百草枯模擬抗體的篩選方法及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種百草枯模擬抗體的篩選方法及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，該模擬抗體是由核糖體展示Lipocalin模擬抗體庫(kù)中篩選出來(lái)的并進(jìn)行了可溶性功能表達(dá)。本發(fā)明還涉及應(yīng)用核糖體展示技術(shù)篩選百草枯模擬抗體的方法。本發(fā)明篩選出的百草枯模擬抗體可以應(yīng)用于百草枯殘留監(jiān)測(cè)與研制快速檢測(cè)農(nóng)藥百草枯殘留的試劑盒。
【專利說(shuō)明】百草枯模擬抗體的篩選方法及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種百草枯模擬抗體的篩選方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，用于制備特異 識(shí)別百草枯高效模擬抗體與研制快速檢測(cè)百草枯殘留的免疫速測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 百草枯（paraquat, P曲又名對(duì)草快、克憲蹤、泊拉夸特、克滅蹤，化學(xué)名為1， 1'-二甲基-4,4'-聯(lián)化巧陽(yáng)離子；1，1'-二甲基-4,4'-聯(lián)化巧陽(yáng)離子二氯化物，是 一種觸殺型、滅生性除草劑。因具有速效、廣譜、安全等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于園林除草、非耕 地化學(xué)除草，在世界上130多個(gè)國(guó)家和地區(qū)得到推廣和應(yīng)用，尤其是在南北美洲和亞洲，我 國(guó)是百草枯最大的使用和生產(chǎn)國(guó)之一。百草枯對(duì)人、畜有很強(qiáng)的毒性作用，大多數(shù)是由于誤 服或自殺口服引起中毒，也可經(jīng)皮膚和呼吸吸收中毒致死。百草枯的測(cè)定通常采用紫外分 光光度法、氣質(zhì)連用法、液相色普法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用法。氣相 色譜分析法、高效液相色譜分析法等儀器分析法樣本前處理及測(cè)定過(guò)程繁瑣，費(fèi)用高，不適 于大量樣本篩查。免疫分析方法雖然快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，但因其抗原合成比較困難、需要進(jìn)行 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等不足而受到限制。
[0003] 核糖體展示技術(shù)（ribosome display,畑）是一種新型體外篩選和分子進(jìn)化功能 性蛋白質(zhì)的生物文庫(kù)技術(shù)，它將可擴(kuò)增的基因組信息DNA或RNA與可選擇的突變體蛋白質(zhì) 聯(lián)系在一起。該展示技術(shù)中mRNA缺乏終止密碼子并經(jīng)過(guò)適當(dāng)修飾，在體外翻譯過(guò)程中核糖 體會(huì)停留在mRNA的3'末端，mRNA與翻譯產(chǎn)物均不從核糖體上解離下來(lái)，形成十分穩(wěn)定的 "mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)"H元復(fù)合物，該種H元復(fù)合物形式將蛋白質(zhì)和mRNA信息連接到一 起，應(yīng)用RD可進(jìn)行特殊功能的膚和蛋白質(zhì)篩選。
[0004] Lipocalin是一類廣泛存在于自然界的功能多樣化小分子蛋白質(zhì)家族，從低等生 物到高等哺乳類動(dòng)物（包括人類）均發(fā)現(xiàn)其蹤跡。盡管該類蛋白在不同生物中發(fā)揮著不同 的生理學(xué)功能，但運(yùn)輸和膽存低溶解度物質(zhì)或化學(xué)敏感性物質(zhì)如芳香素、維生素、類固醇類 激素、多種二級(jí)代謝產(chǎn)物和信息素是它們最典型的生物學(xué)功能。Lipocalin在一級(jí)結(jié)構(gòu)上 存在多樣性，但其二級(jí)結(jié)構(gòu)與四級(jí)結(jié)構(gòu)卻梅人的相似：由8條反相平行的目折疊與一個(gè)a 螺旋形成一個(gè)桶狀結(jié)構(gòu)，形成了"支架"結(jié)構(gòu)，桶的開(kāi)口端由連接目折疊的多個(gè)Loop組成， 是整個(gè)分子比較柔初的部分，且氨基酸成員為極性氨基酸，四個(gè)loop環(huán)是其隨機(jī)突變的區(qū) 域，通過(guò)改造Lipocalin骨架作為特異性配體可W結(jié)合特定祀標(biāo)，亦即通過(guò)設(shè)計(jì)lipocalin 的支架可模擬抗體與小分子結(jié)合，該些設(shè)計(jì)的Lipocalin突變體具有配體特異性，因此可 W稱之為模擬抗體。由于lipocalin本身是運(yùn)輸小分子的蛋白，分子骨架構(gòu)像更適合與小 分子物質(zhì)結(jié)合，因此，W lipocalin為骨架篩選的模擬抗體的應(yīng)用越來(lái)越受關(guān)注。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種潛在的檢測(cè)用百草枯模擬抗體。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的提供一種百草枯模擬抗體的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0008] 本發(fā)明提供的百草枯模擬抗體是從核糖體展示Lipocalin模擬抗體庫(kù)中篩選獲 得的并進(jìn)行了功能表達(dá)。
[0009] 本發(fā)明提供的百草枯模擬抗體的制備方法為：
[0010] 1. Lipocalin模擬抗體庫(kù)的擴(kuò)增
[0011] 選擇膽汁H帰結(jié)合蛋白作為lipocalin庫(kù)的模板，設(shè)計(jì)隨機(jī)突變位點(diǎn)，W全基因 合成的BBP基因序列為模板，由設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行重疊引物延伸PCR擴(kuò)增來(lái)合成Lipocalin 模擬抗體庫(kù)片段，約52化P。再通過(guò)PCR方法添加大小為102bp核糖體展示元件T片段（包 括T7啟動(dòng)子，5'莖環(huán)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)）和大小為298bp的P片段（瞻菌體P蛋白部分序 列，3'莖環(huán)），構(gòu)建核糖體展示lipocalin模擬抗體庫(kù)，該庫(kù)全長(zhǎng)約95化P。
[0012] 2.百草枯模擬抗體的篩選
[0013] 在微孔板上包被PQ-0VA作為抗原進(jìn)行固相篩選，駿基化PQ與氨基化磁珠的偶聯(lián) 構(gòu)建PQ-磁珠，運(yùn)用了液相和固相交替篩選的方法；第一、第H、第五輪的篩選運(yùn)用固相篩 選，第二、第四輪運(yùn)用液相篩選。將核糖體展示lipocalin模擬抗體庫(kù)通過(guò)體外翻譯系統(tǒng)轉(zhuǎn) 錄翻譯后，與祀標(biāo)共同賠育，體外篩選后用邸TA解離H元復(fù)合體，得到mRNA，再進(jìn)行RT-PCR 得到bbp基因庫(kù)，將其與核糖體展示所需元件進(jìn)行重新連接，構(gòu)建下一輪篩選的模板。
[0014] 3.百草枯模擬抗體的功能表達(dá)、純化與鑒定
[0015] 將五輪篩選后對(duì)模擬抗體文庫(kù)進(jìn)行序列鑒定，挑選出無(wú)致死突變的克隆子，將該 基因與pTIG-TRX連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌化21 0E3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達(dá)產(chǎn)物存在于破碎菌 體后的上清液中，W空質(zhì)粒宿主菌為對(duì)照，PQ-0VA為包被原，PQ為競(jìng)爭(zhēng)小分子，競(jìng)爭(zhēng)化SIA 檢測(cè)上清的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性的采用親和層析柱進(jìn)行純化，使目的條帶得到 了明顯的濃縮和分離，競(jìng)爭(zhēng)化ISA分析純化后產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。sra法檢測(cè)所獲模擬抗 體的親和力。
[0016] 本發(fā)明可W提供一種快速檢測(cè)環(huán)境和食品中百草枯殘留的試劑盒中的最關(guān)鍵檢 測(cè)試劑一特異結(jié)合模擬抗體。本發(fā)明所述百草枯模擬抗體的優(yōu)勢(shì)在于：利用PQ-0VA固相 篩選和PQ-磁珠液相篩選交替篩選不僅能夠減少針對(duì)載體蛋白的非特異吸附，而且液相篩 選不僅可W避免塑料表面疏水作用而影響表達(dá)蛋白的空間構(gòu)象，從而影響抗體對(duì)抗原的特 異識(shí)別，還可W使抗原與抗體的識(shí)別全方位立體式進(jìn)行（2)所獲得的模擬抗體序列清楚， 分子量小，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1模擬抗體lipocalin-PQ誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，其中1-4, 6, 7為模 擬抗體lipocalin-PQ誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清，5為空質(zhì)粒陰性對(duì)照，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[001引圖2百草枯模擬抗體lipocalin-PQ純化后SDS-PAGE電泳分析，其中1為純化前 樣品，2為穿透液，3-8為純化后的產(chǎn)物，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
[0019] 圖3直接化ISA測(cè)定模擬抗體lipocalin-PQ結(jié)合活性，其中圖A、B、C分別為模擬 抗體 lipocalin-PQ-1、lipocalin-PQ-2 和 lipocalin-PQ-3 的結(jié)合活性
[0020] 圖4間接競(jìng)爭(zhēng)化ISA分析Lipocalin-PQ的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。
[0021] 圖5SH?分析模擬抗體lipocalin-PQ的結(jié)合動(dòng)力學(xué)常數(shù)。

【具體實(shí)施方式】
[0022] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑與材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可 從常規(guī)試劑公司購(gòu)買得到。
[0023] 實(shí)施例1百草枯模擬抗體的篩選
[0024] 1.體外轉(zhuǎn)錄與翻譯
[00巧] (1)米用 Promega 公司的大腸桿菌 E. coli S30 巧scherichia coli S30Extract System)線性模板系統(tǒng)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄與翻譯。反應(yīng)體系如下：
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種百草枯模擬抗體的制備方法，主要由以下步驟組成： (1) Lipocalin模擬抗體庫(kù)的擴(kuò)增 選擇膽汁三烯結(jié)合蛋白作為lipocalin庫(kù)的模板，設(shè)計(jì)隨機(jī)突變位點(diǎn)，以全基因合成 的BBP基因序列為模板，由設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行重疊引物延伸PCR擴(kuò)增來(lái)合成Lipocalin模擬 抗體庫(kù)片段，約522bp。再通過(guò)PCR方法添加大小為102bp核糖體展示元件T片段（包括 17啟動(dòng)子，5'莖環(huán)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)）和大小為298bp的P片段（噬菌體P蛋白部分序列， 3'莖環(huán)），構(gòu)建核糖體展示lipocalin模擬抗體庫(kù)，該庫(kù)全長(zhǎng)約950bp。 (2) 百草枯模擬抗體的篩選 在微孔板上包被PQ-0VA作為抗原進(jìn)行固相篩選，羧基化PQ與氨基化磁珠的偶聯(lián)構(gòu)建 PQ-磁珠，運(yùn)用了液相和固相交替篩選的方法：第一、第三、第五輪的篩選運(yùn)用固相篩選，第 二、第四輪運(yùn)用液相篩選。將核糖體展示lipocalin模擬抗體庫(kù)通過(guò)體外翻譯系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄翻 譯后，與靶標(biāo)共同孵育，體外篩選后用EDTA解離三元復(fù)合體，得到mRNA，再進(jìn)行RT-PCR得到 bbp基因庫(kù)，將其與核糖體展示所需元件進(jìn)行重新連接，構(gòu)建下一輪篩選的模板。 (3) 百草枯模擬抗體的功能表達(dá)、純化與鑒定 將五輪篩選后對(duì)模擬抗體文庫(kù)進(jìn)行序列鑒定，挑選出無(wú)致死突變的克隆子，將該基因 與pTIG-Trx連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot 鑒定，在20KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，確定表達(dá)產(chǎn)物存在于破碎菌體后 的上清液中，以空質(zhì)粒宿主菌為對(duì)照，PQ-0VA為包被原，PQ為競(jìng)爭(zhēng)小分子，競(jìng)爭(zhēng)ELSIA檢測(cè) 上清的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性的采用親和層析柱進(jìn)行純化，使目的條帶得到了明 顯的濃縮和分離，競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析純化后產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性。SPR法檢測(cè)所獲模擬抗體的 親和力。
2. 權(quán)利要求1所述隨機(jī)突變庫(kù)的模板可以是其他lipocalin分子，優(yōu)選bbp。
3. 權(quán)利要求1所述篩選方法中的包被原可以選用PQ-0VA，還可以選用PQ-BSA或者 PQ-磁珠進(jìn)行篩選，優(yōu)選固液相交叉篩選。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK104513316SQ201310450949
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】寧保安, 高志賢, 彭媛, 白家磊, 趙麗, 孫思明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所