相連。因此，當(dāng)具有所述核苷酸序列的DNA表達(dá)為RNA時，該第一和第二外顯子剪接在一起。翻譯該剪接的RNA可產(chǎn)生包含VL結(jié)構(gòu)域和CL區(qū)的多肽。
[0185]恒定區(qū)的選擇很重要，因為對K輕鏈而言，橋接氨基酸是Cga密碼子形成的精氨酸，其中第一個胞嘧啶由外顯子I編碼，鳥嘌呤和腺嘌呤由外顯子2編碼。
[0186]剪接后，對抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 和 23 而言，Kabat 殘基 108處的Arg由VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)架4序列的最后一個堿基(c)和CL區(qū)的前兩個堿基(gt)編碼。
[0187]Kabat殘基108處的精氨酸殘基可以認(rèn)為是抗體分子的VL結(jié)構(gòu)域的C末端殘基。
[0188]本發(fā)明的結(jié)合成員可以是與任何結(jié)合成員競爭結(jié)合IL-6的結(jié)合成員，所述任何結(jié)合成員(i)結(jié)合IL-6且(ii)包括本文披露的結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、CDR如 HCDR3 和 / 或 CDR 組。
[0189]不難在體外檢驗結(jié)合成員之間的競爭，例如采用ELISA和/或用特定的報道分子給一種結(jié)合成員作標(biāo)記(可在一種或多種其它未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下檢測)，從而能鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的結(jié)合成員。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難了解這類方法，更詳細(xì)的描述參見本文(參見詳述和實施例中材料和方法章節(jié)的表位競爭實驗)。因此，本發(fā)明另一方面提供含有人抗體抗原-結(jié)合位點的結(jié)合成員，它與抗體分子，例如含有VH和/或VL 結(jié)構(gòu)域，0?例如親代抗體或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的HCDR3或⑶R組的抗體分子競爭結(jié)合IL-6。
[0190]在其它方面，本發(fā)明提供包含編碼本發(fā)明結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的分離核酸，以及制備本發(fā)明結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的方法，包括在致使產(chǎn)生所述結(jié)合成員、VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的條件下表達(dá)所述核酸并回收之。
[0191]本發(fā)明另一方面提供編碼本文披露的VH CDR或VL CDR序列的核酸，通常是分離的。
[0192]另一方面提供含有本發(fā)明核酸或用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0193]本發(fā)明其它方面提供含有本發(fā)明結(jié)合成員的組合物，和它們在結(jié)合、抑制和/或中和IL-6的方法中的應(yīng)用，包括治療人或動物體的方法。
[0194]本發(fā)明的結(jié)合成員可用于治療或診斷方法，例如治療(可包括預(yù)防性治療)人體或動物體(如人患者)的疾病或病癥的方法，該方法包括給予所述患者有效量的本發(fā)明結(jié)合成員?？砂凑毡景l(fā)明治療的病癥包括IL-6在其中起作用的任何病癥，如本文它處詳述的。
[0195]下文進(jìn)一步詳述了本發(fā)明的這些和其它方面。
[0196]術(shù)語
[0197]本文中應(yīng)指出，本文使用“和/或”之處應(yīng)理解成具體公開了兩種所述特征或組分的每一種，包括或不包括另一種。例如，“A和/或B”應(yīng)該理解成具體公開了(i)A、(ii)B 及(iii)A和B中每一種，就如同各自在本文中專門列出一樣。
[0198]IL-6 和 IL-6 受體
[0199]IL-6是白介素6。IL-6在本文中也可稱為〃抗原〃。[0200]人IL-6的全長氨基酸序列是SEQ ID NO:161。在體內(nèi)切割此種序列，以去除N末端先導(dǎo)肽，產(chǎn)生成熟的IL-6。成熟的人IL-6具有氨基酸序列SEQ IDN0:165。成熟序列代表體內(nèi)循環(huán)的IL-6，它是本文所述治療性和體內(nèi)診斷應(yīng)用的靶抗原。因此，在本文中IL-6 通常指成熟的人IL-6，除非另有說明。
[0201]IL-6可偶聯(lián)于可檢測標(biāo)簽，如HIS FLAG，例如用于本文所述的實驗。例如，可使用包含偶聯(lián)于HIS FLAG序列的IL-6的融合蛋白。HIS FLAG標(biāo)記的人IL-6的序列是SEQ ID NO:162。
[0202]IL-6 受體 a，即 IL_6Ra 是白介素 6 的受體。IL_6Ra 也稱為 IL-6R a、IL_6Ra、IL-6R 和CD126。IL-6Ra在體內(nèi)以跨膜形式和可溶形式存在。IL_6Ra可以是跨膜IL_6Ra和/或可溶性IL-6Ra，除非另有說明。
[0203]在本文中，IL-6受體通常指人IL-6受體，除非另有說明。人可溶性 IL-6Ra(sIL-6Ra，sIL_6R)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 163。人跨膜IL_6Ra的氨基酸序列是 SEQ ID NO:164。
[0204]IL-6與IL_6Ra結(jié)合形成復(fù)合物IL-6:1L_6Ra。該復(fù)合物可以是可溶性(與 sIL-6Ra)或膜結(jié)合的(與跨膜IL-6Ra)。當(dāng)IL_6Ra為可溶形式時，該復(fù)合物稱為 IL-6: sIL-6Ra? IL-6:1L_6Ra可包含與跨膜IL_6Ra或與可溶性IL_6Ra形成復(fù)合物的IL-6， 除非另有說明。
[0205]gpl30
[0206]gpl30是IL-6:1L_6Ra復(fù)合物的受體。gpl30的克隆和鑒定方法參見Hibi等， Cell63:1149-1157(1990)。人 gpl30 的序列見 SEQ ID NO: 166。
[0207]結(jié)合成員
[0208]該術(shù)語描述了彼此結(jié)合的一對分子中的一個成員。結(jié)合對的成員可以天然產(chǎn)生或完全或部分合成產(chǎn)生。分子對的成員在其表面具有一定區(qū)域或空腔，從而能與該分子對另一成員的特定空間和極性結(jié)構(gòu)結(jié)合，因此與之互補。結(jié)合對的類型的例子是抗原-抗體、生物素-親和素、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本發(fā)明涉及抗原-抗體型反應(yīng)。
[0209]結(jié)合成員通常包括具有抗原結(jié)合位點的分子。例如，結(jié)合成員可以是抗體分子或含有抗原結(jié)合位點的非抗體蛋白。`
[0210]可通過在例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B等非抗體蛋白質(zhì)支架上排列 CDR[42, 43，44]，或通過使蛋白支架內(nèi)環(huán)的氨基酸殘基隨機化或突變來提供抗原結(jié)合位點， 從而能賦予對所需靶標(biāo)的結(jié)合特異性。Nygren等[44]總結(jié)了用于工程改造蛋白質(zhì)中新型結(jié)合位點的支架?？贵w模擬物的蛋白支架披露于通過引用全文納入本文的W0/0034784，其中發(fā)明人描述了包含具有至少一個隨機化環(huán)的纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(抗體模擬物)?？赏ㄟ^免疫球蛋白基因超家族的任何結(jié)構(gòu)域成員提供要嫁接入一個或多個CDR，例如一組HCDR的合適支架。所述支架可以是人或非人蛋白質(zhì)。非抗體蛋白質(zhì)支架的優(yōu)點之一是其可在至少比一些抗體分子更小和/或更易于操作的支架分子中提供抗原結(jié)合位點。結(jié)合成員的體積小可賦予有用的生理學(xué)特性，例如能進(jìn)入細(xì)胞、更深地穿透入組織或與其它結(jié)構(gòu)內(nèi)的靶標(biāo)反應(yīng)，或結(jié)合于靶抗原的蛋白質(zhì)空腔內(nèi)。WeSS，2004[45]總結(jié)了非抗體蛋白質(zhì)支架中的抗原結(jié)合位點的用途。蛋白質(zhì)通常具有穩(wěn)定的骨架和一個或多個可變環(huán)，其中所述一個或多個環(huán)的氨基酸序列經(jīng)專門或隨機突變從而產(chǎn)生與靶抗原結(jié)合的抗原結(jié)合位點。這些蛋白質(zhì)包含金黃色葡萄球菌(S.aureusM蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連接素、纖連蛋白(例如， 第10個III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)、脂籠蛋白以及Y -晶體和其它Affilin?支架(絲耳蛋白質(zhì)(Scil Proteins))的IgG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域。其它方法的例子包括基于環(huán)肽(cyclotide) 的合成〃微體〃_含有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白質(zhì)，微生物蛋白(Versabodies?，阿繆尼克斯公司(Amunix))和錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPins,分子伙伴公司(Molecular Partners)) ?
[0211]除了抗體序列和/或抗原結(jié)合位點，本發(fā)明的結(jié)合成員可包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽，如折疊域，或賦予該分子除結(jié)合抗原的能力以外的另一種功能特征。本發(fā)明結(jié)合成員可攜帶可檢測標(biāo)記物，或者可與毒素或靶向部分或酶偶聯(lián)(例如，通過肽鍵或接頭)。例如，結(jié)合成員可包含催化位點(例如，在酶結(jié)構(gòu)域中)以及抗原結(jié)合位點，其中所述抗原結(jié)合位點與抗原結(jié)合，因此將催化位點靶向抗原。催化位點可以，例如通過切割來抑制抗原的生物學(xué)功能。
[0212]雖然知道非抗體支架可攜帶⑶R，但本發(fā)明的攜帶⑶R或一組⑶R的結(jié)構(gòu)通常是抗體重鏈或輕鏈序列或其實質(zhì)部分，其中CDR或CDR組位于重排的免疫球蛋白基因編碼的天然產(chǎn)生VH和VL抗體可變區(qū)的⑶R或⑶R組的相應(yīng)位置?？蓞⒖?(&&&丨，等，1987[46]和其更新確定免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)構(gòu)和位置。可通過多個學(xué)術(shù)和商業(yè)在線資源查詢該數(shù)據(jù)庫。例如，參見參考文獻(xiàn)[47]和相關(guān)在線資源，目前可訪問網(wǎng)址http://www.bioinf.0rg.uk/abs/simkab.html。
[0213]通過⑶R區(qū)域或⑶R是要表明Kabat等，1991 [48]和隨后的版本定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的超變區(qū)?？贵w通常含有3個重鏈⑶R和3個輕鏈⑶R。本文利用術(shù)語⑶R 表示(視情形而定)這些區(qū)域中的一個或幾個或甚至全部，這些區(qū)域含有負(fù)責(zé)通過抗體與其識別的抗原或表位的親和力來結(jié)合的大多數(shù)氨基酸殘基。
[0214]在6個短⑶R序列中，重鏈的第三⑶R(HCDR3)的體積可變性較大(主要是因為產(chǎn)生它的基因重排機制而導(dǎo)致差異較大)。其可短至2個氨基酸，雖然已知的最長體積是26。 CDR長度也可按照特定的潛在構(gòu)架區(qū)所能提供的長度變化。功能上，HCDR3在確定抗體特異性方面起部分作用[參考文獻(xiàn)49、50、51、52、53、54、55、56]。
[0215]HCDRl的長度可以是5個氨基酸，由Kabat殘基31_35構(gòu)成。
[0216]HCDR2的長度可以是17個氨基酸，由Kabat殘基50_65構(gòu)成。
[0217]HCDR3的長度可以`是11或12個氨基酸，由Kabat殘基95-102組成，任選包含 Kabat 殘基 100D。
[0218]IXDRl的長度可以是11個氨基酸，由Kabat殘基24_34構(gòu)成。
[0219]LCDR2可以是7個氨基酸長，由Kabat殘基50_56構(gòu)成。
[0220]LCDR3的長度可以是8或9個氨基酸，由Kabat殘基89_97組成，任選包含Kabat 殘基95。
[0221]抗體分子
[0222]該術(shù)語描述了無論天然或部分或完全合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。該術(shù)語還涵蓋包含抗體抗原-結(jié)合位點的任何多肽或蛋白質(zhì)。在本文中必須知道，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，即它們不處于其天然環(huán)境中，但它們能經(jīng)純化從天然來源分離或獲得，或者可通過遺傳重組或化學(xué)合成獲得，它們隨后可含有非天然氨基酸，下文將進(jìn)一步描述。含有抗體抗原_結(jié)合位點的抗體片段包括但不限于:諸如Fab、Fab’、Fab’ _SH、scFv、Fv、dAb、Fd等分子?，F(xiàn)已工程改造包含一個或多個抗體抗原-結(jié)合位點的各種其它抗體分子，包括例如， Fab2、Fab3、雙抗體、三抗體、四抗體和小抗體?？贵w分子及其構(gòu)建和使用方法參見[57]。
[0223]可能利用單克隆抗體或其它抗體并采用重組DNA技術(shù)等技術(shù)來產(chǎn)生結(jié)合靶抗原的其它抗體或嵌合型分子。這些技術(shù)可包括引入編碼免疫球蛋白可變區(qū)，或抗體的CDR，或不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加構(gòu)架區(qū)的DNA。參見，例如EP-A-184187、GB2188638A 或EP-A-239400，和大量的后續(xù)文獻(xiàn)?？蓪Ξa(chǎn)生抗體的雜交瘤或其它細(xì)胞作出遺傳突變或其它改變，從而可改變或不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。
[0224]由于可以多種方式修飾抗體，術(shù)語“抗體分子”應(yīng)理解成涵蓋具有所需特異性，具有抗體抗原-結(jié)合位點和/或能與抗 原結(jié)合的任何結(jié)合成員或物質(zhì)。因此，該術(shù)語涵蓋抗體片段和衍生物，包括含有抗體抗原-結(jié)合位點的任何多肽，而無論其是天然或完全或部分合成的。因此包括包含抗體抗原-結(jié)合位點并與另一多肽(例如，衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類)融合的嵌合型分子，或其等價物。EP-A-0120694和EP-A-0125023 以及大量的后續(xù)文獻(xiàn)描述了嵌合型抗體的克隆和表達(dá)。
[0225]抗體工程改造領(lǐng)域中可用的其它技術(shù)能分離人和人源化抗體。例如，可如 Kontermann和Dubel [58]所述制備人雜交瘤。例如以下許多出版物詳細(xì)描述了產(chǎn)生結(jié)合成員的另一種現(xiàn)有技術(shù)_卩遼菌體展示:Kontermann和Dubel [58]以及W092/01047 (下文進(jìn)一步討論)和美國專利 US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、 US5872215、US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、 US6492160、US6521404。
[0226]可利用轉(zhuǎn)基因小鼠分離人抗體，該小鼠中小鼠抗體基因被滅活并功能性替換為人抗體基因，但小鼠免疫系統(tǒng)的其它組分維持完好[59]。可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)，例如 W091/09967、US5, 585，089、EP592106、US565, 332 和 W093/17105 所述的技術(shù)產(chǎn)生人源化抗體。另外，W02004/006955記載了使抗體人源化的方法，該方法基于:將非人抗體可變區(qū)CDR 序列的經(jīng)典CDR結(jié)構(gòu)類型與人抗體序列，例如種系抗體基因區(qū)段的文庫中相應(yīng)CDR的經(jīng)典 CDR結(jié)構(gòu)類型作比較，以便選擇人抗體基因中的可變區(qū)構(gòu)架序列。具有與非人CDR相似的經(jīng)典CDR結(jié)構(gòu)類型的人抗體可變區(qū)形成一個人抗體序列成員亞組，從中選擇人構(gòu)架序列。還可通過人和非人⑶R序列之間的氨基酸相似性對該亞組成員進(jìn)行排序。在W02004/006955 的方法中，選擇排序靠前的人序列提供構(gòu)架序列，以便利用所選亞組成員人構(gòu)架區(qū)，以非人 CDR對應(yīng)物功能性替代人CDR序列來構(gòu)建嵌合抗體，從而在無需比較非人和人抗體的構(gòu)架序列的情況下提供高親和力和低免疫原性的人源化抗體。也公開了按照該方法制備的嵌合抗體。
[0227]可借助合成的寡核苷酸產(chǎn)生基因，并將該基因裝配在合適的表達(dá)載體中，從而表達(dá)產(chǎn)生合成的抗體分子，如Knappik等[60]或Krebs等[61]所述。
[0228]現(xiàn)已證明完整抗體的片段可執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子是(i)由VL、 VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(iii)由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(iv)由VH或VL結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dAb片段[62，63，64]； (v)分離的⑶R區(qū)域；(vi)F(ab’)2片段，其是包含兩個連接的Fab片段的一種二價片段； (vii)單鏈Fv分子(scFv),其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭相連,從而能連接兩個結(jié)構(gòu)域以形成抗原結(jié)合位點[65，66] ; (viii)雙特異性單鏈Fv 二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)通過基因融合構(gòu)建的“雙抗體”，多價或多特異性片段(W094/13804 ;[67])?？赏ㄟ^包含連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫鍵來穩(wěn)定Fv、scFv或雙抗體分子[68]。還可制備包含與 CH3結(jié)構(gòu)域相連的scFv的小抗體(minibody) [69]。結(jié)合片段的其它例子是Fab’，其與Fab 片段的區(qū)別在于在重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端加入少許殘基，包含抗體絞鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸，以及Fab’ -SH，其是恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶游離巰基的Fab’片段。
[0229]Qui等[70]記載了僅含通過構(gòu)架區(qū)連接的兩個⑶R的抗體分子。將VH或VL結(jié)構(gòu)域的⑶R3連接于其它結(jié)構(gòu)域的⑶Rl或⑶R2環(huán)。通過FR區(qū)將所選⑶Rl或⑶R2的C末端與CDR3的N末端連接。Qui等選擇具有最少疏水性區(qū)域的FR區(qū)。發(fā)現(xiàn)所檢測抗體的最佳組合是通過 VH FR2 連接的 VL CDRl 和 VH CDR3 (VHCDR1-VHFR2-VLCDR3)。分子量約為 3kDa 時，與完整免疫球蛋白分子(約150kDa)或scFv (約28kDa)相比這些抗體分子具有組織穿透性提高的優(yōu)點。 [0230]可由親代抗體分子或抗體分子2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中
的任何抗體開始，通過諸如酶消化，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化和/或通過化學(xué)還原切割二硫橋，獲得本發(fā)明抗體片段。在另一種方式中，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的遺傳重組等技術(shù)，或者借助，例如自動肽合成儀，如應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)等公司提供的那些儀器通過肽合成或通過核酸合成和表達(dá)來獲得本發(fā)明的抗體片段。
[0231]本發(fā)明的功能性抗體片段包括通過化學(xué)修飾，特別是通過PEG化，或通過摻入脂質(zhì)體而增加了半衰期的任何功能性片段。
[0232]dAb (結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單體性抗原結(jié)合片段，即抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū) [64]。VH dAb在駝科動物(例如，駱駝、美洲駝)中天然產(chǎn)生，并可通過用靶抗原免疫駝類動物，分離抗原特異性B細(xì)胞和直接克隆各B細(xì)胞的dAb基因來產(chǎn)生。還可在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生dAb。體積小、溶解性良好和溫度穩(wěn)定性使得它們在生理學(xué)上特別有用，從而適于選擇和親和力成熟。正在開發(fā)的治療用羊駝VH dAb的商品名為〃納米抗體(Nanobody)?"。 本發(fā)明的結(jié)合成員可以是包含基本上如本文所述的VH或VL結(jié)構(gòu)域或包含基本上如本文所述一組⑶R的VH或VL結(jié)構(gòu)域的dAb。
[0233]雙特異性或雙功能抗體構(gòu)成將兩個不同的可變區(qū)組合在同一分子中的第二代單克隆抗體[71]?，F(xiàn)已證明它們因能募集新的效應(yīng)功能或靶向腫瘤細(xì)胞表面的幾種分子而可用于診斷領(lǐng)域和治療領(lǐng)域。如果要利用雙特異性抗體，這些抗體可以是用常規(guī)方法[72]，例如化學(xué)方法制備或從雜交瘤制備的常規(guī)雙特異性抗體，或者可以是上述雙特異性抗體片段的任一種。這些抗體可通過化學(xué)方法[73，74]或體細(xì)胞方法[75，76]獲得，但也可優(yōu)選通過遺傳改造技術(shù)以迫使進(jìn)行異二聚化，因而促進(jìn)所尋求抗體的純化過程[77]。雙特異性抗體的例子包括BiTE?技術(shù)獲得的那些抗體，其中可以利用特異性不同的兩種抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域并通過短的柔韌性肽直接相連。該抗體在短的單一多肽鏈上組合兩種抗體?？芍焕每勺儏^(qū)構(gòu)建不含F(xiàn)e區(qū)的雙抗體和scFv,從而可能降低抗獨特型反應(yīng)的效應(yīng)。
[0234]可將雙特異性抗體構(gòu)建成完整的IgG、雙特異性Fab’ 2、Fab’ PEG、雙抗體或者雙特異性scFv。此外，可采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法連接兩個雙特異性抗體以形成四價抗體。
[0235]與完整的雙特異性抗體相反，雙特異性雙抗體可能還特別有用，因為它們不難構(gòu)建以及在大腸桿菌中表達(dá)。采用噬菌體展示(W094/13804)不難從文庫中選擇結(jié)合特異性合適的雙抗體(和許多其它多肽，例如抗體片段)。如果要將雙抗體的一根臂維持恒定，例如對IL-6的特異性，則可制備另一臂不同的文庫并選擇特異性合適的抗體?？扇?Ridgewayl996[78]所述通過交替工程改造方法制備完整的雙特異性抗體。
[0236]本領(lǐng)域可采用各種方法獲得針對IL-6的抗體。這些抗體可以是單克隆抗體，特別是人、鼠科、嵌合型或人源化來源的，這些抗體可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。
[0237]就制備單克隆抗體或它們的功能片段，特別是鼠源的而言，通?？赡鼙硎臼謨?“Antibodies (抗體)” [79]特別描述的技術(shù)或如K6hler和Milstein [80]所述從雜交瘤制備的技術(shù)。
[0238]單克隆抗體可以從，例如用IL-6或含有所述單克隆抗體識別表位的IL-6片段之一免疫的動物的B細(xì)胞獲得。本文記載了包含它們的合適的片段和肽或多肽，這些片段和肽或多肽可用于免疫動物以產(chǎn)生針對IL-6的抗體。尤其可按照常規(guī)方法，通過自含有編碼 IL-6或其片段的cDNA序列的核酸序列開始的遺傳重組，通過自包含在IL-6和/或其片段的肽序列中的氨基酸序列開始的肽合成來制備所述IL-6或其片段之一。
[0239]單克隆抗體可以利用，例如親和柱純化，所述親和柱上已經(jīng)固定了含有所述單克隆抗體識別的表位的IL-6或其片段之一。更具體地說，可通過A蛋白和/或G蛋白層析， 然后進(jìn)行或不進(jìn)行離子交換層析以除去自身中殘留蛋白污染物以及DNA和LPS，再進(jìn)行或不進(jìn)行瓊脂糖凝膠排阻層析以除去因存在二聚體或其它多聚體而導(dǎo)致的潛在凝聚體來純化單克隆抗體。在一個實施方式中，可以同時采用或連續(xù)采用所有這些技術(shù)。
[0240]抗原結(jié)合位點
[0241]該術(shù)語描述了分子中結(jié)合靶抗原的全部或部分并與之互補的部分。在抗體分子中，該術(shù)語表示抗體抗原-結(jié)合位點，包括抗體中結(jié)合靶抗原的全部或部分并與之互補的部分。如果抗原較大，抗體可以只結(jié)合該抗原的特定部分，該部分稱為表位?？梢杂梢粋€或多個抗體可變區(qū)提供抗體抗原-結(jié)合位點?？贵w抗原-結(jié)合位點可包含抗體輕鏈可變區(qū) (VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。
[0242]W02006/072620記載 了工程改造在免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域P鏈之間延伸的結(jié)構(gòu)(非 CDR)環(huán)中的抗原結(jié)合位點。可以在與CDR的天然位置相分離的抗體分子區(qū)域，如VH或VL 結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)中，或抗體恒定區(qū)，如CHl和/或CH3中工程改造抗原結(jié)合位點。結(jié)構(gòu)區(qū)中經(jīng)工程改造的抗原結(jié)合位點可以是VH和VL結(jié)構(gòu)域的CDR組形成的抗原結(jié)合位點的額外結(jié)合位點或替換這些結(jié)合位點。當(dāng)抗體分子中存在多個抗原結(jié)合位點時，它們可結(jié)合相同抗原 (IL-6)，從而提高結(jié)合成員的化合價(valency)?；蛘?，多個抗原結(jié)合位點可結(jié)合不同抗原 (IL-6和一種或多種其它抗原)，這可用于添加效應(yīng)功能、延長半衰期或改進(jìn)抗體分子的體內(nèi)遞送。
[0243]分離的
[0244]該術(shù)語表示本發(fā)明的結(jié)合成員，或編碼這種結(jié)合成員的核酸通常合乎本發(fā)明的狀態(tài)。因此，提供的本發(fā)明結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域和編碼核酸分子及載體可以是例如從其天然環(huán)境分離的和/或純化的，基本上純的或均質(zhì)的形式，或者在核酸的情形中，為不含或基本上不含編碼具有所需功能的多肽的序列以外來源的核酸或基因。分離的成員和分離的核酸不含或基本上不含天然與其相連的物質(zhì)，例如在其天然環(huán)境或在體外或體內(nèi)實施重組DNA技術(shù)之時在其制備環(huán)境(例如細(xì)胞培養(yǎng)液)中發(fā)現(xiàn)的其它多肽或核酸?？捎孟♂寗┗蜃魟┡渲浦T成員和核酸，但為實際目的仍是分離的-例如，如果用于包被免疫測定所用的微量滴定板，通常將這些成員與明膠或其它載體混合，或者用于診斷或治療中時，將其與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合。結(jié)合成員可以天然地或通過異源真核細(xì)胞(例如， CHO或NSO (ECACC85110503))的系統(tǒng)糖基化，或者它們可以是(例如，如果在原核細(xì)胞中表達(dá))非糖基化的。
[0245]包含抗IL-6抗體分子的異質(zhì)制品也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。例如，這些制品可以是抗體混合物，所述抗體具有全長重鏈、缺乏C-末端賴氨酸的重鏈、糖基化程度不同和/或具有衍生化的氨基酸，例如N-末端谷氨酸環(huán)化以形成吡咯型谷氨酸殘基。
[0246]本文所用的短語“基本上所述”表示本文所述結(jié)合成員的VH或VL結(jié)構(gòu)域的相關(guān) CDR的特征與本文所述序列的特定區(qū)域相同或高度相似。如本文所述，對于一個或多個可變區(qū)的指定區(qū)域，短語“高度相似”包括在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中可進(jìn)行1-約5個，例如1-4，包括1-3個，或者1、2、3或4個氨基酸取代。
[0247]附圖簡要說明
[0248]圖1.該圖顯示給予抗-1L-6抗體(抗體18)對小鼠體內(nèi)人重組IL-6誘導(dǎo)的觸珠蛋白增加的影響。
[0249]發(fā)明詳沭
[0250]如上所述，本發(fā)明結(jié)合成員能調(diào)節(jié)并可能中和IL-6的生物學(xué)活性。如本文所述， 可以優(yōu)化本發(fā)明的IL-6結(jié)合成員的中和效力。效力優(yōu)化通常包括使選擇的結(jié)合成員的序列(通常是抗體的可變區(qū)序列)突變以產(chǎn)生結(jié)合成員文庫，然后檢驗效力并選擇更強效的結(jié)合成員。因此，選擇的“效力優(yōu)化的”結(jié)合成員的效力可能高于產(chǎn)生文庫的結(jié)合成員。然而，還可不經(jīng)優(yōu)化獲得高效力結(jié)合成員，例如可從最初的篩選，例如生物化學(xué)中和試驗直接獲得高效力結(jié)合成員?！靶Я?yōu)化的”結(jié)合成員指中和IL-6的特定活性或下游功能的效力得到優(yōu)化的結(jié)合成員。本文它處更詳細(xì)描述了試驗和效力。本發(fā)明提供效力優(yōu)化的和未優(yōu)化的結(jié)合成員，以及效力優(yōu)化所選結(jié)合成員的方法。因此，本發(fā)明使得技術(shù)人員能產(chǎn)生高效結(jié)合成員。
[0251]在另一方面，本發(fā)明提供獲得能結(jié)合抗原的一種或多種結(jié)合成員的方法，該方法包括使本發(fā)明的結(jié)合成員文庫與所述抗原接觸，選擇該文庫中能結(jié)合所述抗原的一種或多種結(jié)合成員。
[0252]該文庫可展示在顆?；蚍肿訌?fù)合物上，例如可復(fù)制的遺傳包裝體(replicable genetic package)，如酵母菌、細(xì)菌或細(xì)菌噬菌體(例如，T7)顆粒、病`毒、細(xì)胞或共價、核糖體或其它體外展示系統(tǒng)，各顆?；蚍肿訌?fù)合物含有編碼展示于其上的抗體VH可變區(qū)和任選展示的VL結(jié)構(gòu)域(如果存在的話)的核酸。以下文獻(xiàn)描述了噬菌體展示:W092/01047 和例如，美國專利 US5969108、US5565332、US5733743、US5858657、US5871907、US5872215、 US5885793、US5962255、US6140471、US6172197、US6225447、US6291650、US6492160 和 US6521404,各篇文獻(xiàn)通過引用的方式全文納入本文。
[0253]選擇能結(jié)合抗原并展示在細(xì)菌噬菌體或其它文庫顆?；蚍肿訌?fù)合物上的結(jié)合成員后，可從展示所述選擇的結(jié)合成員的細(xì)菌噬菌體或其它顆?；蚍肿訌?fù)合物上獲得核酸。 這種核酸隨后可用于通過表達(dá)含有從展示所述選擇的結(jié)合成員的細(xì)菌噬菌體或其它顆?；蚍肿訌?fù)合物獲得核酸的核酸序列來產(chǎn)生結(jié)合成員或抗體VH或VL可變區(qū)。[0254]可以分離形式提供含所述選擇的結(jié)合成員的抗體VH可變區(qū)的氨基酸序列的抗體 VH可變區(qū)，例如包含這種VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員。
[0255]可進(jìn)一步檢測結(jié)合IL-6的能力，以及與(例如)親代抗體分子或抗體分子2、3、4、 5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 或 23(例如 scFv 形式和 / 或 IgG 形式，例如 IgGl)競爭結(jié)合IL-6的能力。中和IL-6的能力可如本文它處所述測試。
[0256]本發(fā)明結(jié)合成員結(jié)合IL-6的親和力可以是親代或其它抗體分子如scFv，或抗體 2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 和 23 之一如 IgGl 的親和力，或更好的親和力。
[0257]本發(fā)明結(jié)合成員中和IL-6的生物學(xué)活性的效力可以是親代或其它抗體分子，或抗體 2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 和 23 之一如 scFv 或 IgGl 的效力，或更好的效力。
[0258]可以在合適條件下比較不同結(jié)合成員的結(jié)合親和力與中和效力。
[0259]可通過序列改變或突變，以及篩選具有所需特性的抗原結(jié)合成員的方法獲得本發(fā)明VH和VL結(jié)構(gòu)域和CDR的變體，包括本文列明氨基酸序列且可用于本發(fā)明結(jié)合成員的那些。所需特性的例子包括但不限于:
[0260]?相對于已知的抗原特異性抗體，對抗原結(jié)合親和力提高
[0261]?如果已知某抗原活性，則相對于已知的抗原特異性抗體，對該活性的中和水平提聞。
[0262]?在特定摩爾比下與抗原的已知抗體或配體有特定競爭能力
[0263]?免疫沉淀復(fù)合物的能力
[0264]?結(jié)合特定表位的能力
`[0265]?線性表位，例如用本文所述肽結(jié)合掃描鑒定的肽序列，例如利用篩選的線性和/ 或限定構(gòu)象的肽
[0266]?通過非連續(xù)殘基形成的構(gòu)象表位
[0267]?調(diào)節(jié)IL-6，或下游分子的新生物學(xué)活性的能力。
[0268]本文也提供了這類方法。
[0269]可以制備本文公開的抗體分子的變體并用于本發(fā)明。根據(jù)計算化學(xué)的指導(dǎo)將多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用于結(jié)構(gòu)/特性-活性關(guān)系[81]，可采用熟知的數(shù)學(xué)技術(shù)，例如統(tǒng)計回歸、模式識別和分類[82，83，84，85，86，87]獲得抗體的定量活性_特性關(guān)系。可從抗體序列、功能和三維結(jié)構(gòu)的經(jīng)驗和理論模型(例如，分析可能接觸的殘基或計算的理化特性)獲得抗體的特性，這些特性可單獨考慮，也可組合考慮。
[0270]由VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域組成的抗體抗原-結(jié)合位點通常由6個多肽環(huán)形成:3個來自輕鏈可變區(qū)(VL)，3個來自重鏈可變區(qū)(VH)。對原子結(jié)構(gòu)已知的抗體的分析闡明了序列和抗體結(jié)合位點的三維結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系[88，89]。這些關(guān)系暗示，除了 VH結(jié)構(gòu)域中的第三區(qū)(環(huán))外，結(jié)合位點環(huán)具有少量主鏈構(gòu)象:經(jīng)典結(jié)構(gòu)之一。在特定環(huán)中形成經(jīng)典結(jié)構(gòu)顯示由其大小和在環(huán)及構(gòu)架區(qū)的關(guān)鍵位點中存在某些殘基決定[88，89]。
[0271]可采用這種序列-結(jié)構(gòu)關(guān)系研究預(yù)測序列已知但三維結(jié)構(gòu)未知的抗體中，對于維持其⑶R環(huán)的三維結(jié)構(gòu)從而維持結(jié)合特異性至關(guān)重要的那些殘基。通過比較預(yù)測與前導(dǎo)優(yōu)化實驗的結(jié)果可支持這些預(yù)測。在結(jié)構(gòu)方法中，采用任何可自由使用或購得的軟件包，例如 WAM[91]可產(chǎn)生抗體分子的模型[90]。然后可采用蛋白質(zhì)目測和分析軟件包，例如阿克賽勒里公司(Accelerys, Inc.)的Insight II或Deep View[92]評估⑶R中各位置處可能的取代。然后可利用該信息進(jìn)行可能對活性的影響最小或有利的取代。[0272]本領(lǐng)域通常已知在CDR、抗體VH或VL結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員的序列內(nèi)進(jìn)行取代所需的技術(shù)。可以制備含有取代的變體序列，測試其結(jié)合和/或中和IL-6的能力和/或任何其它所需特性，所述取代可能預(yù)計或不能預(yù)計對活性的影響最小或有利。
[0273]本發(fā)明可利用序列如本文特別公開的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)氨基酸序列變體，如本文所述。
[0274]本發(fā)明VL結(jié)構(gòu)域的變體和包含它們的結(jié)合成員或抗體分子包括Kabat殘基108 上不存在精氨酸，例如Kabat殘基108是不同殘基或缺失的VL結(jié)構(gòu)域。例如，抗體分子，例如缺少恒定區(qū)的抗體分子如scFv可包含具有本文所述VL結(jié)構(gòu)域序列或其變體的VL結(jié)構(gòu)域，其中Kabat殘基108上是精氨酸、除精氨酸以外的氨基酸殘基或缺失。
[0275]本發(fā)明另一方面是包含VH結(jié)構(gòu)域和/或VL結(jié)構(gòu)域的抗體分子，所述VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與所附序列表所示的抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的VH結(jié)構(gòu)域有至少60、70、80、85、90、95、98或99%相同，所述VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與所附序列表所示的抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中任何抗體的 VL結(jié)構(gòu)域有至少60、70、80、85、90、95、98或99%相同。可用于計算兩個氨基酸序列的相同性百分?jǐn)?shù)的算法包括例如BLAST [93] ,FASTA [94]或史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm) [95],例如采用默認(rèn)參數(shù)。
[0276]特定變體可包含一個或多個氨基酸序列改變(氨基酸殘基的加入、缺失、取代和/ 或插入)。
[0277]可以在一個或多個構(gòu)架區(qū)和/或一個或多個CDR中作出改變。改變通常不導(dǎo)致功能喪失，因此包含如此改變的氨基酸序列的結(jié)合成員可保留結(jié)合和/或中和IL-6的能力。 其可保留與未作改變的結(jié)合成員同樣的定量結(jié)合和/或中和能力，例如在本文所述試驗中測得。包含如此改變的氨基酸序列的結(jié)合成員結(jié)合和/或中和IL-6的能力可能提高。
[0278]改變可包括用非天然產(chǎn)生或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸替代一個或多個氨基酸殘基，將一個或多個氨基酸殘基修飾成非天然產(chǎn)生或非標(biāo)準(zhǔn)形式，或者將一個或多個非天然產(chǎn)生或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸插入序列。本文它處描述了本發(fā)明序列中改變的示例性數(shù)目和位置。天然產(chǎn)生的氨基酸包括20種“標(biāo)準(zhǔn)” L-氨基酸，根據(jù)它們的標(biāo)準(zhǔn)單字母密碼鑒別為G、A、V、L、1、M、P、F、 W、S、T、N、Q、Y、C、K、R、H、D、E。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸包括可摻入多肽主鏈中的任何其它殘基或由現(xiàn)有氨基酸殘基修飾產(chǎn)生。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以是天然產(chǎn)生的或非天然產(chǎn)生的。本領(lǐng)域已知幾種天然產(chǎn)生的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，例如4-羥脯氨酸、5-羥脯氨酸、3-甲基組氨酸、N-乙?；z氨酸等[96]。在其N-a位置衍生的那些氨基酸殘基只位于氨基酸序列的N-末端。在本發(fā)明中，氨基酸通常是L-氨基酸，但也可以是D-氨基酸。因此，改變包括將L-氨基酸修飾成D-氨基酸，或用D-氨基酸替代L-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙?；?或磷酸化形式也是已知的，在本發(fā)明中，氨基酸可進(jìn)行這種修飾。
[0279]本發(fā)明的抗體結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員的氨基酸序列可包含上述非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸?？稍诤铣蛇^程中將非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(例如D-氨基酸)摻入氨基酸序列，或在合成氨基酸序列后修飾或取代"原始"標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。
[0280]利用非標(biāo)準(zhǔn)和/或非天然產(chǎn)生的氨基酸能增加結(jié)構(gòu)和功能差異，因此能增加本發(fā)明結(jié)合成員獲得所需IL-6結(jié)合與中和特性的可能性。此外，與標(biāo)準(zhǔn)L-氨基酸相比，D-氨基酸和類似物已顯示不同的藥代動力學(xué)分布概況，因為具有L-氨基酸的多肽在給予動物， 例如人后會體內(nèi)降解，這意味著在一些體內(nèi)應(yīng)用中D-氨基酸比較有利。
[0281]可采用隨機誘變一個或多個選擇的VH和/或VL基因以在整個可變區(qū)中產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生本發(fā)明的攜帶CDR衍生序列的新型VH或VL結(jié)構(gòu)域。Gram等[97]描述了這種技術(shù)，他采用易錯PCR。在一些實施方式中，在整個可變區(qū)或⑶R組中作出一個或兩個氨基酸取代。
[0282]可采用的另一種方法是VH或VL基因的CDR區(qū)域的定點誘變。Barbas等[98]和 Schier等[99]公開了這些技術(shù)。[0283]本領(lǐng)域已知所有上述技術(shù)，技術(shù)人員能采用這些技術(shù)，從而能利用本領(lǐng)域常規(guī)方法提供本發(fā)明結(jié)合成員。
[0284]本發(fā)明另一方面提供獲得IL-6的抗體抗原結(jié)合位點的方法，該方法包括通過將一個或多個氨基酸添加、刪除、取代或插入本文所示VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列來提供VH結(jié)構(gòu)域，其是本文所示VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體，任選組合如此提供的VH結(jié)構(gòu)域與一個或多個VL結(jié)構(gòu)域，并測試該VH結(jié)構(gòu)域或一種或多種VH/VL組合以鑒定IL-6的結(jié)合成員或抗體抗原結(jié)合位點，和任選一種或多種所需特性，例如中和IL-6活性的能力。所述VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列基本上如本文所示?？刹捎妙愃品椒ǎ渲斜疚墓_的VL結(jié)構(gòu)域的一個或多個序列變體與一個或多個VH結(jié)構(gòu)域組合。
[0285]如上所述，所攜帶的基本上如本文所示的CDR氨基酸序列可以是人抗體可變區(qū)中的CDR或其實質(zhì)性部分?；旧先绫疚乃镜腍CDR3序列代表著本發(fā)明的諸多實施方式， 攜帶的這些序列各自可以是人重鏈可變區(qū)中的HCDR3或其實質(zhì)性部分。
[0286]本發(fā)明所用的可變區(qū)可以從任何種系或重排人可變區(qū)獲得或衍生，或者可以是基于已知人可變區(qū)的共有或?qū)嶋H序列的合成可變區(qū)?？勺儏^(qū)可以衍生自非人抗體?？梢圆捎弥亟MDNA技術(shù)將本發(fā)明的⑶R序列(例如，⑶R3)引入缺乏⑶R (例如，⑶R3)的可變區(qū)庫 (repertoire)。例如，Marks等[100]描述了產(chǎn)生抗體可變區(qū)庫的方法,其中可變區(qū)5’端處或與之毗鄰的共有引物與人VH基因的第三構(gòu)架區(qū)的共有引物連用以提供缺乏CDR3的VH 可變區(qū)庫。Marks等還描述了如何將該庫與特定抗體的CDR3組合。采用類似的技術(shù)，本發(fā)明的⑶R3衍生序列可以與缺乏⑶R3的VH或VL結(jié)構(gòu)域庫改組，改組的完整VH和VL結(jié)構(gòu)域與同源VL或VH結(jié)構(gòu)域組合以提供本發(fā)明的結(jié)合成員。然后可以在合適的宿主系統(tǒng)中展示該庫，因而可以選擇合適的結(jié)合成員，所述宿主系統(tǒng)例如是通過引用方式全文納入本文的TO92/01047或大量后續(xù)文獻(xiàn)，包括Kay，Winter和McCafferty [101]所述的噬菌體展示系統(tǒng)。一個庫可由IO4以上單個成員的構(gòu)成，例如至少105、至少106、至少107、至少108、至少IO9或至少IOltl個或更多成員。其它合適的宿主系統(tǒng)包括但不限于:酵母菌展示、細(xì)菌展示、T4展示、病毒展示、細(xì)胞展示、核糖體展示和共價展示。
[0287]提供了制備IL-6抗原的結(jié)合成員的方法，該方法包括:
[0288](a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸起始庫，所述核酸包含待替代的⑶R3或缺乏⑶R編碼區(qū)；
[0289](b)將所述核酸庫與編碼基本上如本文所示VH CDR3的氨基酸序列的供體核酸組合，從而將所述供體核酸插入核酸庫的CDR3區(qū)域，進(jìn)而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸產(chǎn)物庫；[0290](c)表達(dá)所述產(chǎn)物庫的核酸；
[0291](d)選擇IL-6的結(jié)合成員；和
[0292](e)回收所述結(jié)合成員或其編碼核酸。
[0293]還可采用類似方法，其中本發(fā)明的VL CDR3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸庫組合，所述核酸包含待替代的⑶R3或缺乏⑶R3編碼區(qū)。
[0294]類似地，可以將一個或多個或所有3個⑶R嫁接入VH或VL結(jié)構(gòu)域庫，然后篩選該庫中IL-6的一種或多種結(jié)合成員。
[0295]例如，可采用一種或多種親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22或 23 的 HCDRUHCDR2 和 HCDR3，或親代或抗體 2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 或 23 的HCDR組，和/或可采用一種或多種親代或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 或 23 的 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 或親代或抗體 2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22 或 23 的 LCDR 組。
[0296]類似地，可以利用本文公開的其它VH和VL結(jié)構(gòu)域，多組⑶R和多組HCDR和/或多組LCDR。
[0297]免疫球蛋白可變區(qū)的實質(zhì)性部分可包含至少所述三個CDR區(qū)，以及它們的間插構(gòu)架區(qū)。該部分還可包含至少約50%的第一或第四構(gòu)架區(qū)或二者，所述50%是第一構(gòu)架區(qū)的 C-末端50%和第四構(gòu)架區(qū)的N-末端50%?？勺儏^(qū)的實質(zhì)性部分的N-末端或C-末端處其它殘基可以是通常不與天然產(chǎn)生的可變區(qū)相連的那些殘基。例如，通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的結(jié)合成員可導(dǎo)致將引入以促進(jìn)克隆或其它操作步驟的接頭所編碼的N-或C-末端殘基引入。其它操作步驟包括引入接頭以連接本發(fā)明的可變區(qū)與包含抗體恒定區(qū)、其它可變區(qū)(例如，在雙抗體的產(chǎn)生中)或可檢測/功能標(biāo)記物的其它蛋白質(zhì)序列，如本文它處詳述的。
[0298]雖然在本發(fā)明的一些方面，結(jié)合成員包含一對VH和VL結(jié)構(gòu)域，但基于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成本發(fā)明的其它方面。已知單一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，特別是 VH結(jié)構(gòu)域能以特定方式結(jié)合靶抗原。例如，參見以上dAb的討論。
[0299]在每一種單一`結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情形中，可用這些結(jié)構(gòu)域篩選能形成與IL-6能結(jié)合的兩維結(jié)合成員的互補結(jié)構(gòu)域?？刹捎靡砸梅绞饺募{入的W092/01047公開的所謂分級雙重組合方案，通過噬菌體展示篩選方法實施，其中含有H或L鏈克隆的各集落用于感染編碼另一鏈(L或H)的克隆的完整文庫，按照噬菌體展示技術(shù)，例如該參考文獻(xiàn)中描述的那些技術(shù)選擇得到的雙鏈結(jié)合成員。該技術(shù)也參見Marks等，同上[100]。
[0300]本發(fā)明的結(jié)合成員還可包含抗體恒定區(qū)或其諸部分，例如人抗體恒定區(qū)或其諸部分。例如，可將VL結(jié)構(gòu)域在其C-末端與含有人C K或CA鏈的抗體輕鏈恒定區(qū)相連。類似地，基于VH結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員可以在其C-末端與衍生自任何抗體同種型,例如IgG、IgA、 IgE和IgM和任何同種型亞類，特別是IgGl和IgG4的免疫球蛋白重鏈的全部或部分(例如，CHl結(jié)構(gòu)域)相連。IgGl因其效應(yīng)功能和便于操作而優(yōu)選。具有這些特性并穩(wěn)定可變區(qū)的任何合成或其它恒定區(qū)變體也可用于本發(fā)明。
[0301]可用可檢測或功能標(biāo)記物標(biāo)記本發(fā)明的結(jié)合成員。因此，結(jié)合成員或抗體分子可以免疫偶聯(lián)物的形式存在，以便獲得可檢測和/或可定量的信號。免疫偶聯(lián)物可包含與可檢測或功能標(biāo)記物偶聯(lián)的本發(fā)明抗體分子。標(biāo)記物可以是能產(chǎn)生或經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生信號的任何分子，包括但不限于:熒光劑、放射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此，可以通過檢測熒光或發(fā)光、放射性、酶活性或吸光度來檢測和/或測量結(jié)合情況。
[0302]合適標(biāo)簽包括例如但不限于:
[0303]-酶，例如堿性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(〃G6PDH〃)、a_D_半乳糖苷酶、葡萄糖氧化鎂、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶和過氧化物酶， 如辣根過氧化物酶；
[0304]-染料；
[0305]-熒光標(biāo)記物或熒光劑，如熒光素和其衍生物、熒光染料、羅丹明化合物和衍生物、 GFP(GFP指〃綠色熒光蛋白”)、丹酰、傘形酮、藻紅蛋白、藻青蛋白、別藻藍(lán)素、鄰苯二醛和熒胺；熒光團(tuán)如鑭系穴合物和螯合物，如銪等(帕金埃爾默公司(Perkin Elmer)和西斯生物國際(Cis Biointernational)),
[0306]-化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物或化學(xué)發(fā)光素，如異氨基苯二酰肼、氨基苯二酰肼和二氧雜環(huán)丁燒(dioxetane)；
[0307]-生物發(fā)光標(biāo)記物，如熒光素酶和螢光素；
[0308]-感光劑；
[0309]-輔酶；
[0310]-酶底物；
[0311]-放射性標(biāo)記，包括但不限于:溴77、碳14、鈷57、氟8、鎵67、鎵68、氫3(氚)、銦 111、銦 113m、碘 123m、碘 125、碘 126、碘 131、碘 133、汞 107、汞 203、磷 32、錸 99m、錸 101、錸 105、釕 95、釕 97、釕 103、釕 105、鈧 47、硒 75、硫 35、锝 99、锝 99m、碲 121m、碲 122m、碲 125m、 銩165、銩167、銩168、釔199和本文所述的其它放射性標(biāo)記物；
[0312]-可進(jìn)一步用染料、催化劑或其它可檢測基團(tuán)標(biāo)記的顆粒，如膠乳或碳顆粒；.金溶月父；微晶；脂質(zhì)體；細(xì)胞等；
[0313]-分子，如生物素、地高辛或5-溴脫氧尿苷；
[0314]-毒素部分，例如選自下組的毒素部分:假單胞菌外毒素(PE或其細(xì)胞毒素片段或突變體)、白喉毒素或其細(xì)胞毒素片段或突變體，肉毒桿菌毒素A、B、C、D、E或F，蓖麻毒蛋白或其細(xì)胞毒素片段如蓖麻毒蛋白A、相思豆毒素或其細(xì)胞毒素片段、皂草毒蛋白或其細(xì)胞毒素片段、商陸抗病毒毒素或其細(xì)胞毒素片段和異株瀉根毒蛋白I或其細(xì)胞毒素片段。
[0315]合適的酶和輔酶公開于Litman等,美國專利號4，275, 149,和Boguslaski等,美國專利號4，318，980，各份專利以引用的方式全文納入本文。合適的熒光劑和化學(xué)發(fā)光劑公開于以引用的方式全文納入本文的Litman等，美國專利號4，275，149。標(biāo)記物還包括化學(xué)部分，例如可通過與特定的相關(guān)可檢測部分，如標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素結(jié)合來檢測的生物素?？蓹z測標(biāo)記物可以采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)化學(xué)方法連接于本發(fā)明抗體。
[0316]免疫偶聯(lián)物或它們的功能片段可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。它們可以直接或通過間隔基團(tuán)或連接基團(tuán)，例如聚醛，如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)的中介作用，或在偶聯(lián)劑，例如以上治療性偶聯(lián)物所述那些偶聯(lián)劑存在下偶聯(lián)于酶或熒光標(biāo)記物?？赏ㄟ^與異硫氰酸酯反應(yīng)制備包含熒光素類標(biāo)記物的偶聯(lián)物。
[0317]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知現(xiàn)有的將治療性放射性同位素直接或通過螯合劑，例如上述 EDTA、DATA偶聯(lián)于抗體的方法，該方法可利用診斷所用的放射性元素。還可能通過氯胺T方法[102]用Nal25標(biāo)記,或通過Crockford等的技術(shù)(以引用方式全文納入本文的美國專利號4，424，200)用锝99m標(biāo)記或通過Hnatowich (以引用方式全文納入本文的美國專利號 4，479，930)所述經(jīng)DPTA相連進(jìn)行標(biāo)記。
[0318]可以通過許多方法使標(biāo)記物產(chǎn)生可通過外部方法檢測的信號，例如通過目測、電磁輻射、加熱和化學(xué)試劑。所述標(biāo)記物還可與結(jié)合本發(fā)明抗體的另一結(jié)合成員結(jié)合，或與支持物結(jié)合。
[0319]標(biāo)記物可直接產(chǎn)生信號，因此，無需其它組分來產(chǎn)生信號。許多有機分子，例如熒光劑能吸收紫外線和可見光，吸收的光將能量轉(zhuǎn)移給這些分子并將它們提高到激發(fā)能級。 然后該吸收的能量通過發(fā)射第二波長的光而消散。該第二波長的射線也能將能量轉(zhuǎn)移給標(biāo)記的接受分子，得到的能量通過發(fā)射光，例如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而從接受分子消散。直接產(chǎn)生信號的其它標(biāo)記物包括放射性同位素和染料。
[0320]或者，標(biāo)記物可能需要其它組分來產(chǎn)生信號，那么信號產(chǎn)生系統(tǒng)將包括產(chǎn)生可檢測信號所需的所有組分，包括底物、輔酶、增強劑、其它酶、與酶產(chǎn)物反應(yīng)的物質(zhì)、催化劑、激活劑、輔因子、抑制劑、清除劑、金屬離子和結(jié)合信號產(chǎn)生物質(zhì)所需的特定結(jié)合物質(zhì)。有關(guān)合適的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的詳述見以引用方式全文納入本文的Ullman等，US5, 185，243。
[0321]本發(fā)明提供的方法包括使得本文提供的結(jié)合成員與IL-6結(jié)合。應(yīng)注意，這種結(jié)合可在體內(nèi)發(fā)生，例如在給予結(jié)合成員或編碼結(jié)合成員的核酸后，或者可在體外發(fā)生，例如 ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀、親和層析和生物化學(xué)或細(xì)胞試驗，例如TF-1 細(xì)胞增殖實驗。
[0322]本發(fā)明還能利用本發(fā)明結(jié)合成員，例如在生物傳感器系統(tǒng)中直接檢測抗原水平。 例如，本發(fā)明包括檢測和/或測量與IL-6的結(jié)合情況的方法，包括(i)使所述結(jié)合成員與 IL-6接觸和(ii)檢測所述結(jié)合成員與IL-6的結(jié)合情況，其中采用本文所述任何方法或可檢測標(biāo)記物檢測結(jié)合情況。該方法和本文所述的任何其它結(jié)合檢測方法可直接由實施該方法的人員解讀，例如目測觀察可檢測標(biāo)記物?；蛘?，該方法或本文所述的任何其它結(jié)合檢測方法可產(chǎn)生放射自顯影照片、照片、計算機打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報道、圖片、圖表、含有結(jié)果的試管或容器或孔、或該方法結(jié)果的任何其它可見或物理表現(xiàn)形式的報道。
[0323]可以測定結(jié)合成員與IL-6的結(jié)合量。定量測定可與測試樣品中診斷感興趣的抗原量有關(guān)。篩選IL-6結(jié)合和/或其定量測定可用于，例如篩選患有本文所述疾病或失調(diào)和 /或與IL-6表達(dá)和/或活性異常有關(guān)的任何其它疾病或失調(diào)的患者。
[0324]本發(fā)明診斷方法可包括(i)獲得對象的組織或液體樣品；(ii)使所述組織或液體樣品與一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員接觸；和(iii)與對照樣品相比，檢測結(jié)合的IL-6等步驟，其中與對照相比，IL-6結(jié)合量增加可表明IL-6表達(dá)或活性水平異常。待測試的組織或液體樣品包括懷疑含有IL-6水平異常的血液、血清、尿、生物活檢材料、腫瘤或任何組織。 經(jīng)測試IL-6水平或活性異常的陽性對象還可受益于本文隨后公開的治療方法。
[0325]借鑒本文公開的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)他們的偏好和普通知識選擇測定結(jié)合成員與抗原結(jié)合的合適方式。
[0326]可通過任何合適的方式測定樣品中結(jié)合成員的反應(yīng)性。放射免疫測定(RIA)是可能的一種。放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原(測試樣品)混合，使之與結(jié)合成員結(jié)合。將結(jié)合的抗原與未結(jié)合的抗原物理分離，測定與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原量。測試樣品中的抗原越多，與結(jié)合成員結(jié)合的放射性抗原越少。還可采用含非放射性抗原的競爭性結(jié)合試驗，利用與報道分子相連的抗原或類似物。報道分子可以是具有光譜學(xué)上分開的吸收或發(fā)射特征的熒光染料、磷或激光染料。合適的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、德克薩斯紅和鑭系螯合劑或穴合物。合適的生色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。
[0327]其它報道分子包括大分子膠態(tài)顆粒或顆粒材料，例如有色的、磁性或順磁性的乳膠珠和能直接或間接產(chǎn)生可通過目測觀察、電子檢測或其它方式記錄的可檢測信號的生物學(xué)或化學(xué)活性劑。例如，這些分子可以是酶，其催化反應(yīng)以產(chǎn)生或改變顏色或?qū)е码娮犹匦愿淖?。它們可以是可激發(fā)的分子，因而能級之間的電子轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致特征性吸收光譜或發(fā)射光譜。它們可包括與生物傳感器聯(lián)用的化學(xué)實體?？梢圆捎蒙锼?親和素或生物素/鏈霉親和素和堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。
[0328]可利用各結(jié)合成員-報道分子偶聯(lián)物產(chǎn)生的信號獲得樣品(普通和測試)中與結(jié)合成員結(jié)合情況有關(guān)的可定量絕對或相對數(shù)據(jù)。
[0329]本發(fā)明一方面還提供包含本發(fā)明任何方面或?qū)嵤┓绞降慕Y(jié)合成員的試劑盒。在試劑盒中，可標(biāo)記結(jié)合成員，從而能測定其在樣品中的反應(yīng)性，例如下文所述。結(jié)合成員還可與或不與固體支持物相連。試劑盒的諸組分通常是無菌的，放置在密封小瓶或其它容器中。 試劑盒可用于利用結(jié)合成員的診斷分析或其它方法。試劑盒可裝有在某方法，例如本發(fā)明方法中使用這些組分的使用說明書。本發(fā)明試劑盒中可裝有輔助物質(zhì)從而能協(xié)助或?qū)嵤┻@種方法。輔助物質(zhì)包括第二種不同的結(jié)合成員，其能結(jié)合第一結(jié)合成員并偶聯(lián)于可檢測標(biāo)記物(例如，熒光標(biāo)記物、放射性同位素或酶)?？贵w試劑盒還可裝有用于實施免疫沉淀的珠。試劑盒的各組分通常裝在自身的合適容器中。因此，這些試劑盒通常包含適合于各結(jié)合成員的不同容器。此外，這些試劑盒可裝有實施試驗及解讀和分析實施試驗所得數(shù)據(jù)的方法的使用說明書。
[0330]本發(fā)明還提供以上結(jié)合成員在競爭試驗中檢測抗原水平的應(yīng)用，即在競爭試驗中利用本發(fā)明提供的結(jié)合成員檢測樣品中抗原水平的方法。這可能無需物理分離結(jié)合的與未結(jié)合的抗原。將報道分子連接于結(jié)合成員，從而結(jié)合時可能發(fā)生物理或光學(xué)改變。報道分子可以直接或間接產(chǎn)生可定量的可檢測信號。可以直接或間接，共價，例如通過肽鍵或非共價連接報道分子。經(jīng)由肽鍵連接可能是重組表達(dá)編碼抗體或報道分子的基因融合體所致。
[0331]在各個方面和實施方式中，本發(fā)明擴(kuò)展至與本文定義的任何結(jié)合成員，例如親代抗體或抗體2、3、4、5、7、8、10、14、16、17、18、19、21、22和23中的任何抗體，例如IgGl形式的抗體競爭結(jié)合IL-6的結(jié)合成員。不難在體外檢驗結(jié)合成員之間的競爭，例如用特定的報道分子給一種結(jié)合成員作標(biāo)記(可在其它未標(biāo)記的結(jié)合成員存在下檢測)，從而能鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的結(jié)合成員。例如，可采用ELISA測定競爭，其中IL-6固定于平板， 將標(biāo)記或帶標(biāo)簽的第一結(jié)合成員連同一種或多種未標(biāo)記或未帶標(biāo)簽的其它結(jié)合成員一起加入該平板。通過標(biāo)記的結(jié)合成員發(fā)出的信號降低觀察到有能與標(biāo)記的結(jié)合成員競爭的未標(biāo)`記結(jié)合成員存在。
[0332]例如，本發(fā)明包括鑒定IL-6結(jié)合化合物的方法，包括(i)將IL-6固定于支持物， (ii)使所述固定的IL-6同時或以分步方式與至少一種標(biāo)記的本發(fā)明結(jié)合成員和一種或多種未標(biāo)記的測試結(jié)合化合物接觸，和(iii)通過觀察標(biāo)記的結(jié)合成員的結(jié)合標(biāo)簽量的降低來鑒定新IL-6結(jié)合化合物?？刹捎枚嗫谆蜿嚵行问剑愿咄糠绞綄嵤┻@些方法。這種實驗可以在溶液中進(jìn)行。例如,參見以引用方式全文納入本文的u.S.5,814,468。如上所述， 結(jié)合的檢測可以直接由實施該方法的人員解讀，例如通過目測觀察可檢測標(biāo)記物，或其存在量降低?；蛘?，本發(fā)明的結(jié)合成員可產(chǎn)生放射自顯影照片、照片、計算機打印輸出、流式細(xì)胞術(shù)報道、圖片、圖表、含有結(jié)果的試管或容器或孔、或該方法結(jié)果的任何其它可見或物理表現(xiàn)形式的報道。
[0333]競爭試驗還可用于表位作圖。在一個例子中，表位作圖可用于鑒定IL-6結(jié)合成員所結(jié)合的表位，所述結(jié)合成員可任選具有優(yōu)化的中和和/或調(diào)節(jié)特征。這種表位可以是線形表位或構(gòu)象表位。構(gòu)象表位可包含至少兩個不同的IL-6片段，其中當(dāng)IL-6折疊成其三級或四級結(jié)構(gòu)以形成IL-6抑制劑，例如IL-6結(jié)合成員識別的構(gòu)象表位時所述片段的位置彼此毗鄰。在測試競爭時，可利用抗原的肽片段，特別是包含感興趣表位或基本上由其構(gòu)成的肽?？衫镁哂斜砦恍蛄胁⒃诟鞫思佑幸粋€或多個氨基酸的肽。本發(fā)明結(jié)合成員可以如下所示，即它們與抗原的結(jié)合被具有或包含所給定序列的肽抑制。
[0334]本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明結(jié)合成員的分離核酸。核酸可包含DNA和/或RNA。在一方面，本發(fā)明提供編碼上述本發(fā)明的CDR或CDR組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體抗原_結(jié)合位點或抗體分子，例如scFv或IgGl的核酸。
[0335]本發(fā)明還提供質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達(dá)盒形式的構(gòu)建物，其包含至少一種上述多核苷酸。
[0336]本發(fā)明還提供包含以上一種或多種構(gòu)建物的重組宿主細(xì)胞。編碼所述⑶R或⑶R 組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗體抗原-結(jié)合位點或抗體分子，例如scFv或IgGl的核酸本身構(gòu)成本發(fā)明的一方面，這與產(chǎn)生所編碼產(chǎn)物的方法一樣，該方法包括表達(dá)其編碼核酸。 在合適的條件下培養(yǎng)含有該核酸的重組宿主細(xì)胞不難實現(xiàn)表達(dá)。通過表達(dá)產(chǎn)生后，可采用任何合適的技術(shù)分離和/或純化VH或VL結(jié)構(gòu)域或結(jié)合成員，然后適當(dāng)使用。
[0337]本發(fā)明核酸可包含DNA或RNA，其可以是完全或部分合成的。除非另有表述，述及本文所示核苷酸序列包括具有所示序列的DNA分子,還包括具有所示序列的RNA分子,其中 U取代T。
[0338]還有另一方面提供產(chǎn)生抗體VH可變區(qū)的方法，該方法包括表達(dá)編碼核酸。該方法可包括在產(chǎn)生所述抗體VH可變區(qū)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
[0339]產(chǎn)生VL結(jié)構(gòu)域和包含VH和/或VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合成員的類似方法是本發(fā)明的其它方面。
[0340]制備方法可包括分離和/或純化產(chǎn)物的步驟。制備方法可包括將產(chǎn)物配制成含有至少一種其它組分，例如藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。
[0341]熟知在各種不同的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)。合適的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、絲狀真菌、酵母菌和桿狀病毒系統(tǒng)及轉(zhuǎn)基因植物和動物。本領(lǐng)域熟知在原核細(xì)胞中表達(dá)抗體和抗體片段。綜述可參見Plilckthun[103]。常用的細(xì)菌宿主是大腸桿菌(E.coli)。
[0342] 作為產(chǎn)生結(jié)合成員的替代方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可利用培養(yǎng)的真核細(xì)胞來表達(dá) [104，105，106]。本領(lǐng)域可用于表達(dá)異源多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO) 細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑色素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞、人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞和許多其它細(xì)胞。[0343]可以選擇或構(gòu)建含有合適的調(diào)節(jié)序列的合適載體，包括啟動子序列、終止子序列、 多腺苷酸化序列、增強子序列、標(biāo)記基因和其它序列(如果需要的話)。載體可以是質(zhì)粒，例如噬菌粒，或病毒，例如噬菌體(如果需要的話)[107]。Ausubel[108]詳細(xì)描述了操作核酸的許多已知技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建物、誘變、測序、將DNA引入細(xì)胞和基因表達(dá)以及分析蛋白質(zhì)。 [0344]本發(fā)明的另一方面提供含有本文公開的核酸的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可以在體外并可處于培養(yǎng)物中。這種宿主細(xì)胞可以在體內(nèi)。宿主細(xì)胞的體內(nèi)存在可以將本發(fā)明結(jié)合成員分子內(nèi)表達(dá)成“胞內(nèi)抗體”或細(xì)胞內(nèi)抗體。胞內(nèi)抗體可用于基因療法。
[0345]還有另一方面提供了包括將本發(fā)明核酸引入宿主細(xì)胞的方法?？刹捎萌魏魏线m的技術(shù)實施這種引入。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖、電穿孔、 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如痘苗病毒，或者就昆蟲細(xì)胞而言是桿狀病毒。將核酸引入宿主細(xì)胞，特別是真核細(xì)胞可利用病毒或質(zhì)粒系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可以維持于附加體或可摻入宿主細(xì)胞或摻入人工染色體。摻入可以是將一份或多份拷貝隨機或靶向整合在單一或多個基因座處。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和利用細(xì)菌噬菌體轉(zhuǎn)染。
[0346]引入后可表達(dá)核酸，例如通過在表達(dá)基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法純化表達(dá)的產(chǎn)物。
[0347]可將本發(fā)明核酸整合到宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，納入促進(jìn)與基因組重組的序列可促進(jìn)整合。
[0348]本發(fā)明還提供包括在表達(dá)系統(tǒng)中利用上述構(gòu)建物以表達(dá)上述結(jié)合成員或多肽的方法。
[0349]有證據(jù)表明，IL-6參與各種疾病，如本文其它地方所述。因此，本發(fā)明結(jié)合成員可用于診斷或治療與IL-6有關(guān)的疾病的方法。這種疾病可以是，例如炎性疾病和/或自身免疫病，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、惡病質(zhì)、慢性阻塞性肺病、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎性腸病、克羅恩氏病或動脈粥樣硬化。也可利用本發(fā)明結(jié)合成員治療諸如腫瘤和/或癌癥等疾病。
[0350]本發(fā)明結(jié)合成員也可用于診斷或治療患者、動物、器官、組織或細(xì)胞的至少一種 IL-6相關(guān)疾病的方法,所述IL-6相關(guān)疾病包括但不限于:
[0351]_(呼吸道)阻塞性氣道疾病，包括慢性阻塞性肺病(COPD);哮喘，如支氣管、變應(yīng)性、內(nèi)源性、外源性和塵埃性哮喘，特別是慢性或積習(xí)性哮喘(例如晚期哮喘和氣道高反應(yīng)性)；支氣管炎；急性、變應(yīng)性、萎縮性鼻炎和慢性鼻炎，包括干酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化膿性鼻炎、干燥性鼻炎和藥物性鼻炎；膜性鼻炎，包括格魯布性、纖維蛋白性和假膜性鼻炎，以及腺病性鼻炎；季節(jié)性鼻炎，包括神經(jīng)性鼻炎(枯草熱)和血管運動性鼻炎、鼻竇炎、特發(fā)性肺纖維化(IPF);結(jié)節(jié)病、農(nóng)民肺和相關(guān)疾病、成人呼吸窘迫綜合征、超敏性肺炎、纖維化肺和特發(fā)性間質(zhì)性肺炎；
[0352](骨和關(guān)節(jié))類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎全身發(fā)病、血清陰性脊柱關(guān)節(jié)病(包括強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和萊特病)、貝切特病、舍格倫綜合征和全身性硬化癥、痛風(fēng)、骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎；
[0353](皮膚)銀屑病、特應(yīng)性皮炎、接觸性皮炎和其它濕疹性皮膚病、變應(yīng)性接觸性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔蘚、硬皮病、天皰瘡、大皰性類天皰瘡、大皰性表皮松解癥、蕁麻疹、 干皮病(angiodermas)、血管炎、紅斑、皮膚嗜酸性細(xì)胞增多、葡萄膜炎、斑禿、變應(yīng)性結(jié)膜炎和春季結(jié)膜炎(vernal vernal conjunctivitis)；
[0354](胃腸道)胃潰瘍、腹部疾病、直腸炎、嗜酸性腸胃炎、肥大細(xì)胞增生病、炎性腸病、 克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、抗磷脂綜合征))、產(chǎn)生遠(yuǎn)離內(nèi)臟的影響，如偏頭痛、鼻炎和濕疹的食品相關(guān)性變態(tài)反應(yīng)；
[0355](其它組織和全身性疾病)惡病質(zhì)、多發(fā)性硬化、動脈粥樣硬化、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、系膜增生性腎小球腎炎、腎病綜合征、腎炎、腎小球腎炎、急性腎衰竭、血液透析、尿毒癥、局部或盤狀紅斑狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、卡斯?fàn)柭　虮炯谞钕傺?、重癥肌無力、I型糖尿病、B型胰島素抗性糖尿病、鐮狀細(xì)胞貧血、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經(jīng)炎、腎炎綜合征、嗜酸細(xì)胞增多性筋膜炎、高IgE綜合征、全身性血管炎/韋格納肉芽腫病、睪丸炎/輸精管切除術(shù)逆轉(zhuǎn)術(shù)(reversal procedure)、瘤型麻風(fēng)、酒精誘導(dǎo)的肝炎、塞扎里綜合征和特發(fā)性血小板減少紫癜；術(shù)后粘連、腎病、全身性炎癥反應(yīng)綜合征、敗血癥綜合征、革蘭陽性敗血癥、革蘭陰性敗血癥、培養(yǎng)陰性敗血癥、真菌性敗血癥、中性粒細(xì)胞減少性發(fā)熱、急性胰腺炎、尿膿毒癥、格拉夫斯病、雷諾病、抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒型、III型超敏反應(yīng)、POEMS綜合征(多神經(jīng)病、器官巨大癥、內(nèi)分泌病、單克隆丙種球蛋白病和皮膚改變綜合征)、混合型結(jié)締組織病、特發(fā)性阿狄森病、糖尿病、慢性活動性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、白癜風(fēng)、MI后(心切開術(shù))綜合征、IV型超敏癥、胞內(nèi)生物體引起的肉芽腫、威爾遜病、 血色病、a -1-抗胰蛋白酶缺陷、糖尿病視網(wǎng)膜病、橋本甲狀腺炎、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、甲狀腺炎、腦脊髓炎、新生兒慢性肺病、家族性噬血淋巴組織細(xì)胞增多病(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)、脫發(fā)、放療(包括例如但不限于:虛弱、貧血、 惡病質(zhì)等)、慢性水楊酸中毒、睡眠性呼吸暫停、肥胖、心力衰竭和腦膜炎球菌血癥；
[0356](同種異體移植物排斥)腎臟、心臟、肝臟、肺、胰腺、骨髓、骨、小腸、皮膚、軟骨和角膜移植后的急性和慢性排斥；和慢性移植物抗宿主??；
[0357](惡性疾病)白血病、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)，急性白血病，T細(xì)胞、B細(xì)胞或FAB ALL，慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)、急性髓細(xì)胞性白血病(AML)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、毛細(xì)胞性白血病、骨髓異常增生綜合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、惡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、惡性組織細(xì)胞增多病、腫瘤伴隨綜合征/惡性高鈣血癥、實體瘤、腺癌、 肉瘤、惡性黑色素瘤、血管瘤、轉(zhuǎn)移病、癌癥相關(guān)性骨再吸收、癌癥相關(guān)性骨痛；癌癥轉(zhuǎn)移的抑制；癌癥惡病質(zhì)的改進(jìn)；
`[0358]囊性纖維化病，中風(fēng),心臟、腦、四肢(peripheral limbs)和其它器官的再灌注損傷；
[0359]燒傷、外傷/出血、電離輻射照射、慢性皮膚潰瘍；
[0360]生殖疾病(如排卵、月經(jīng)和著床的疾病，早產(chǎn)，先兆子癇，子宮內(nèi)膜異位)；
[0361](感染)急性或慢性細(xì)菌感染，急性和慢性寄生過程或感染過程，包括細(xì)菌、病毒和真菌感染、HIV感染/HIV神經(jīng)病、腦膜炎、肝炎(甲型、乙型或丙型、或者其它病毒性肝炎等)、膿毒性關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、肺炎、會厭炎、大腸桿菌0157:h7、溶血尿毒癥綜合征/血栓性血小板減少性紫癜、瘧疾、登革出血熱、利什曼病、麻風(fēng)病、中毒性休克綜合征、鏈球菌性肌炎、氣性壞疽、結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、鳥_胞內(nèi)分枝桿菌、卡氏肺囊蟲(pneumocystis carinii)性肺炎、盆腔炎疾病、睪丸炎/附睪炎、軍團(tuán)菌、萊姆病、甲型流感、愛波斯坦-巴爾病毒、致命相關(guān)性曬血綜合征(vital-associated hemaphagocytic syndrome)、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎等。
[0362]因此，本發(fā)明提供治療IL-6相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將有效量的一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員單獨或以聯(lián)合治療方案與本領(lǐng)域已知或本文所述的另一合適藥物聯(lián)合給予需要的患者。
[0363]本文其它地方小結(jié)了 IL-6參與某些疾病的證據(jù)。此外，本文提供的數(shù)據(jù)還說明， 本發(fā)明結(jié)合成員可用于治療這類疾病，包括預(yù)防性治療和降低這些疾病的嚴(yán)重程度。因此， 本發(fā)明提供了一種治療或減輕本文所述任何疾病的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度的方法，包括將有效量的一種或多種本發(fā)明結(jié)合成員單獨或以組合治療方案與本 領(lǐng)域已知或本文所述的另一種合適藥物聯(lián)合給予有此需要的患者，從而能降低上述疾病的至少一種癥狀的嚴(yán)重程度。
[0364]因此，本發(fā)明結(jié)合成員可用作治療劑，用于治療與IL-6和/或IL_6Ra表達(dá)和/或活性，特別是表達(dá)/活性異常有關(guān)的疾病或失調(diào)。一種治療方法可包括將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員給予需要其的患者，其中IL-6和/或IL-6Ra的異常表達(dá)和/或活性降低。一種治療方法可包括(i)鑒定證明IL-6:1L-6Ra水平或活性異常的患者，例如采用上述診斷方法， 和(ii)將有效量的本發(fā)明結(jié)合成員給予該患者，其中IL-6Ra和/或IL-6的異常表達(dá)和/ 或活性降低。根據(jù)本發(fā)明，有效量是能降低IL-6和/或IL-6Ra的異常表達(dá)和/或活性的用量，從而能降低或減輕所治療疾病或病癥的至少一種癥狀，但無需治愈該疾病或病癥。
[0365]本發(fā)明也一種提供拮抗IL-6的至少一種作用的方法，所述方法包括接觸或給予有效量的一種或多種結(jié)合成員，以便拮抗IL-6的所述至少一種作用。可被本發(fā)明方法拮抗的IL-6的作用包括IL-6與gpl30的結(jié)合和此種結(jié)合后產(chǎn)生的下游效應(yīng)。
[0366]因此，本發(fā)明的其它方面提供治療方法，包括給予所提供的結(jié)合成員、包含這種結(jié)合成員的藥物組合物，以及這種結(jié)合成員在制備給予的藥物中的應(yīng)用，例如制備藥物或藥物組合物的方法，包括用藥學(xué)上可接受的賦形劑配制結(jié)合成員。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是化合物或化合物的組合，其可納入藥物組合物但不會造成繼發(fā)性反應(yīng)并能，例如促進(jìn)活性化合物的給予，增加其體內(nèi)壽命和/或其效力，增加其在溶液中的溶解度或者延長其儲存時間。這些藥學(xué)上可接受的載體是熟知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可改進(jìn)這些載體以適應(yīng)所選擇活性化合物的性質(zhì)和給藥方式。
[0367]本發(fā)明結(jié)合成員通常以藥物組合物的形式給予，所述組合物可包含除結(jié)合成員外的至少一種成分。因此，為用于本發(fā)明，除活性成分外，本發(fā)明的藥物組合物可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它物質(zhì)。這些物質(zhì)應(yīng)無毒，不應(yīng)干擾活性成分的效力。載體或其它物質(zhì)的精確性質(zhì)取決于給藥途徑，其可以是口月艮、吸入、氣管內(nèi)、局部、囊內(nèi)或經(jīng)注射給藥，如下所述。
[0368]本發(fā)明還考慮了口服給予的藥物組合物，例如單結(jié)構(gòu)域抗體分子(如納米抗體?) 等。這種口服制劑可以是片劑、膠囊、粉末、液體或半固體形式。片劑可以包含固體載體，例如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包含液體載體，例如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成的油?？梢园ㄉ睇}溶液、葡萄糖或其它糖溶液或甘油，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0369]對于靜脈內(nèi)注射，或在病患部位注射，活性成分可以是胃腸外可接受的水溶液形式，其不含熱原，pH、等滲性和穩(wěn)定性合適。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員能利用，例如等滲載體， 例如氯化鈉注射液、林格注射液、乳酸林格注射液制備合適的溶液。如果需要，可利用防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液、抗氧化劑和/或其它添加劑，包括緩沖液，例如磷酸、檸檬酸和其它有機酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苯甲烴銨，氯化芐乙氧銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3’ -戊醇；和間-甲酚)；低分子量多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ;糖，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物(例如，Zn-蛋白絡(luò)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫?、普流羅尼克?或聚乙二醇(PEG)。
[0370]根據(jù)分子的理化特性和遞送途徑，可將本發(fā)明結(jié)合成員配制成液體、半固體或固體形式。制劑可包含，例如以下賦形劑或賦形劑的組合:糖、氨基酸和表面活性劑。液體制劑包含的抗體濃度和PH范圍很廣?？赏ㄟ^，例如冷凍干燥、噴霧干燥或超臨界液體技術(shù)干燥來制備固體制劑。結(jié)合成員的制劑取決于所需遞送途徑:例如，肺部遞送的制劑可由其物理特性確保在吸入后能透入肺深部的顆粒構(gòu)成；局部制劑(例如用于治療疤痕，如皮膚疤痕的局部制劑)可包含能延長藥物在作用部位停留時間的粘性改性劑。可用能防止結(jié)合成員快速釋放的載體制備結(jié)合成員，例如控釋制劑，包括植入體、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)?？衫蒙锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、 聚原酸酯和聚乳酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備這些制劑的許多方法[109]。
[0371]可口服(例如單結(jié)構(gòu)域抗體分子(例如〃納米抗體?〃))、通過注射(例如，皮下、 關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)或肌肉內(nèi))、通過吸入、氣管內(nèi)、囊內(nèi)途徑(滴注入膀胱)或通過局部(例如，眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、給入傷口或給予皮膚上)給予治療。可通過脈沖輸注， 特別是以劑量漸降的結(jié)合成員來給予治療。可以通過治療的理化特征、通過疾病的具體考慮因素或優(yōu)化效力或盡可能降低副作用的要求來決定給藥途徑。一種具體的給藥途徑是靜脈內(nèi)。給予本發(fā)明藥物組合物的另一種途徑是皮下。估計治療不會局限于在診所中使用。 因此，優(yōu)選利用無針頭裝置的皮下注射。
[0372]組合物可單獨給藥或與其它治療聯(lián)合給藥，聯(lián)合給藥可以是同時或依次進(jìn)行的， 這取決于所要治療的病癥。
[0373]本發(fā)明結(jié)合成員可作為組合治療的一部分與其它藥物組分聯(lián)用。可采用組合治療提供明顯的協(xié)同作用，特別是本發(fā)明結(jié)合成員與一種或多種其它藥物的組合。就治療本文所述的一種或多種疾病而言，本發(fā)明結(jié)合成員可同時或依次或作為含另一種治療劑或多種藥劑的`組合制品而給予。
[0374]本發(fā)明結(jié)合成員可用作化學(xué)增敏劑以提高細(xì)胞毒劑的療效，因此可與一種或多種細(xì)胞毒劑同時或依次聯(lián)合給藥。結(jié)合成員也可用作射線增敏劑以提高放療療效，因此可與放療同時或依次聯(lián)合給藥。
[0375]可以組合或加入了一種或多種以下藥劑的形式提供本發(fā)明結(jié)合成員:[0376]-細(xì)胞因子或者細(xì)胞因子功能的激動劑或拮抗劑(例如，作用于細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)途徑的藥劑，例如SOCS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑)，例如a'p-和/或Y -干擾素；1型胰島素樣生長因子(IGF-1)、其受體和相關(guān)結(jié)合蛋白；白介素(IL)，例如IL-1-33中的一種或多種，和 /或白介素拮抗劑或抑制劑，例如阿那白滯素；白介素家族成員的受體的抑制劑或這些受體的特定亞單位的抑制劑；腫瘤壞死因子a (TNF-a)抑制劑，例如抗-TNF單克隆抗體(例如，英夫利昔單抗；阿達(dá)木單抗和/或CDP-870)、和/或TNF受體拮抗劑，例如免疫球蛋白分子(例如依那西普)和/或低分子量藥劑，例如已酮可可堿(pentoxyfylline)；
[0377]-B細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，例如靶向B-淋巴細(xì)胞(例如⑶20 (利妥昔單抗)或MRA_aIL16R) 或T-淋巴細(xì)胞(例如，CTLA4_Ig、HuMax 11-15或阿巴西普(Abatac印t))的單克隆抗體；
[0378]-抑制破骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)劑，例如RANKL的抗體；
[0379]-趨化因子或趨化因子受體功能的調(diào)節(jié)劑，例如以下趨化因子的拮抗劑:CCR1、 CCR2、CCR2A、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRlO 和 CCRll (就 C-C 家族而言);CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4 和 CXCR5 及 CXCR6 (就 C-X-C 家族而言)和 C-X3-C 家族的 CX3CRl ；
[0380]-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，即以下一種或多種的抑制劑:間質(zhì)溶解素、膠原酶和明膠酶以及聚集蛋白聚糖酶；特別是膠原酶-1 (MMP-1)、膠原酶-2 (MMP-8)、膠原酶-3 (MMP-13)、間質(zhì)溶解素-1 (MMP-3)、間質(zhì)溶解素_2 (MMP-10)和/或間質(zhì)溶解素-3 (MMP-1l)和/或MMP-9和/或MMP-12，例如強力霉素等藥劑；
[0381]-白三烯生物合成抑制劑、5-脂肪氧合酶(5-L0)抑制劑或5-脂肪氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗劑，例如:齊留通；ABT-761 ;芬留頓；替泊沙林；Abbott-79175 ； Abbott-85761 ;N-(5-取代的)-噻吩-2-烷基磺酰胺；2，6-二叔丁基苯酚腙；甲氧基四氫吡喃，例如澤尼卡ZD-2138 ;化合物SB-210661 ;吡啶基-取代的2-氰基萘化合物，例如 L-739, 010 ；2-氰基喹啉化合物，例如L-746，530 ;吲哚和/或喹啉化合物，例如MK-591、 MK-886 和 / 或 BAY xl005 ；
[0382]-白三烯(LT)B4、LTC4、LTD4和LTE4的受體拮抗劑，選自:吩噻嗪_3_ls，例如 L-651, 392 ;脒基化合物，例如CGS_25019c ;氨基苯并惡唑類(benzoxalamines),例如昂唑司特；節(jié)脒類(benzenecarboximidamides),例如BIIL284/260 ;和諸如扎魯 司特、阿魯司特、孟魯司特、普侖司特、維魯司特(MK-679)、RG-12525、Ro-245913、伊拉司特(CGP45715A) 和BAY x7195等化合物；
[0383]-磷酸二酯酶(F1DE)抑制劑,例如甲基黃嘌呤(methylxanthanine),如茶堿和/或氨茶堿；和/或選擇性PDE同工酶抑制劑，例如TOE4抑制劑和/或同種型PDE4D的抑制劑， 和/或PDE5抑制劑；
[0384]-1型組胺受體拮抗劑，例如西替立嗪、氯雷他定、地氯雷他定、非索非那定、阿伐斯汀、特非那定、阿司咪唑、氮卓斯汀、左卡巴司汀、氯苯那敏、普魯本近、賽克利嗪和/或咪唑斯汀(通?？诜?、局部或胃腸外應(yīng)用)；
[0385]-質(zhì)子泵抑制劑(例如奧美拉唑)或胃保護(hù)性組胺2型受體拮抗劑；
[0386]-組胺4型受體拮抗劑；
[0387]-a-l/a-2腎上腺素受體激動劑、血管收縮劑、擬交感神經(jīng)藥，例如環(huán)己丙甲胺、 苯福林、苯丙醇胺、麻黃素、偽麻黃堿、鹽酸萘甲唑啉、鹽酸氧甲唑啉、鹽酸四氫唑啉、鹽酸木甲唑啉、鹽酸曲馬唑啉和鹽酸乙基去甲腎上腺素；
[0388]-抗膽堿能藥，例如毒蕈堿受體(Ml、M2和M3)拮抗劑，例如阿托品、東莨菪堿、甘羅溴銨(glycopyrrrolate)、異丙托溴銨、噻托溴銨、氧托溴銨、哌侖西平和替侖西平；
[0389]-(6-腎上腺素受體激動劑(包括0受體亞型1-4)，例如異丙腎上腺素、柳丁氨醇、福莫特羅、沙美特羅、叔丁喘寧、間羥異丙腎上腺素、雙甲苯喘定甲磺酸鹽和/或吡布特羅，例如它們的手性對映體；
[0390]-色酮，例如色甘酸鈉和/或奈多羅米鈉；
[0391]-糖皮質(zhì)激素，例如氟尼縮松、羥氫化潑尼松縮丙酮、二丙酸氯地米松、布地奈德、 丙酸氟替卡松、環(huán)索奈德和/或糠酸莫米松；
[0392]-調(diào)節(jié)核激素受體的藥劑，例如PPAR；
[0393]-免疫球蛋白(Ig)或Ig制品或調(diào)節(jié)Ig功能的拮抗劑或抗體，例如抗_IgE(例如， 奧瑪立珠單抗(奧馬珠單抗));
[0394]-其它全身性或局部應(yīng)用的抗炎藥，例如沙利度胺或其衍生物、類維生素A、蒽三酚和/或卡泊三醇；
[0395]-氨基水楊酸鹽和磺胺吡啶的組合，例如柳氮磺吡啶、美沙拉秦、巴柳氮和奧沙拉秦；免疫調(diào)節(jié)劑，例如巰基嘌呤(thiopurines)和皮質(zhì)類固醇,例如布地奈德；
[0396]-抗菌劑，例如青霉素衍生物、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯類、內(nèi)酰胺、氟喹諾酮、甲硝噠唑和/或吸入性氣基糖昔類；和/或抗病毒劑，例如阿昔洛維、泛昔洛韋、纟顏昔洛韋、更昔洛韋、西多福韋；二環(huán)癸燒胺、金剛乙胺；利巴韋林；扎那米韋和/或奧塞米韋；蛋白酶抑制劑，例如印地那韋、那非那韋、利托那韋和/或沙奎那韋；核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如地達(dá)諾新、拉米夫定、司他夫定、扎西他濱、齊多夫定；非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如奈韋拉平、依法韋侖；
[0397]-心血管藥物，例如`鈣通道阻斷劑、(6-腎上腺素受體阻斷劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 (ACE)抑制劑、血管緊張素-2受體拮抗劑；降脂劑，例如他汀類和/或貝特類；血細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié)劑，例如已酮可可堿；溶解血栓和/或抗凝劑，例如血細(xì)胞聚集抑制劑；
[0398]-CNS藥，例如抗抑郁藥(例如舍曲林)、抗-帕金森藥(例如塞利吉林、左旋多巴、 羅平尼咯、普拉克索、MAOB抑制劑,如塞樂金(selegine)和雷沙吉蘭、comP抑制劑,如托卡朋、A-2抑制劑、多巴胺再攝取抑制劑、NMDA拮抗劑、煙堿激動劑、多巴胺激動劑和/或神經(jīng)元一氧化氮合酶抑制劑)和抗阿爾茨海默病藥物，例如多奈哌齊、利凡斯的明、他克林、 C0X-2抑制劑、丙戊茶堿或美曲磷酯；
[0399]-治療急性和慢性疼痛的藥劑，例如中樞或外周作用的鎮(zhèn)痛劑，例如阿片類似物或衍生物、卡巴米嗪、苯妥英、丙戍酸鈉、阿米替林(amitryptiline)或其它抗抑郁藥、對乙酰氨基酚或非類固醇抗炎藥；
[0400]-胃腸外或局部-應(yīng)用的(包括吸入的)局部麻醉劑，例如利諾卡因或其類似物；
[0401]-抗-骨質(zhì)疏松劑，例如激素藥物，如雷洛昔芬或雙膦酸鹽，如阿倫膦酸鹽；
[0402]-⑴胰蛋白酶抑制劑；(ii)血小板活化因子(PAF)拮抗劑；(iii)白介素轉(zhuǎn)換酶 (ICE)抑制劑；(iV)MPDH抑制劑；(v)粘附分子抑制劑，包括VLA-4拮抗劑；(vi)組織蛋白酶；(vii)激酶抑制劑，例如酪氨酸激酶抑制劑(例如，Btk、Itk、Jak3MAP抑制劑的例子可包括吉非替尼(Gefitinib)、甲磺酸伊馬替尼)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(例如，MAP激酶，如p38、JNK、蛋白激酶A、B和C及IKK的抑制劑)、或參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的激酶(例如，依賴周期蛋白的激酶)；(viii)葡萄糖-6磷酸脫氫酶抑制劑；(ix)激肽-B1-和/或B2 -受體拮抗劑； (X)抗-痛風(fēng)藥劑，例如秋水仙素；(xi)黃嘌呤氧化酶抑制劑，例如別嘌呤醇；(xii)排尿酸劑，例如，丙磺舒、苯磺唑酮和/或苯溴馬?。?xiii)生長激素促分泌素；(xiv)轉(zhuǎn)化生長因子(TGFP) ；(xv)血小板衍生的生長因子(TOGF) ； (xvi)成纖維細(xì)胞生長因子，例如堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) ; (xvii)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) ；(xviii)辣椒堿乳膏；(xix)速激肽NK1和/或NK3受體拮抗劑，例如NKP-608C、SB-233412 (他奈坦)和/ 或D-4418 ； (XX)彈性蛋白酶抑制劑，例如UT-77和/或ZD-0892 ； (xxi) TNF- a轉(zhuǎn)化酶抑制劑(TACE) ； (xxii)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抑制劑或(xxiii)表達(dá)在TH2細(xì)胞上的化學(xué)引誘物受體-同源分子，(例如，CRTH2拮抗劑)；(xxiV)P38的抑制劑；(xxv)調(diào)節(jié)Toll-樣受體(TLR)的功能的藥劑和(xxvi)調(diào)節(jié)嘌呤能受體活性的藥劑，例如P2X7 ; (xxvii)轉(zhuǎn)錄因子活化的抑制劑，例如NFkB、API和/或STATS。
[0403]抑制劑可以是特異性抑制劑或可以是混合型抑制劑，例如靶向上述多種分子(例如受體)或分子類型的抑制劑。
[0404]結(jié)合成員還可以共同給予或免疫偶聯(lián)物的形式與化療劑或另一種酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)用。所述抗體非片段還可用在通過重組機制或生物化學(xué)偶聯(lián)獲得的雙特異性抗體中，從而能結(jié)合上述抗體的特異性與其它抗體的特異性，所述其它抗體能識別涉及IL-6有關(guān)活性的其它分子。
[0405]為了治療炎性疾病，本發(fā)明結(jié)合成員可與一種或多種藥物聯(lián)用，這些藥物包括例如，非類固醇抗炎藥(以下稱為NSAID)，包括無選擇性環(huán)加氧酶(C0X)-l/C0X-2抑制劑， 無論局部或全身性應(yīng)用(例如吡羅昔康、雙氯芬酸、丙酸，如甲氧萘丙酸、氟比洛芬、非諾洛芬、酮洛芬和布洛芬、芬那酯，如甲芬那酸、吲哚美辛、舒林酸、阿扎丙宗、吡唑酮，例如苯丁唑酮、水楊酸鹽，例如阿司匹林)；選擇性C0X-2抑制劑(例如，美洛昔康、塞來考昔、羅非考昔、伐地考昔、陸瑪考昔(Iumarocoxib)、帕瑞考昔和艾托考昔)；抑制一氧化氮供體的環(huán)加氧酶(CINODs);糖皮質(zhì)激素(無論通過局部、口服、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)途徑)；甲氨蝶呤、來氟米特；羥氯喹、d-青霉胺、金諾芬或其它胃腸外或口服金制品；鎮(zhèn)痛劑；雙醋瑞因； 關(guān)節(jié)內(nèi)治療，例如透明質(zhì)酸衍生物；和營養(yǎng)添加劑，例如葡糖胺。
[0406]本發(fā)明結(jié)合成員還可與治療癌癥的現(xiàn)有治療劑組合使用?？山M合使用的合適藥劑包括:
[0407](i)用于醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)的抗增殖/抗腫瘤藥物和它們的組合，例如格列衛(wèi)(甲磺酸伊馬替尼)、烷化劑(例如，順鉬、碳鉬、環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、瘤可寧、白消安和亞硝基脲)； 抗代謝物(例如，抗葉酸劑，如氟嘧啶，如5-氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羥基脲、吉西他濱和紫杉醇；抗腫瘤抗生素(例如，蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素、博來霉素、多柔比星、道諾霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素-C、更生霉素和光輝霉素)；抗(有絲分)裂劑(例如，長春花堿，如長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱及紫杉烷，如紫杉酚和泰索帝)；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，鬼臼乙叉甙，如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、 托泊替康及喜樹堿)；
[0408](ii)細(xì)胞抑制藥，例如抗雌激素(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和吲哚昔芬(iodoxyfene))、雌激素受體下調(diào)劑(例如，氟維司群)、抗雄激素(例如，比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特和醋酸環(huán)丙氯地孕酮)、LHRH拮抗劑或LHRH激動劑(例如，戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如，醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制劑(例如，阿那曲唑、來曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦)和5 a -還原酶的抑制劑，例如非那雄胺；[0409](iii)抑制癌細(xì)胞侵襲的藥劑(例如，金屬蛋白酶抑制劑，如馬立馬司他和尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑受體功能的抑制劑)；
[0410](iv)生長因子功能的抑制劑，例如，這種抑制劑包括生長因子抗體、生長因子受體抗體(例如，抗-erbb2抗體，曲妥珠單抗和抗-erbbl抗體西妥昔單抗[C225])、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑和絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑，例如，表皮生長因子家族抑制劑(例如，EGFR家族酪氨酸激酶抑制劑，如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基_6_(3_嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼、AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6，7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(埃羅替尼(埃羅替尼)、0S1-774)和6-丙烯基酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉基丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI1033))，例如，血小板衍生的生長因子家族的抑制劑和例如，肝細(xì)胞生長因子家族的抑制劑；
[0411](v)抗血管生成藥劑，例如抑制血管內(nèi)皮生長因子的作用的那些藥劑，(例如，抗血管內(nèi)皮生長因子抗體貝伐珠單抗、國際專利申請W097/22596、W097/30035、W097/32856 和TO98/13354公開的化合物，各份專利全文納入本文)和以其它機制起作用的化合物(例如，利諾胺、整聯(lián)蛋白a 3功能的抑制劑和血管他丁)；
[0412](vi)血管破壞劑，例如考布他汀A4和國際專利申請W099/02166、W000/40529、 W000/41669、W001/92224、W002/04434和W002/08213中公開的化合物(通過引用將各份專利全文納入本文)；
[0413](vii)反義治療,例如,針對上述祀標(biāo)的那些,如ISIS2503、抗-ras反義；
[0414](viii)基因治療方法，包括例如，替代異常基因，如異常P53或異常BRCAl或 BRCA2的方法、GDEPT(基因指導(dǎo)的酶前藥治療)方法，例如利用胞嘧啶脫氨酶、胸苷激酶或細(xì)菌硝基還原酶的那些方法和增加患者對化療或放療耐受性的方法，例如多藥抗性基因治療；和
[0415](ix)免疫治療方法，包括例如，離體和體內(nèi)方法以增加患者腫瘤細(xì)胞的免疫原性， 如用細(xì)胞因子，如白介素2、白介素4或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子轉(zhuǎn)染，降低T細(xì)胞無反應(yīng)性的方法，利用轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞，例如細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的樹突細(xì)胞的方法，利用細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系的方法和利用抗獨特型抗體的方法。
[0416]本發(fā)明的結(jié)合成員和一種或多種上述其它醫(yī)學(xué)組分可用于制備藥物。藥物可以單獨或組合給予個體，因此可包含結(jié)合成員和其它組分，例如組合制品或單獨的制品。單獨的制品可用于促進(jìn)單獨且依次或同時給藥，并能通過不同途徑，例如口服和胃腸外給藥而給予諸組分。
[0417]按照本發(fā)明，提供的組合物可給予哺乳動物。給藥通常是對于患者足以顯示益處的“治療有效量”。這種益處可以至少緩解至少一種癥狀。所給予的實際量和給藥速度及時程取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，所治療的具體哺乳動物，各患者的臨床情況，疾病的誘因，組合物的遞送部位，結(jié)合成員的類型，給藥方法，給藥時間表和醫(yī)學(xué)從業(yè)人員已知的其它因素。普通從業(yè)人員和其它醫(yī)生負(fù)責(zé)治療處方，例如劑量的決定等，其取決于所治療疾病癥狀的嚴(yán)重程度和/或進(jìn)展。合適的抗體劑量是本領(lǐng)域熟知的[110，111]?？衫眠m合于所給予藥物類型的本文所述或Physician’s Desk Reference (醫(yī)師案頭參考)(2003) 的具體劑量?？赏ㄟ^在動物模型中比較其體外活性和體內(nèi)活性來測定本發(fā)明結(jié)合成員的治療有效量或合適劑量。已知將小鼠和其它測試動物中的有效劑量外推至人的方法。精確劑量取決于許多因素，包括抗體是用于診斷、預(yù)防還是治療，治療區(qū)域的大小和部位，抗體的精確性質(zhì)(例如，全抗體、片段或雙抗體)和任何可檢測標(biāo)記物或與抗體相連的其它分子的性質(zhì)。對于全身性給藥，典型抗體劑量是100 ii g-lg,對于局部應(yīng)用是I ii g-lmg。可以先給予較高的加載劑量，然后給予一次或多次較低劑量?？贵w一般是全抗體，例如IgGl同種型。 這是成年患者單次治療的劑量，對于兒童和嬰兒可作適當(dāng)調(diào)整，對于其它抗體形式也可根據(jù)分子量成比例地調(diào)節(jié)。治療可遵醫(yī)囑以每日一次、每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復(fù)。治療可以是每2-4周皮下給予和每4-8周靜脈內(nèi)給予。治療可以是周期性的，給藥之間的時期約為兩周或更長，例如約3周或更長，約4周或更長，或約每月一次?？梢栽谑中g(shù)前和/或手術(shù)后給予治療，和/或可以在手術(shù)治療的解剖部位直接給予或施用。
[0418]在劑量和給藥要求方面，與sIL_6Ra的抗體相比，本發(fā)明IL_6結(jié)合成員具有優(yōu)勢。 如本文其它地方所述，患病時IL-6的循環(huán)水平顯著低于sIL-6Ra的循環(huán)水平。因此，與抗-1L-6R結(jié)合成員相反，使用IL-6結(jié)合成員具有顯著優(yōu)勢，因為所生產(chǎn)的給予患者的每劑量藥量可能較低。另外，如果抗-1L6治療的劑量較低，則可能有明顯優(yōu)勢，因為較低劑量有利于皮下注射和靜脈內(nèi)(1.v.)注射。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，皮下給藥可能受每劑量所需的結(jié)合成員，如抗體分子含量的限制。這是因為皮下注射受限于皮膚某一部位可注射的體積。 一般利用的皮下注射體積為1.2ml或更少。由于在濃度高于50mg/ml時配制用于皮下注射的結(jié)合成員的難度增加，所以通過此種途徑給予IOOmg以上的劑量通常需要多次注射，這對于患者來說更為不適。
[0419]與全身性sIL_6Ra相比，較低劑量的抗_IL_6治療也可能需要較低“加載”劑量的抗體來抑制所有全身性IL-6，因為其濃度較高。
[0420]其它益處可能與靶向IL-6而非IL-6受體有關(guān)，這代表與IL_6Ra的結(jié)合成員相比本發(fā)明結(jié)合成員具有額外優(yōu)點。
[0421]例如,有文獻(xiàn)報道稱，患病時IL-6循環(huán)水平顯著低于sIL_6Ra的循環(huán)水平[112, 113]。由于SIL-6R的水平顯著高于IL-6的水平，所以與中和IL-6所需的抗-1L-6結(jié)合成員量相比,可能需要更多抗-sIL-6R結(jié)合成員來中和sIL-6Ra。因此，與使用抗-受體結(jié)合成員時相比，可能需要較低劑量的抗-配體結(jié)合成員。
[0422]靶向IL-6配體而非IL-6受體可降低疾病中的IL_6水平，但仍然允許IL_6水平在感染期間升高，其中IL-6作為免疫應(yīng)答的一部分被上調(diào)。
[0423]Krebs等[4]證明，IL_6是有效的生長因子，從患者新鮮分離的骨髓瘤細(xì)胞能產(chǎn)生 IL-6并表達(dá)其受體。而且，抗-1L-6抗體能抑制骨髓瘤細(xì)胞的體外生長。這是人骨髓瘤腫瘤發(fā)生中自分泌環(huán)工作的直接證據(jù)。該研究之后，Van Zaanen等[5]證明用抗_IL_6配體抗體治療時，多發(fā)性骨髓瘤患者中IL-6產(chǎn)量降低。
[0424]許多進(jìn)一步研究證明，IL-6參與了其它細(xì)胞類型，例如平滑肌細(xì)胞(SMC) [114]、 U373-MG星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞[115]、3T3脂肪細(xì)胞[116]、神經(jīng)元[117]、內(nèi)皮細(xì)胞[118]和卡波濟(jì)氏肉瘤細(xì)胞[119]的自分泌反饋環(huán)。因此，在疾病中用抗-1L6結(jié)合成員抑制IL-6 可導(dǎo)致IL-6的基礎(chǔ)疾病產(chǎn)量降低。[0425]另外，抗-1L-6結(jié)合成員結(jié)合全身循環(huán)中的IL-6，相反，IL_6受體的結(jié)合成員則需要穿透組織以占據(jù)參與所治療疾病病理的細(xì)胞表面上的受體。
[0426]在全身循環(huán)中IL-6結(jié)合成員可與IL-6形成平衡，產(chǎn)生跨越屏障如滑膜的梯度，其凈效應(yīng)是去除關(guān)節(jié)中的活性IL-6和與結(jié)合成員形成失活復(fù)合物。其結(jié)果是，與IL-6R結(jié)合成員相比，IL-6結(jié)合成員可較快起效，劑量方案可以不同，且可能易于優(yōu)化。
[0427]IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是由IL-6與IL-6R結(jié)合和該復(fù)合物與gpl30結(jié)合介導(dǎo)的。倘若 IL-6和IL-6Ra的結(jié)合親和力為納摩爾級(約5nM)，IL6:1L6R復(fù)合物和gpl30結(jié)合親和力為皮摩爾級，那么對于結(jié)合IL-6，靶向IL-6的結(jié)合成員面臨的競爭較低，因此可能抑制較高比例的IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然這也可能適用于靶向可溶性IL-6Ra和防止IL_6:1L_6Ra復(fù)合物形成的結(jié)合成員，但如果IL_6Ra是膜結(jié)合的，那么由于空間限制，抗IL-6Ra可能更加難以結(jié)合并抑制膜上的IL-6Ra。
實施例[0428]實施例1先導(dǎo)物分離
[0429]1.1 選擇
[0430]利用克隆入依據(jù)絲狀噬菌體M13的噬菌粒載體的原初人單鏈Fv(ScFv)噬菌體展示文庫進(jìn)行選擇[120,121]?；救缫郧癡aughan等[120]和Hawkins等[122]所述,利用一系列重組人IL-6的選擇循環(huán)由噬菌體展示文庫分離抗IL-6特異性scFv抗體。簡言之，在生物淘選中，將PBS(杜貝克(Dulbecco)PBS, pH7.4)配制的人IL-6吸附在微量滴定板的各孔上，4°C過夜。用PBS洗滌各孔，然后用PBS-Marvel (3%w/v)封閉I小時。將 PBS-Marvel (3%w/v)配制的純化噬菌體加入各孔，使之與包被的抗原結(jié)合I小時。用PBS-吐溫(0.l%v/v)和PBS進(jìn)行多輪洗滌以除去未結(jié)合的噬菌體。洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒，感染入細(xì)菌并拯救以進(jìn)行下一輪選擇[120]。
[0431]1.2通過粗制scFv抑制IL-6與IL-6受體的結(jié)合
[0432]使代表性數(shù)量的第二輪選擇的各克隆在96-孔板中生長。在細(xì)菌周質(zhì)中表達(dá) ScFv,米用HTRF? (時間分辨的均一突光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence), CIS生物國際公司(CIS Bio international))人IL-6/人IL-6受體結(jié)合試驗篩選它們的抑制活性。在本試驗中，樣品與生物素化IL_6R(派普技術(shù)公司(Peprotech))競爭結(jié)合穴合物標(biāo)記的人IL-6(R&D系統(tǒng)公司(R&D Systems))。在所有效力試驗中包含參比抗-1L-6mAb (生物源公司(Biosource)AHC0562)作為陽性對照。詳細(xì)的試驗方法見材料與方法章節(jié)。
[0433]1.3 將 scFv 變型(reformatting)成 IgGl
[0434]通過將\^和\結(jié)構(gòu)域分別亞克隆入表達(dá)完整的抗體重鏈和輕鏈的載體而將克隆從scFv轉(zhuǎn)換成IgG形式。將Vh結(jié)構(gòu)域克隆入含有人重鏈恒定域和調(diào)節(jié)元件的載體 (PEU15.1)以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)完整的IgG重鏈。相似地，將VL結(jié)構(gòu)域與調(diào)控元件克隆到載體PEU3.4中表達(dá)人K輕鏈或克隆到pEU4.4中表達(dá)人\輕鏈恒定區(qū)，從而在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)完整的IgG輕鏈。參考文獻(xiàn)[123]首先描述了表達(dá)重鏈和輕鏈的載體。可通過引入OriP元件簡單地工程改造劍橋抗體技術(shù)公司(Cambridge Antibody Technology)的載體。為獲得IgG，將重鏈和輕鏈IgG表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入EBNA-HEK293哺乳動物細(xì)胞。IgG經(jīng)表達(dá)分泌入培養(yǎng)基。合并收集物，過濾后純化。采用A蛋白層析純化IgG。將培養(yǎng)物上清液加載于大小合適的A蛋白陶瓷柱(生物譜公司(BioS印ra))上，用50mM Tris-HCl pH8.0,250mM NaCl洗滌。利用0.1M檸檬酸鈉(pH3.0)將結(jié)合的IgG從柱上洗脫，加入Tris-HCl (pH9.0) 中和。利用NaplO柱(安瑪西亞公司(Amersham),第17-0854-02號)將洗脫物質(zhì)的緩沖液替換成PBS，利用基于IgG的氨基酸序列的消光系數(shù)，通過分光光度法測定IgG的濃度 [124]。采用SEC-HPLC和SDS-PAGE分析純化IgG的凝聚或降解。
[0435]1.4通過純化的scFv和IgG抑制IL_6與IL_6受體的結(jié)合
[0436]對IL-6A:1L_6RA相互作用顯示明顯抑制作用的scFv (作為周質(zhì)粗提物)進(jìn)行DNA 測序[120,125]。再次在細(xì)菌中表達(dá)獨特scFv,并通過親和層析純化(如Bannister等 [126]所述)。這些克隆的純化IgG樣品也可按照章節(jié)1.3所述來制備。通過與針對抗生物素化SIL-6R的純化制劑的連續(xù)稀釋液競爭結(jié)合HIS FLAG標(biāo)記的人IL-6 (內(nèi)部大腸桿菌衍生的)來確定這些樣品的功效。
[0437]作為具有人重鏈和K輕鏈恒定區(qū)的scFv和IgG，克隆CAN022D10的結(jié)果見表1。 材料和方法章節(jié)提供了詳細(xì)方案。
[0438]表1:CAN022D10scFv和IgG在受體-配體HTRF生化實驗中的功效
[0439]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的人IL-6結(jié)合成員，經(jīng)表面等離振子共振測定，其結(jié)合人IL-6的Kd不超過 30pM。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述Kd不超過10pM。
3.一種分離的人IL-6結(jié)合成員，其在殘基Phel02和/或Ser204上結(jié)合人IL-6，所述殘基編號是按照全長人IL-6氨基酸序列SEQ ID NO: 161定義的。
4.如權(quán)利要求3所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述結(jié)合成員在殘基Arg207上結(jié)合人 IL-6。
5.一種分離的人IL-6結(jié)合成員，其中在抑制0.6pM人IL-1P和2.4nM可溶性人 IL-6Ra刺激人滑膜成纖維細(xì)胞釋放VEGF的實驗中所述結(jié)合成員的IC5tl小于InM。
6.如前述任一項權(quán)利要求所述的結(jié)合成員，其特征在于，所述結(jié)合成員結(jié)合短尾猴 IL-6，并且在抑制標(biāo)記的人IL-6與支持物上固定的結(jié)合成員結(jié)合的時間分辨熒光實驗中， 短尾猴IL-6的IC5tl與未標(biāo)記人IL-6的IC5tl的差異小于10倍，其中標(biāo)記的人IL-6的終濃度等于它與結(jié)合成員相互作用的Kd的兩倍。
7.如前述任一項權(quán)利要求所述的結(jié)合成員，其特征在于，在抑制TF-1細(xì)胞響應(yīng)于20pM 人IL-6而增殖的實驗中，所述結(jié)合成員的IC5tl小于100pM。
8.一種分離的人 IL-6 結(jié)合成員，其包含一組 CDR:HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDRl、LCDR2 和IXDR3，其中該組⑶R含有來自一組⑶R的22個或更少的氨基酸改變，其中:HCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:3 ；HCDR2含有氨基酸序列SEQ ID NO:4 ；HCDR3含有氨基酸序列SEQ ID NO: 115 ；LCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:8 ；LCDR2含有氨基酸序列SEQ ID `N0:9 ;和 LCDR3含有氨基酸序列SEQ ID NO: 120 ;且其中在抑制TF-1細(xì)胞響應(yīng)于20pM人IL-6而增殖的實驗中，所述結(jié)合成員的IC5tl小于 IOOpMo
9.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的分離的人IL-6結(jié)合成員，其包含一組⑶R=HCDRU HCDR2、HCDR3、IXDRl、IXDR2和IXDR3，其中該組⑶R含有來自一組⑶R的22個或更少的氨基酸改變，其中:HCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:3 ；HCDR2含有氨基酸序列SEQ ID NO:4 ；HCDR3含有氨基酸序列SEQ ID NO: 115 ；LCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:8 ；LCDR2含有氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;和 LCDR3含有氨基酸序列SEQ ID NO: 120。
10.如權(quán)利要求8或9所述的結(jié)合成員，其包含一組⑶R，該組⑶R含有來自一組⑶R 的20個或更少的取代，其中:HCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:3 ；HCDR2含有氨基酸序列SEQ ID NO:4 ；HCDR3含有氨基酸序列SEQ ID NO: 115 ；LCDRl含有氨基酸序列SEQ ID NO:8 ；LCDR2含有氨基酸序列SEQ ID N0:9 ;和 LCDR3含有氨基酸序列SEQ ID NO: 120 ；其中所述 結(jié)合成員任選包含一個殘基的插入，以便相對于SEQ ID NO: 115增加HCDR3 的長度，和/或包含一個殘基的插入，以便相對于SEQ ID NO: 120增加IXDR3的長度。
【文檔編號】C07K16/24GK103554258SQ201310446215
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2007年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2006年11月30日
【發(fā)明者】P·馬林爾, S·G·萊恩, S·C·克魯威 申請人:米迪繆尼有限公司