一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用，以超順磁性無機(jī)納米材料作為種子粒，利用溶膠-凝膠化學(xué)原理，采用水解冷凝合成，在超順磁性納米材料表面包覆上無定型金屬氧化物，得到超順磁性復(fù)合材料前驅(qū)體；將前軀體材料分散到水中，經(jīng)高溫高壓水熱處理及高溫煅燒處理，得到具有超順磁性、表面包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料。本發(fā)明的納米復(fù)合材料具有超順磁性且分散性好，有很好的生物相容性，且比表面積大，可對低至1x10-10M級的復(fù)雜肽段混合物中的痕量磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集，方法簡單有效。該材料及制備方法在蛋白質(zhì)組學(xué)翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價值和應(yīng)用前景。
【專利說明】一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于先進(jìn)納米復(fù)合材料和生化分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料及制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]蛋白質(zhì)可逆磷酸化修飾能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、活性及其相互間的作用，從而調(diào)節(jié)如細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等幾乎所有的生命活動，被形象地描述為生理活動的分子開關(guān)。準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)中的磷酸化位點(diǎn)對深入理解各種生物過程的機(jī)理、探索重大疾病的生物標(biāo)記物和蛋白藥靶的尋找極為重要。生物質(zhì)譜是解析磷酸化肽段結(jié)構(gòu)的有力手段，但是由于磷酸化肽段的離子化效率相對較差，因此樣品中非磷酸化肽段信號嚴(yán)重干擾了磷酸化肽段的檢測，因此在利用生物質(zhì)譜分析之前對磷酸化肽段進(jìn)行預(yù)分離富集是非常必要的。
[0003]近年來，金屬氧化物親和色譜法(MOAC)是逐漸被用于分離富集磷酸化蛋白和肽段的有效方法。很多金屬氧化物以其高選擇性和較好的結(jié)果重現(xiàn)性被用于填裝成柱子或者直接離心分離用于分離富集磷酸化肽段。但是裝柱使用相對復(fù)雜，采用高速離心的方式則操作費(fèi)時費(fèi)力，而且在高速離心時會造成“共沉淀效應(yīng)”，即高質(zhì)量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段會共沉淀下來。
[0004]采用超順磁性材料為基體，將超順磁性材料和金屬氧化物結(jié)合，既可以實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白和肽段的選擇性富集，又可以利用材料的超順磁性在外加磁場的作用下實(shí)現(xiàn)快速有效的分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種磁響應(yīng)效果好、合成簡單、形狀均一、富集選擇性高的包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供所述包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的制備方法。
[0007]本發(fā)明的目的之三在于提供所述包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的應(yīng)用。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料，所述納米材料是在以超順磁性無機(jī)納米材料作為種子粒的表面包覆有金屬氧化物晶體，尺寸在200?800nm，比表面積為100?500m2/g，孔體積為0.1?
0.6cm3/g。
[0009]所述超順磁性無機(jī)納米材料為四氧化三鐵、Y -三氧化二鐵、納米鐵顆粒中的一種，微粒尺寸為100?400nm。
[0010]所述金屬氧化物為Ti02、A1203、Zr02、Ga203、ln203、Co2O4 中的一種。[0011]一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的制備方法，包括以下步驟:
(1)將150mg超順磁性無機(jī)納米材料分散在200mL乙醇中，加入lmL28%的濃氨水,超聲15?20分鐘，然后在機(jī)械攪拌條件下將2.0mL鈦酸丁酯在5?10分鐘內(nèi)逐滴加入上述混合液，之后在40?50°C下恒溫繼續(xù)攪拌24小時，所得材料用去離子水和乙醇分別清洗3次，得到超順磁性復(fù)合材料前驅(qū)體；
(2)將0.5g上超順磁性復(fù)合材料前驅(qū)體加入20mL去離子水，轉(zhuǎn)移到30mL的Teflon-lined不銹鋼反應(yīng)釜中，150?200°C下高溫高壓水熱處理24小時，待反應(yīng)釜溫度降至室溫，將所得材料用磁鐵分離，并用去離子水和乙醇分別清洗3次，然后45?60°C下真空干燥后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下350?450°C煅燒2小時，待反應(yīng)爐降至室溫后，得到包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料。
[0012]一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料用于對磷酸化蛋白和肽段的選擇性萃取，其特征在于包括以下步驟:
(1)將蛋白溶于NH4HCOyK溶液中，加入胰蛋白酶，在37°C下酶解16小時，然后用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成緩沖液的將酶解后的肽段混合物稀釋至適當(dāng)濃度；
(2)取包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的懸濁液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的緩沖液洗滌，在稀釋后的肽段混合液加入洗滌后的微球中，在25°C下混旋5?10分鐘，用磁鐵分離去除上清液,而后利用緩沖液洗滌，除去上清液后加入0.4M氨水，在25°C下混旋2分鐘，將磷酸化肽段洗脫下來。
[0013]本發(fā)明合成的納米復(fù)合材料以超順磁性無機(jī)納米材料作為種子粒，利用溶膠-凝膠化學(xué)原理，采用水解冷凝合成，在超順磁性納米材料表面包覆上無定型金屬氧化物，得到超順磁性復(fù)合材料前驅(qū)體；將前軀體材料分散到水中，經(jīng)高溫高壓水熱處理及高溫煅燒處理，得到具有超順磁性、表面包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料。
[0014]有益效果:本發(fā)明的包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料具有超順磁性且分散性好，有很好的生物相容性，且比表面積大，可對低至ΙχΙΟ,Μ級的復(fù)雜肽段混合物中的痕量磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集，方法簡單有效。該材料及制備方法在蛋白質(zhì)組學(xué)翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價值和應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明具體實(shí)施例納米材料的形貌表征圖，其中:
a、Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料SEM圖；b、Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料TEM圖；
C、包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料SEM圖； d、包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料TEM圖。
[0016]圖2是本發(fā)明具體實(shí)施例Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料(a)和包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料(b)的廣角X射線衍射圖。
[0017]圖3是本發(fā)明具體實(shí)施例Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料的氮?dú)馕矫摳降葴鼐€。
[0018]圖4是本發(fā)明具體實(shí)施例Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料的孔徑分布圖。
[0019]圖5是本發(fā)明具體實(shí)施例包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料氮?dú)馕矫摳降葴鼐€。
[0020]圖6是本發(fā)明具體實(shí)施例包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料的孔徑分布圖。[0021 ] 圖7是β -casein: ovalbumin: BSA的摩爾比為1: 1:50的混合肽段酶解液MALD1-T0F-MS分析質(zhì)譜圖，其中:
a、混合肽段酶解液富集前的質(zhì)譜圖；
b、混合肽段經(jīng)包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料富集后的質(zhì)譜圖。
[0022]圖8是包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料從不同濃度的β -casein酶解液富集到的磷酸化肽段的分析質(zhì)譜圖，其中:
a、4xl(T9M ;b、2xl(T9M ;c、4xl(T10M。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0024]本發(fā)明的以Fe3O4為核包覆TiO2晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料Fe3O4OTiO2制備過程如下。
[0025]采用溶膠-凝膠法水解冷凝合成Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料:
取150mg直徑為150nm的Fe3O4納米顆粒分散到200mL乙醇中，加入ImL濃氨水(28wt%),超聲15-20分鐘。然后在機(jī)械攪拌條件下將2.0mL鈦酸丁酯在5_10分鐘內(nèi)逐滴加入上述混合液，之后在 40-50°C下恒溫繼續(xù)攪拌24小時。所得材料用去離子水和乙醇分別清洗3次，得到Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料，備用。
[0026]制備TiO2結(jié)晶體包覆的Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料:
取0.5g上述Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料加入20mL去離子水，轉(zhuǎn)移到30mL的Teflon-lined不銹鋼反應(yīng)釜中，150-20(TC下高溫高壓水熱處理24小時。待反應(yīng)釜溫度降至室溫，將所得材料用磁鐵分離，并用去離子水和乙醇分別清洗3次。然后45-60°C下真空干燥后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下350-450°C煅燒2小時，待反應(yīng)爐降至室溫后，得到表面包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料。
[0027]材料的表征:
1、納米材料的形貌表征
利用透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)表征Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料和包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2-化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料，表征圖見圖1。從圖1a和圖1c中可以看出Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料和包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料大小均一，分散均勻，具有球狀形貌。從圖1b中可以看出，F(xiàn)e3O4OTiO2前驅(qū)體材料的直徑約為230nm,而且大約有40nm厚的TiO2層可以明顯觀察到。經(jīng)過水熱和煅燒處理后，F(xiàn)e3O4OTiO2的球形結(jié)構(gòu)得到了很好的保持，直徑約為500nm，TiO2層大約有IOOnm厚。
[0028]2、表面包覆TiO2的形態(tài)表征
利用廣角X射線衍射圖(XRD)表征Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料和包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的表層TiO2形態(tài)，表征圖見圖2。在圖2a中可以看出，F(xiàn)e3O4OTiO2前驅(qū)體材料表面覆蓋的TiO2表現(xiàn)為無定型，經(jīng)水熱和煅燒處理后，F(xiàn)e3O4OTiO2的微球圖譜與標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fe3O4 (JCPDS65-3107)和銳鈦礦(JCPDS21-1272)得到了良好的吻合，證實(shí)了無定型的TiO2在處理后變成了結(jié)晶化的TiO2顆粒。
[0029]3、孔徑分布表征 使用氮?dú)馕?脫附儀(BET)在77K測量Fe3O4OTiO2前驅(qū)體材料和包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的氮?dú)馕?脫附等溫線和孔徑分布，表征圖見圖3到6。在圖中可以看出，F(xiàn)e3O4OTiO2前驅(qū)體材料的BET比表面積和孔體積分別為139.8m2/g和0.13cm3/g,包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料的BET比表面積和孔體積分別為162.6m2/g和0.24cm3/g，表明該材料具有較大的比表面積-體積比，并且經(jīng)過水熱和煅燒處理，F(xiàn)e3O4OTiO2納米材料的比表面積變得更大。
[0030]4、將磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料Fe3O4OTiO2用于對磷酸化肽段富集能力和富集選擇性的考察。
[0031]用標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白β -酪蛋白(β-casein,通常含有痕量a-casein)、卵清蛋白(ovalbumin)和牛血清蛋白(BSA)的酶解液混合肽段考察Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的富集能力和富集選擇性。
[0032]樣品準(zhǔn)備:β-酪蛋白、卵清蛋白和牛血清蛋白先溶于25mM NH4HCOyK溶液中(pH=8.3)，加入適量的胰蛋白酶(1:50，w/w)，在37°C下酶解16小時。在酶解前，卵清蛋白和牛血清蛋白均用二硫蘇糖醇和碘乙酰胺進(jìn)行還原烷基化，β-酪蛋白為直接酶解。將β-酪蛋白:卵清蛋白和牛血清蛋白的酶解液按照摩爾比為1:1:50混合，然后用緩沖液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)將酶解后的肽段混合物稀釋至適當(dāng)濃度，這里稀釋到β-酪蛋白酶解液的濃度為4χ10_8Μ，備用。
[0033]磷酸化肽段的富集:取400 μ g Fe3O4OTiO2磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的懸濁液(200 μ L，2 μ g/ μ L)，用緩沖液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗滌三次，去除緩沖液后取200 μ L稀釋后的肽段混合液加入洗滌后的微球中，在25°C下混旋5?10分鐘，用磁鐵分離去除上清液，而后利用緩沖液(50%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗滌三次。除去上清液后加入
10μ L洗脫液(0.4Μ氨水)，在25°C下混旋2分鐘，將磷酸化肽段洗脫下來，以備基體輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)檢測分析。
[0034]富集前后經(jīng)基體輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)分析的質(zhì)譜圖見圖7。
[0035]從圖7a中可以看出，混合肽段直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測，幾乎檢測不到磷酸化肽段的峰，富集后磷酸化肽段的信號顯著增強(qiáng)，在譜圖中占據(jù)主導(dǎo)地位，完全沒有受到高濃度牛血清蛋白的影響，幾乎沒有非磷酸化肽段檢出，同時三條屬于a-casein的磷酸化肽段、一條屬于ovalbumin的磷酸化肽段也被成功富集并檢測到。詳細(xì)信息列于表I。從β -casein:ovalbumin:BSA的摩爾比為1:1:50的混合肽段酶解液鑒定到的磷酸化肽段的詳細(xì)信息，其中下劃線位置為磷酸化位點(diǎn)，固定β -casein酶解液的濃度為4xlO_8M。富集前后的差異表明包覆TiO2結(jié)晶體的Fe3O4OTiO2納米材料對于磷酸化肽段有很好的富集能力和富集選擇性。
[0036]表I
【權(quán)利要求】
1.一種包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料，其特征在于:所述納米材料是在以超順磁性無機(jī)納米材料作為種子粒的表面包覆有金屬氧化物晶體，尺寸在200?800nm,比表面積為100?500m2/g,孔體積為0.1?0.6cmVg°
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料，其特征在于:所述超順磁性無機(jī)納米材料為四氧化三鐵、Y-三氧化二鐵、納米鐵顆粒中的一種，微粒尺寸為100?400nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料，其特征在于:所述金屬氧化物為Ti02、Al203、Zr02、Ga203、ln203、Co2O4中的一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將150mg超順磁性無機(jī)納米材料分散在200mL乙醇中，加入lmL28%的濃氨水,超聲15?20分鐘，然后在機(jī)械攪拌條件下將2.0mL鈦酸丁酯在5?10分鐘內(nèi)逐滴加入上述混合液，之后在40?50°C下恒溫繼續(xù)攪拌24小時，所得材料用去離子水和乙醇分別清洗3次，得到超順磁性復(fù)合材料前驅(qū)體； (2)將0.5g上超順磁性復(fù)合材料前驅(qū)體加入20mL去離子水，轉(zhuǎn)移到30mL的Tef 1n-1ined不銹鋼反應(yīng)釜中，150?200°C下高溫高壓水熱處理24小時，待反應(yīng)釜溫度降至室溫，將所得材料用磁鐵分離，并用去離子水和乙醇分別清洗3次，然后45?60°C下真空干燥后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下350?450°C煅燒2小時，待反應(yīng)爐降至室溫后，得到包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料用于對磷酸化蛋白和肽段的選擇性萃取，其特征在于包括以下步驟: (1)將蛋白溶于NH4HCO3水溶液中，加入胰蛋白酶，在37°C下酶解16小時，然后用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成緩沖液的將酶解后的肽段混合物稀釋至適當(dāng)濃度； (2)取包覆金屬氧化物晶體的磁化內(nèi)構(gòu)納米復(fù)合材料的懸濁液，用50%乙腈和0.1%三氟乙酸混合而成的緩沖液洗滌，在稀釋后的肽段混合液加入洗滌后的微球中，在25°C下混旋5?10分鐘,用磁鐵分離去除上清液,而后利用緩沖液洗滌，除去上清液后加入0.4M氨水，在25°C下混旋2分鐘，將磷酸化肽段洗脫下來。
【文檔編號】C07K1/14GK103521148SQ201310470174
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月10日
【發(fā)明者】尚春慶, 盧晉, 鄧春暉 申請人:蘇州英芮誠生化科技有限公司