一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法，包括以下步驟：首先是反應(yīng)液配制；然后是AGEs純化；最后是AGEs產(chǎn)物檢測(cè)。采用本發(fā)明技術(shù)方案，用AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，能降低內(nèi)皮細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用；制備方法簡(jiǎn)單、制備成本低廉，克服了采用靜態(tài)反應(yīng)的缺點(diǎn)，適合中小實(shí)驗(yàn)室采用。
【專利說明】一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的方法，具體涉及一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病(Diabetic Mellitus, DM)血管病變(大血管病變、微血管病變)是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥，也是2型糖尿病的主要致殘、致死原因。DM血管病變學(xué)說較多，其中晚期糖基化產(chǎn)物學(xué)說(Advance Glycation End Products, AGEs)是DM血管病變的主要致病學(xué)說[I] O
[0003]糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期存在的高血糖狀態(tài)被認(rèn)為是DM血管并發(fā)癥的關(guān)鍵始動(dòng)因素，所以嚴(yán)格控制血糖水平是降低糖尿病血管并發(fā)癥的主要措施，但臨床上發(fā)現(xiàn)即使給予有效的胰島素治療且血糖控制良好的病人，其血管并發(fā)癥并未停止發(fā)展，即所謂“高血糖記憶”狀態(tài)，這種現(xiàn)象與糖尿病患者體內(nèi)長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)產(chǎn)生的高水平不可逆的強(qiáng)活性物質(zhì)即晚期糖基化產(chǎn)物(advance glycation end products, AGEs)有關(guān)。AGEs的形成又稱為蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)，是指體內(nèi)蛋白質(zhì)自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)生成穩(wěn)定的共價(jià)化合物。該過程主要分為3個(gè)步驟:首先是游離氨基與糖分子中的醛基反應(yīng)形成Schiff堿,然后Schiff堿發(fā)生重排產(chǎn)生可逆的早期糖基化產(chǎn)物-Amadori產(chǎn)物(包括果糖胺等多種產(chǎn)物)，最后Amadori產(chǎn)物再與其他游離氨基基團(tuán)反應(yīng)并進(jìn)一步發(fā)生復(fù)雜的分子重排和脫水反應(yīng)，形成不可逆的深度糖基化終末產(chǎn)物AGEs。這個(gè)反應(yīng)是由法國(guó)科學(xué)家Maillard在1912年發(fā)現(xiàn)的，因此又稱為Maillard反應(yīng)。AGEs是許多不同化合物的總稱，由熒光物質(zhì)和非熒光物質(zhì)組成，目前已經(jīng)鑒別出體內(nèi)20幾個(gè)AGEs，包括羧甲基賴氨酸(CML)，苯妥西定，蛋白交聯(lián)產(chǎn)物等。AGEs可通過“雙打擊”模式損傷血管，AGEs與RAGE結(jié)合后，激活NF-kB等信號(hào)分子，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生炎癥(第1次打擊)，而聚集在炎癥區(qū)域的吞噬細(xì)胞通過髓過氧化物酶可產(chǎn)生CML，又進(jìn)一步損傷血管(第2次打擊)；AGEs還能通過直接形成交聯(lián)蛋白加速動(dòng)脈硬化，改變基質(zhì)成分，引起血小板聚集，造成血管彈性減小、血管順應(yīng)性降低并產(chǎn)生異常脂蛋白代謝從而影響心血管系統(tǒng)的功能。
[0004]AGEs作為常規(guī)細(xì)胞毒性試劑，在DM血管病變分子機(jī)制的研究中具有廣泛應(yīng)用。大量細(xì)胞水平研究采用AGEs作為刺激劑，研究其影響血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等的功能，以闡明DM血管病變產(chǎn)生的病理生理機(jī)制及尋找藥物作用靶點(diǎn)。因此，高質(zhì)量AGEs作為研究試劑，對(duì)研究結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性以及其重現(xiàn)性非常重要。目前，Sigma公司已有AGEs成品出售，但其價(jià)格非常昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以承受。國(guó)內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室為減少成本，一般采用自我制備方法獲得AGEs，但我們發(fā)現(xiàn)，這些實(shí)驗(yàn)室其自制AGEs時(shí)均采用靜態(tài)反應(yīng)法制備[2，3，4，5]:即用一定濃度的牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)和葡萄糖(G)液混合,置于37°C,培養(yǎng)一定時(shí)間,測(cè)定其突光強(qiáng)度的改變。這一方法的最大缺點(diǎn)是忽視了血液循環(huán)的基本事實(shí)，不能很好反映體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖化反應(yīng)的真實(shí)狀態(tài)，因而其AGEs質(zhì)量也不能得到保障，影響后續(xù)研究數(shù)據(jù)的可靠性。[0005]基于此，我們發(fā)明了一種利用體外循環(huán)裝置，模擬體內(nèi)非酶糖基化反應(yīng)過程制備晚期糖基化終產(chǎn)物的方法，該法制備出的AGEs質(zhì)量穩(wěn)定，生物活性高，經(jīng)濟(jì)，適合中小實(shí)驗(yàn)室自我制備，作為研究試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法，包括以下步驟 :
步驟I)反應(yīng)液配制:將5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)與濃度為50mmol/L的d_葡萄糖溶于含EDTA (0.5mmol/L)的PBS(PH7.4)中，混勻，0.22uM濾膜無菌過濾后，放入自制反應(yīng)裝置中，37°C水浴恒溫，用微量循環(huán)泵使反應(yīng)液循環(huán)流動(dòng)，孵育至設(shè)定時(shí)間取出，用截留分子量68kd以下的透析膜充分透析24h，每4h更換透析液I次，以去除未結(jié)合的葡萄糖，收集產(chǎn)物置冰箱保存，以備葡聚糖凝膠純化用；對(duì)照BSA中不含葡萄糖，其它條件一致；
步驟2) AGEs純化:用葡聚糖凝膠Sephadex_G200純化AGEs產(chǎn)物；稱取凝膠顆粒3g,加入過量蒸餾水中，室溫放置24小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(pH =7.4，0.2mo I/ L )平衡10倍體積以上，裝柱(10 cm X 25 cm )，連接蠕動(dòng)泵和自動(dòng)部分收集器、紫外線檢測(cè)儀，用PBS平衡過夜；次日，取透析過的AGEs適量緩慢加入柱床頂部，用PBS洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定紫外280 nm吸光度和AGEs溶液的熒光值，收集第I峰濃縮，用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白含量，0.22uM濾膜過濾除菌，取少量樣品供檢測(cè)用，其余樣品封口后置冰箱凍存；
步驟3) AGEs產(chǎn)物檢測(cè):熒光分光光度法鑒定。
[0008]進(jìn)一步的，所述步驟(1)中的自制反應(yīng)裝置即為循環(huán)裝置，所述循環(huán)裝置用500ml棕色三角錐形作為反應(yīng)容器，內(nèi)接2根玻璃管,所述玻璃管I根為反應(yīng)液出口，另I根為進(jìn)口，分別鏈接硅橡膠軟管，并將軟管接通蠕動(dòng)泵作為反應(yīng)循環(huán)裝置，錐形瓶放入37度恒溫水浴鍋中。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1、采用簡(jiǎn)易自制的動(dòng)態(tài)循環(huán)反應(yīng)裝置，明模擬體內(nèi)蛋白質(zhì)非酶糖基化反應(yīng)的條件，成功制備了晚期糖基化終產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)熒光分光光度法和SDS-PAGE電泳檢測(cè)，本產(chǎn)物符合AGEs的一般特性。用AGEs刺激內(nèi)皮細(xì)胞后，能降低內(nèi)皮細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活性，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。
[0010]2、制備方法簡(jiǎn)單、制備成本低廉，克服了采用靜態(tài)反應(yīng)的缺點(diǎn)，適合中小實(shí)驗(yàn)室采用。
[0011]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】由以下實(shí)施例及其附圖詳細(xì)給出。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中: 圖1為本發(fā)明的AGEs制備流程簡(jiǎn)圖；
圖2為本發(fā)明的蛋白質(zhì)體外非酶糖化反應(yīng)動(dòng)態(tài)循環(huán)裝置簡(jiǎn)圖；
圖3 (a)為本發(fā)明的AGEs熒光檢測(cè)時(shí)間曲線圖；
圖3 (b)為本發(fā)明的AGEs的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果；
圖4 (a)為本發(fā)明的不同濃度AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶的影響；
圖4 (b)為本發(fā)明的AGEs(10(^g/ml)在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶活力的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0014]一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法，包括以下步驟:
步驟I)反應(yīng)液配制:將5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)與濃度為50mmol/L的d_葡萄糖溶于含EDTA (0.5mmol/L)的PBS(PH7.4)中，混勻，0.22uM濾膜無菌過濾后，放入自制反應(yīng)裝置中，37°C水浴恒溫，用微量循環(huán)泵使反應(yīng)液循環(huán)流動(dòng)，孵育至設(shè)定時(shí)間取出，用截留分子量68kd以下的透析膜充分透析24h，每4h更換透析液I次，以去除未結(jié)合的葡萄糖，收集產(chǎn)物置冰箱保存，以備葡聚糖凝膠純化用；對(duì)照BSA中不含葡萄糖，其它條件一致；
步驟2) AGEs純化:用葡聚糖凝膠Sephadex_G200純化AGEs產(chǎn)物；稱取凝膠顆粒3g,加入過量蒸餾水中，室溫放置24小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(pH =7.4，0.2mo I/ L )平衡10倍體積以上，裝柱(10 cm X 25 cm )，連接蠕動(dòng)泵和自動(dòng)部分收集器、紫外線檢測(cè)儀，用PBS平衡過夜；次日，取透析過的AGEs適量緩慢加入柱床頂部，用PBS洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定紫外280 nm吸光度和AGEs溶液的熒光值，收集第I峰濃縮，用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白含量，0.22uM濾膜過濾除菌，取少量樣品供檢測(cè)用，其余樣品封口后置冰箱凍存；
步驟3) AGEs產(chǎn)物檢測(cè):熒光分光光度法鑒定。
[0015]進(jìn)一步的，所述步驟(1)中的自制反應(yīng)裝置即為循環(huán)裝置，所述循環(huán)裝置用500ml棕色三角錐形作為反應(yīng)容器，內(nèi)接2根玻璃管,所述玻璃管I根為反應(yīng)液出口，另I根為進(jìn)口，分別鏈接硅橡膠軟管，并將軟管接通蠕動(dòng)泵作為反應(yīng)循環(huán)裝置，錐形瓶放入37度恒溫水浴鍋中。
[0016]實(shí)施例一:
I)AGEs產(chǎn)物檢測(cè)
熒光分光光度法鑒定:取AGEs樣品，于熒光分光光度計(jì)上測(cè)量其熒光值(激發(fā)波長(zhǎng)390nm,發(fā)射波長(zhǎng)450nm)，以200ulBSA按同樣操作作為對(duì)照。
[0017]SDS-PAGE電泳鑒定:按表1配制分離膠及濃縮膠。將樣品中加入等體積的樣品處理液，沸水中煮5分鐘，電泳時(shí)每孔加入ιομ?。點(diǎn)樣后，在100伏電壓下電泳2小時(shí)。電泳后，輕輕取下膠，放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色，并放在搖床上輕搖30分鐘。用脫色液脫色至無雜色為止，掃描膠片并保存。
[0018]表1 SDS-PAGE分離膠和濃縮膠配方
【權(quán)利要求】
1.一種制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)反應(yīng)液配制:將5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)與濃度為50mmol/L的d_葡萄糖溶于含EDTA (0.5mmol/L)的PBS(PH7.4)中，混勻，0.22uM濾膜無菌過濾后，放入自制反應(yīng)裝置中，37°C水浴恒溫，用微量循環(huán)泵使反應(yīng)液循環(huán)流動(dòng)，孵育至設(shè)定時(shí)間取出，用截留分子量68kd以下的透析膜充分透析24h，每4h更換透析液I次，以去除未結(jié)合的葡萄糖，收集產(chǎn)物置冰箱保存，以備葡聚糖凝膠純化用；對(duì)照BSA中不含葡萄糖，其它條件一致； 步驟2) AGEs純化:用葡聚糖凝膠Sephadex_G200純化AGEs產(chǎn)物；稱取凝膠顆粒3g,加入過量蒸餾水中，室溫放置24小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(pH =7.4，0.2mo I/ L )平衡10倍體積以上，裝柱(1 0 cm X 25 cm )，連接蠕動(dòng)泵和自動(dòng)部分收集器、紫外線檢測(cè)儀，用PBS平衡過夜；次日，取透析過的AGEs適量緩慢加入柱床頂部，用PBS洗脫，收集洗脫液，分別測(cè)定紫外280 nm吸光度和AGEs溶液的熒光值，收集第I峰濃縮，用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白含量，0.22uM濾膜過濾除菌，取少量樣品供檢測(cè)用，其余樣品封口后置冰箱凍存； 步驟3) AGEs產(chǎn)物檢測(cè):用熒光分光光度法鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備晚期糖基化終產(chǎn)物的體外動(dòng)態(tài)循環(huán)方法，其特征在于，所述步驟(1)中的自制反應(yīng)裝置即為循環(huán)裝置，所述循環(huán)裝置用500ml棕色三角錐形作為反應(yīng)容器，內(nèi)接2根玻璃管，所述玻璃管I根為反應(yīng)液出口，另I根為進(jìn)口，分別鏈接硅橡膠軟管，并將軟管接通蠕動(dòng)泵作為反應(yīng)循環(huán)裝置，錐形瓶放入37度恒溫水浴鍋中。
【文檔編號(hào)】C07K1/107GK103539854SQ201310476200
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】向敏, 張雅琴, 吳萍萍 申請(qǐng)人:蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院