磷酸膽堿偶聯(lián)物和相應(yīng)抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種測定抗磷酸膽堿自身抗體、尤其是抗磷酸膽堿的IgM自身抗體，從而鑒定有患缺血性心血管疾病風(fēng)險的患者的方法。本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含磷酸膽堿偶聯(lián)物(主動免疫)或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體(被動免疫)，本發(fā)明還提供了用這些組合物作為主動免疫或被動免疫的免疫原治療或預(yù)防動脈粥樣硬化的用途。
【專利說明】磷酸膽堿偶聯(lián)物和相應(yīng)抗體
[0001]本申請是國際申請日為2005年04月15日的申請?zhí)枮?00580019701.9的中國發(fā)明專利申請“磷酸膽堿偶聯(lián)物和相應(yīng)抗體”的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及動脈粥樣硬化和缺血性心血管疾病的治療和風(fēng)險評估領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，引起大動脈和中等大小動脈的最內(nèi)層(內(nèi)膜)增厚。它使血流緩慢，并可以在由受感染血管供血的器官中引起缺血和組織破壞。動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心肌梗塞等心血管疾病、中風(fēng)和外周動脈疾病的主要原因。它是西方國家的主要死因，預(yù)計不出二十年，將成為全球最主要的死亡原因。
[0004]這種疾病始于血管的細胞外基質(zhì)中積累脂蛋白，主要是低密度脂蛋白(LDL)。這些LDL顆粒聚集并發(fā)生氧化。氧化后的LDL具有促炎特性和毒性，引起血管損傷。動脈粥樣硬化在很多方面代表了對這種損傷的一種反應(yīng)，包括炎癥和纖維變性。
[0005]1989年,Palinski及其同事鑒定出人體內(nèi)抗氧化型LDL的循環(huán)自身抗體。這一發(fā)現(xiàn)提示，動脈粥樣硬化可能是由抗氧化型脂蛋白的免疫反應(yīng)引起的自身免疫病。同一時期，多個實驗室開始尋找抗氧化型LDL抗體滴度與心血管疾病之間的關(guān)系。但這些研究沒有得出明確的結(jié)論。目前已經(jīng)有針對氧化型LDL表面眾多不同表位的多種抗體，但這些表位的結(jié)構(gòu)尚不清楚。因此，術(shù)語〃氧化型LDL抗體〃是指多種不同抗體的未知混合物，而不是指一種特殊的抗體。
[0006]眾所周知，動脈硬化病灶存在持續(xù)炎癥，其特征是免疫活性細胞被活化，產(chǎn)生炎性細胞因子。已經(jīng)確認的風(fēng)險因素，例如高血壓、血脂、糖尿病和吸煙都很可能促進這種炎癥反應(yīng)，但這種現(xiàn)象的發(fā)生機制尚不明確，存在多種互不相干的排他性可能性。已經(jīng)有人提出多種可以引起該免疫反應(yīng)的自身抗原，包括氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和熱休克蛋白(HSP)2，3。有關(guān)免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化中的作用的現(xiàn)有信息提示一種復(fù)雜的關(guān)系。其中一種情況是，在動物模型中進行免疫接種，以便影響動脈粥樣化的形成。當(dāng)使用HSP時，動脈粥樣硬化增加，當(dāng)以oxLDL作為抗原時，動脈粥樣硬化減少45。
[0007]aOxLDL在人類疾病中的作用似乎比較復(fù)雜。此前有人證實，aOxLDL在健康對照人群中的水平高于臨界高血壓(borderline hypertension,一種早期心血管疾病6)人群。近期研究與該發(fā)現(xiàn)是一致的7’8。另一方面，有多位研究者報道，aOxLDL在人類心血管疾病(CVD)中升高，尤其是在晚期疾病中2’3’9’1(1。實例之一是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)以及與CVD極高風(fēng)險有關(guān)的自身免疫病。有CVD病史的SLE-患者aOxLDL水平明顯升高n。這些在某種程度上相互矛盾的結(jié)果可能主要是由于:LDL-氧化的不同方法和狀態(tài)在抗原性方面產(chǎn)生差異。疾病階段和風(fēng)險系數(shù)變化譜都傾向于與抗體水平相關(guān)。
[0008]氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)本身具有多種促炎特性，包括活化T細胞12，13，單核細胞/巨噬細胞和內(nèi)皮細胞14_16。OxLDL還在來自動脈粥樣硬化病灶的免疫活性細胞中促進炎癥17。但要注意，oxLDL也可以緩解急性炎癥反應(yīng)，并替代促進更低級的慢性炎癥，這在動脈粥樣硬化中可見18。有趣的是，oxLDL的多種生物學(xué)活性是由oxLDL中的血小板活化因子(PAF)-樣脂質(zhì)引起的19_21。
[0009]磷酸膽堿(phosphorylcholine, PC)不僅是血小板活化因子PAF(它在與PAF-受體相互作用時是必需的)等炎癥性磷脂和oxLDL中的主要成分，還可以作為肺炎鏈球菌(S.Pneumoniae)等多種細菌的免疫原成分22。而且，PC由凋亡細胞表達2’23。
[0010]在US5455032中，在用于提供抗感染(例如肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae))的免疫保護的疫苗中使用磷酸膽堿偶聯(lián)物。Binder等人最近對小鼠中肺炎球菌疫苗的研究24顯示，免疫接種減少了動脈粥樣硬化灶的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，由動脈粥樣硬化小鼠產(chǎn)生的多種抗oxLDL自身抗體與提供抗常見感染性病原體(包括肺炎鏈球菌)的保護作用的抗體有相同的結(jié)構(gòu)。在小鼠、而非人類中的研究并未提供任何關(guān)于特異性的信息，也未能提示，IgM抗-磷酸膽堿抗體在動脈粥樣硬化中是比相應(yīng)IgG抗體明顯更為重要的保護因子。此外，磷酸膽堿偶聯(lián)物未被用于肺炎球菌疫苗中。
[0011]另一項研究25顯示,抗磷酸膽堿抗體水平在牙周病(periodontal diseases)患者體內(nèi)升高。其結(jié)論是，磷酸膽堿是與牙周菌群中生物相關(guān)的重要的口腔抗原，而抗-PC抗體水平的升高是牙周患病的結(jié)果。至今尚無動脈粥樣硬化的抗體和可能的保護作用或進展的任何息。
[0012]目前已有多篇關(guān)于動脈粥樣硬化的免疫接種治療的文獻被公開(如W02002080954和WOO168119)，但這些是基于使用脫脂載脂蛋白B的肽片段或抗T細胞受體alpha/beta鏈的抗體。有一篇文獻(W09908109)描述了用抗脂蛋白表面氧化作用特異性表位的單克隆抗體檢測動脈粥樣硬化斑的方法。與該方法不同的是，本發(fā)明的方法使用磷酸膽堿偶聯(lián)物檢測受試者樣品中的IgM或IgG等抗體。
[0013]發(fā)明簡述
[0014]本發(fā)明涉及藥物組合物及其在治療、預(yù)防動脈粥樣硬化，例如治療、預(yù)防或緩解動脈粥樣硬化的進一步進展方面的用途，所述藥物組合物包含磷酸膽堿偶聯(lián)物、或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體。本發(fā)明還涉及磷酸膽堿偶聯(lián)物或所述抗體制劑，例如單克隆抗體在制備藥物組合物中的用途，所述偶聯(lián)物或抗體制劑可以與佐劑組合或者不與佐劑組合。本發(fā)明還涉及診斷有無抗體，例如IgM或IgG抗體的方法,所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
[0015]本發(fā)明第一方面提供了藥物組合物在制備免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。所述藥物是用于對動脈粥樣硬化有致免疫特性或治療特性的免疫接種。
[0016]本發(fā)明第二方面提供了免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的方法，所述方法包括對所述哺乳動物施用藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。所述藥物組合物是用于對動脈粥樣硬化有致免疫特性或治療特性的免疫接種。
[0017]磷酸膽堿偶聯(lián)物是指磷酸膽堿組分與載體相連，優(yōu)選通過間隔臂(spacer)相連。作為結(jié)構(gòu)性組件的磷酸膽堿可包括磷酸膽堿衍生物。合適的磷酸膽堿偶聯(lián)物實例可參見US5, 455，032，見上文。例如，US5，455，032提供了這樣的磷酸膽堿偶聯(lián)物，其中磷酸膽堿組分借助直鏈烷基和酰胺鍵與各種不同的免疫學(xué)載體相連。所述磷酸膽堿偶聯(lián)物可以是，例如人血清白蛋白(HSA)-或匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)-磷酸膽堿偶聯(lián)物或牛血清白蛋白(BSA)-磷酸膽堿偶聯(lián)物(例如見實施例)。PC-BSA(磷酸膽堿-牛血清白蛋白)可以從Biosearch Technologies, INC (Ca, USA)購買。HSA-BSA可以通過化學(xué)方法偶聯(lián)，所述方法舉例如下:
[0018]可以按照Chesebro, B.在 Biochemistryll, (1972) 766 中所述方法，以含 10% 鈕!的活性碳(charcoal)作為催化劑,使O-(4_硝基苯基-磷酰基)-膽堿(Sigma N5879)與氫氣在Iatm進行還原反應(yīng)，大量產(chǎn)生O- (4-氨基苯基磷?；?-膽堿(I)。
[0019]用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)_碳二亞胺)的MES液(pH4)使(I)與 HAS 偶聯(lián),方法基本如 Padilla, N.D.等在 J.Tmmun..Methods293 (2004) 1-11 中所述。偶聯(lián)的HAS可以通過對經(jīng)過緩沖的鹽水(pH7.4)透析而被分離。
[0020]載體可以是，例如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚合物。載體可以是乳膠珠，例如實施例中所述。
[0021]所述藥物可以用于注射給藥。
[0022]本發(fā)明另一方面提供了在先任一方面定義的一或多種磷酸膽堿偶聯(lián)物在制備免疫治療或治療缺血性心血管疾病的藥物組合物中的用途，可以與佐劑組合或不與佐劑組
口 ο
[0023]本發(fā)明又一方面提供了預(yù)防性治療或治愈性治療哺乳動物的方法，所述哺乳動物是指患有動脈粥樣硬化或者有患缺血性心血管病的風(fēng)險的哺乳動物，例如人，所述方法包括施用治療有效量的至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物、或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體。
[0024]本發(fā)明還涉及確定有無抗磷酸膽堿的抗體，例如抗磷酸膽堿的IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
[0025]本發(fā)明又一方面提供了用磷酸膽堿偶聯(lián)物診斷有無抗體，例如IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
[0026]故而本發(fā)明還有一方面提供了磷酸膽堿偶聯(lián)物在評估患者發(fā)生或進展缺血性心血管疾病的風(fēng)險的方法中的用途，在所述方法中，評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體的水平。
[0027]磷酸膽堿偶聯(lián)物已經(jīng)在上文中描述。磷酸膽堿可以與載體通過間隔臂相連。所述載體可以是蛋白質(zhì)，這可以是KLH(匙孔血藍蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。所述載體可以是乳膠珠。
[0028]所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體的水平可以用免疫分析方法評估。合適的免疫分析方法的實例在下文中描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員在任何情況下都明顯可以得知的。
[0029]可能需要測定與oxLDL或MD-LDL反應(yīng)的抗體以及測定與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體?；蛘?，或進一步地，可能需要測定HSP70，HDL, TNF和/或HSP60的水平(見實施例)以及測定與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體，例如IgM或IgG抗體的水平。[0030]發(fā)明詳述
[0031]以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明，不應(yīng)認為是對權(quán)利要求所概括的保護范圍作任何限制。本文提到的文獻都引入作為參考。
[0032]這里描述了一例測定與缺血性心血管疾病患病風(fēng)險升高或降低相關(guān)的抗磷酸膽堿IgM抗體存在與否(或水平)的方法。也可以用本領(lǐng)域已知的其它方法。類似的方法可以用于測定抗磷酸膽堿IgG抗體的存在與否(或水平)。
[0033]測定抗磷酸膽堿的IgM抗體存在與否的方法
[0034]用酶聯(lián)免疫吸附法測定抗PC-BSA的I gM抗體。
[0035]微量滴定板用PC-BSAQO μ g/ml;例如可以購自BiosearchTechnologies, INC (Ca, USA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)包被。用PBS洗板，然后將板用2%BSA溶液封閉。血清樣品用0.2%BSA-PBS稀釋(1:30)。將微量滴定板40°C保溫過夜，洗板。添加堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-人IgM(用樣品緩沖液稀釋成1:7000)，IOOul/孔，40°C保溫過夜。洗板后，添加堿性磷酸酶底物，將板于室溫避光保溫60min，進行顯色。在分光光度計中讀取405nm處的吸光度。
[0036]測試了磷酸膽堿的不同載體(carrier)和間隔臂(spacer)。載體不限于舉例的這些。也可以用本領(lǐng)域已知的其它載體，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或聚合物，例如乳膠珠。載體可以參見上文中提到的US5，455，032。
[0037]由本發(fā)明方法檢測到的IgM或IgG抗體還可以結(jié)合含有暴露在表面的磷酸膽堿(PC)的化合物中的PC,例如溶血磷脂酰膽堿(IysoPC; see, forexample, Kim et al, J ExpMed.2002S印2; 196(5):655-65)中的PC。因此，本發(fā)明的方法可以檢測與溶血磷脂酰膽堿結(jié)合的IgM或IgG抗體。
[0038]合成磷酸膽堿偶聯(lián)物和制備藥物組合物
[0039]將乳膠珠(0.20 μ m或0.81 μ m)懸浮在PBS中，與10 μ g/ml磷酸膽堿-BSA溶液混合過夜。然后將這些珠離心，用緩沖液洗數(shù)次，用10 μ g/ml BSA溶液封閉。再洗一次,然后將這些珠重懸于適當(dāng)?shù)木彌_液中達到適當(dāng)?shù)臐舛龋浔４鎮(zhèn)溆谩?br> [0040]帶有連接臂的磷酸膽堿也可以借助重氮苯基(diazophenyl)與KLH(匙孔血藍蛋白)偶聯(lián)。更優(yōu)選按照 Chesebro, B.和 Metzger, H.(1972)Biochem.11:776 的方法合成 PC的P-硝基苯基-6-(0-磷酸膽堿)羥基己酸酯衍生物。先將P-硝基苯基-6-(0-磷酸膽堿)羥基己酸酯溶于干乙腈(100mg/ml)，再迅速將其加入KLH中。使衍生物和KLH在4°C混合過夜，然后透析除去未結(jié)合的間隔臂和作為離去基團(leaving group)的p_硝基苯(nitrophenylate)。
[0041]將所得磷酸膽堿偶聯(lián)物懸浮在合適的緩沖液中，制得注射液，其可以直接用于免疫接種。
[0042]用磷酸膽堿偶聯(lián)物進行免疫接種
[0043]BALB/c小鼠腹腔注射(1.P.) 200 μ g[p-硝基苯基_6-(0_磷酸膽堿)輕基己酸酯-KLH]進行免疫接種，按照建議的免疫分析方法，在所述小鼠血漿中檢測到高滴度的識別磷酸膽堿的IgM抗體。
[0044]抗磷酸膽堿偶聯(lián)物的單克隆抗體
[0045]單克隆抗體可以用本領(lǐng)域已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法制備。例如，可參見“BrilesDE，F(xiàn)orman C，Hudak S，Claflin JL.Ant1-phosphorylcholine antibodies of theT15idiotype are optimally protective against Streptococcus pneumoniae.JExpMed.1982; 156:1177-85，，或“T15PC binding monoclonal antibodies retain specificitywhen they switch from IgM to IgG.，Spira，Gad;Aguila，Hector L ;Scharffj MatthewD.Fac.Med.，Techniton-1srael Inst.Technol.，Haifa, Israel.Journal of Immunology (I988)，140(8)，2675-80。
[0046]其它抗磷酸膽堿偶聯(lián)物抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，可以按照以下的描述，用磷酸膽堿偶聯(lián)物進行親和純化，制得人免疫球蛋白制劑的具有aPC活性的部分(subfraction)。靜脈免疫球蛋白制劑(如IGIV; Baxter等)是市面上可以買到的高純度IgG制劑，可以用于治療不具有抗體生成能力或者抗體生成能力極低的患者。免疫球蛋白制劑包括可以從以下廠家購買到的那些:Baxter (US) eg Gammagard?, Isiven (Antimo
Naples, Italy),Omrix (Te1-Hashomer，Israel) , Miles(Biological ProductsDivision, West Heaven,CT),Sclavo(Lucca, Italy), Sandoz(Novartis, Basel, Swizerlan
d) eg Sandoglobulin?, l5iotest Diagnostic Corporation (Devilie, NJ) ? 免疫球蛋白制
劑的實例有 Gammagard S/D?, Gammar IV?, Gammar-P IV?, Gammimune N?, Iveegam?,
Panglobulin?, Polygam S/D?, Sandoglobulin?, Venoglobulin?。免疫球蛋白制劑通
常包含一些 IgM，還含有 IgG。Gammagard? 中有很少量 IgM。Pentaglobin(Biotest)是富含IgM的制劑，可用于治療SARS。具有aPC活性的部分可包含IgG和IgM 二者，或者可以選擇主要包含IgG (例如，用Gammagard?等富含IgG的制劑開始，和/或選擇IgG)；或主要包含IgM(例如,用Pentaglobin等富含IgM的制劑開始,和/或選擇IgM)。
[0047]具有磷酸膽堿偶聯(lián)物特異性的抗體制劑結(jié)合未被偶聯(lián)的磷酸膽堿，也可以結(jié)合含有暴露的磷酸膽堿(PC)的化合物中的PC、例如溶血磷脂酰膽堿(IysoPC;參見，例如，Kimet al, J Exp Med.2002S印2; 196 (5): 655-65)中的PC。因此，具有磷酸膽堿偶聯(lián)物特異性的抗體制劑也可以結(jié)合溶血磷脂酰膽堿。
[0048]動脈粥樣硬化受試者中的IgM免疫球蛋白水平
[0049]在動脈粥樣硬化風(fēng)險因子相關(guān)研究中，測定高血壓患者(舒張壓(diastolicpressure) > 95mmHg)中抗磷酸膽堿的IgM自身抗體的基礎(chǔ)水平和4年后水平。結(jié)果概述如下:
[0050]在剛加入試驗時的77例受試者(35%)和4年隨訪后的84例受試者(38%)中檢測到頸動脈斑(Carotid plaque)。該研究共包括218例受試人。中膜-內(nèi)膜厚度(MT)的增加在隨訪組中比在那些剛加入試驗時具有高血清水平的抗PC IgM(75th* 90th百分點)的患者中少見。MT增加者與減少者之間抗-磷酸膽堿IgM抗體水平均值有顯著性差異(638.8 ±219.6 比(vs.) 734.8 ±266.9，p=.004)。
[0051]抗PC的IgM自身抗體與MT變化之間的關(guān)系與年齡、吸煙習(xí)慣、阿替洛爾(atenolol)或拉西地平(Iacidipine)治療以及血脂都無關(guān)。IgM自身抗體也與IgG水平無關(guān)。
[0052]因而本發(fā)明的一個實施方案是， 用磷酸膽堿偶聯(lián)物制備藥物組合物，以便在動脈粥樣硬化的治療或預(yù)防中應(yīng)用。所述偶聯(lián)物可以是磷酸膽堿與蛋白質(zhì)或聚合物相連。所述藥物組合物優(yōu)選經(jīng)注射給藥。
[0053]本發(fā)明建議的主動免疫方法將可以調(diào)節(jié)自身抗體的滴度，從而在對抗動脈粥樣硬化發(fā)生方面起到積極有利的作用。
[0054]本發(fā)明另一實施方案是，用識別磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑(例如單克隆抗體)制備藥物組合物，以便在動脈粥樣硬化的治療或預(yù)防中應(yīng)用。所述單克隆抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。
[0055]本發(fā)明另一實施方案是，提供一種用磷酸膽堿偶聯(lián)物檢測抗磷酸膽堿抗體(例如IgM或IgG抗體)存在與否的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。優(yōu)選的方法是免疫分析方法。所述方法可以用于評估患者發(fā)生或進展缺血性心血管疾病的風(fēng)險。
[0056]具體地，本發(fā)明涉及以下方面:
[0057]項1.藥物組合物在制備免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的藥物中的用途，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。
[0058]項2.免疫接種和治療哺乳動物動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的方法，所述方法包括對所述哺乳動物施用藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物，或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體，所述哺乳動物包括人。
[0059]項3.項I的用途或項2的方法，其中所述藥物是用于通過注射來施用的藥物或者所述組合物通過注射來施用。
[0060]項4.在先任一項的用途或方法，其中磷酸膽堿與載體經(jīng)由間隔臂連接。
[0061]項5.項4的用途或方法，其中所述載體是蛋白質(zhì)。
[0062]項6.項5的用途或方法，其中所述蛋白質(zhì)是KLH(匙孔血藍蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
[0063]項7.項4的用途或方法，其中所述載體是乳膠珠。
[0064]項8.在先任一項定義的一或多種磷酸膽堿偶聯(lián)物在制備免疫治療或治療缺血性心血管疾病的藥物組合物中的用途，所述偶聯(lián)物可以與佐劑組合或不與佐劑組合。
[0065]項9.預(yù)防性治療或治愈性治療哺乳動物的方法,所述哺乳動物是指患有動脈粥樣硬化或者有患缺血性心血管病的風(fēng)險的哺乳動物，例如人，所述方法包括施用治療有效量的至少一種磷酸膽堿偶聯(lián)物、或特異性針對磷酸膽堿偶聯(lián)物的抗體制劑，例如單克隆抗體。
[0066]項10.用磷酸膽堿偶聯(lián)物診斷有無IgM或IgG抗體的方法，所述抗體與患缺血性心血管病風(fēng)險的增加或降低相關(guān)。
[0067]項11.項10的方法，其中磷酸膽堿與載體經(jīng)由間隔臂連接。
[0068]項12.項11的方法，其中所述載體是蛋白質(zhì)。
[0069]項13.項12的方法，其中所述蛋白質(zhì)是KLH(匙孔血藍蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
[0070]項14.項11的方法，其中所述載體是乳膠珠。
[0071]項15.項10-14之一的方法，其中所述試驗是免疫分析。[0072]項16.磷酸膽堿偶聯(lián)物在評估患者發(fā)生或進展缺血性心血管疾病的風(fēng)險的方法中的用途，在所述方法中，評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的IgM或IgG抗體的水平。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0073]圖1A:用β 2GPI, PS和CL抑制抗體(IgM)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗部分所述進行競爭試驗。結(jié)果用均值土SD表示。
[0074]圖1B:用β 2GPI, PS和CL抑制抗體(IgG)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗部分所述進行競爭試驗。結(jié)果用均值土SD表示。
[0075]圖2A:用oxLDL和MDA-LDL抑制抗體(IgM)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗部分所述進行競爭試驗。結(jié)果用均值土SD表示。
[0076]圖2B:用oxLDL和MDA-LDL抑制抗體(IgG)與經(jīng)過PC白蛋白包被的ELISA-板的結(jié)合。通過不同抗原與PC白蛋白包被板的結(jié)合來抑制。為研究aPC的特異性，按照試驗部分所述進行競爭試驗。結(jié)果用均值土SD表示。
[0077]圖3:從IGIV提取的aPC對巨噬細胞中oxLDL攝取的影響
[0078]測試了兩組:巨噬細胞加oxLDL，巨噬細胞加已經(jīng)與從IVIG提取的aPC預(yù)保溫的oxLDLο
[0079]巨噬細胞+-oxLDL (共107個細胞):
[0080]弱染色37/107=34.58% 強染色 10/107=9.35% 總?cè)旧栃?47/107=43.93%
[0081]巨噬細胞+Dil-oxLDL+aPC-組(檢查了 156個細胞):
[0082]弱染色37/156=23.72% 強染色 2/156=1.28% 總?cè)旧栃?39/156=25%
[0083]圖3A示Dil-標(biāo)記的oxLDL染色。圖3B顯示無標(biāo)記的oxLDL的染色。
[0084]圖4:將高血清滴度抗磷脂抗體(aPL)與人免疫球蛋白集合物Gammagard?.飩保溫對膜聯(lián)蛋白V與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的結(jié)合的影響:培養(yǎng)24小時后進行流式細胞術(shù)分析
[0085]
【權(quán)利要求】
1.磷酸膽堿偶聯(lián)物在制備用于評估人類患者發(fā)生或進展心血管疾病的風(fēng)險的試劑盒中的用途，其中所述試劑盒是評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的抗體的水平的試劑盒。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述心血管病是缺血性心血管病。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述心血管病是動脈粥樣硬化。
4.權(quán)利要求1-3之一的用途，其中所述試劑盒是評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的IgM抗體的水平的試劑盒。
5.權(quán)利要求1-3之一的用途，其中所述試劑盒是評估所述患者的與磷酸膽堿偶聯(lián)物反應(yīng)的IgG抗體的水平的試劑盒。
6.權(quán)利要求1-5之一的用途，其中磷酸膽堿偶聯(lián)物是與載體連接的磷酸膽堿，優(yōu)選經(jīng)由間隔臂連接。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述載體是蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述蛋白質(zhì)是KLH(匙孔血藍蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
9.權(quán)利要求6的用途，其中所述載體是乳膠珠。
10.權(quán)利要求1-9之一的用途，其中所述試劑盒是進行免疫分析的試劑盒。
【文檔編號】C07K16/44GK103743898SQ201310484529
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2004年4月15日
【發(fā)明者】烏爾夫.德費爾, 約翰.弗羅斯特加德 申請人:阿瑟拉生物技術(shù)公司