雙特異性抗原結合蛋白復合物以及制備雙特異性抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了雙特異性抗原結合蛋白復合物，雙特異性抗體,制備所述雙特異性抗體的方法和所述雙特異性抗體的藥物用途。應用根據(jù)本發(fā)明一個方面的蛋白復合物，有可能有效制得識別兩種抗原、或相同抗原上兩種表位的雙特異性抗體。所述雙特異性抗體可以用于診斷、預防和/或治療諸如細胞增生性疾病或免疫性疾病之類的疾病。
【專利說明】雙特異性抗原結合蛋白復合物以及制備雙特異性抗體的方法
[0001]相關申請的交叉參考
[0002]本申請要求2012年10月31日向韓國專利局提交的韓國專利申請10-2012-0122559的權益，該申請全文引入本文作為參考。
【技術領域】
[0003]本申請涉及雙特異性抗原結合蛋白復合物，制備雙特異性抗體的方法，以及所述雙特異性抗體的藥用目的。
【背景技術】
[0004]單克隆抗體已成為上市新藥的領導者，因此已被研發(fā)作為針對多種標靶的藥物。但在很多情況中，新藥研發(fā)受限；例如效力不令人滿意，用于產生抗體的花費高昂，等等。作為解決這些問題的方案之一，對雙特異性抗體的研究自上世紀八十年代中期起就逐步發(fā)展，雖然付出了很大努力，不過仍未有占優(yōu)勢的技術。
[0005]在制備雙特異性抗體的常規(guī)方法中，對于大量制備同質的雙特異性抗體仍有困難，或者因效率低和副作用而有實際操作的困難。近年來，基于對抗體改造技術的大力研發(fā)，出現(xiàn)了一些有競爭性的新抗體平臺，但它們仍處于驗證階段。
[0006]因此，即使是利用常規(guī)技術，仍需要研發(fā)新平臺來制備對至少兩種異質性抗原具有特異性的抗體，并需要制備所述蛋白的方法。
[0007]發(fā)明概述
[0008]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在此提供了雙特異性抗原結合蛋白復合物，其包括兩個抗體結合位點。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在此提供了編碼所述雙特異性抗原結合蛋白復合物的多核苷酸。
[0010]本發(fā)明還提供了用經重組表達載體轉化的宿主細胞制備雙特異性抗體的方法。
[0011]本發(fā)明還提供了包括所述雙特異性抗體的藥物組合物。
[0012]本發(fā)明還提供了包括所述雙特異性抗體的診斷組合物。
[0013]其它方面在下文的說明書中描述了一部分，另外的部分基于說明書是很明顯的，或者可以通過實施所述各方面而理解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]這些和/或其它 方面在參照下文對各個方面的描述，并結合所附的附圖后將是非常明顯和更易于理解到的:
[0015]圖1和圖2示意根據(jù)本發(fā)明一個方面的雙特異性抗原結合蛋白復合物和雙特異性抗體；
[0016]圖3示意根據(jù)本發(fā)明一個方面的雙特異性抗原結合蛋白復合物的氨基酸序列結構；
[0017]圖4示意根據(jù)本發(fā)明一個方面表達并純化雙特異性抗體的離子交換層析結果；
[0018]圖5示意根據(jù)本發(fā)明一個方面，未經β -巰基乙醇處理(_)和經過其處理(+)的雙特異性抗體的SDS-PAGE;和
[0019]圖6是傳感圖(sensogram),示意了雙特異性抗體的雙重抗原結合反應。
[0020]發(fā)明詳述
[0021]現(xiàn)在會詳細提到各實施方案，附圖中舉例說明了它們的實例，其中同樣的參考號指代全文上下的相同要素。在這點上，當前的實施方案可以具有不同的形式且不應解釋為限于本文中所列的描述。因而，下文僅僅為了解釋本說明書的各方面而參照附圖來描述各實施方案。如本文中所使用的，術語“和/或”包括一個或多個所列項的任何和所有組合。象“至少一個”這樣的表述置于一系列元件之前時，修飾的是所列出的所有元件，而不是修飾列表中的單個元件。
[0022]應理解，本文描述的例示性的各個方面應僅視為描述性質而不是限制。對每個方面中多個特征或項的描述一般應視為也能適用于其它方面中的類似特征或項。
[0023]根據(jù)本發(fā)明一個方面，提供了雙特異性抗原結合蛋白復合物，其包括第一多肽、第二多肽和接頭，所述第一多肽在N端包括第一抗原結合位點，所述第二多肽在N端包括第二抗原結合位點，所述接頭連接所述第一多肽和所述第二多肽，其中所述接頭在兩末端包括第一標簽和第二標簽，且所述第一標簽連接至所述第一多肽C端，所述第二標簽連接至所述第二多肽N端，所述第一標簽和第二標簽各自包括可切割的氨基酸序列。
[0024]根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了雙特異性抗原結合蛋白復合物，其包括第一多肽、第二多肽和接頭，所述第一多肽在 N端包括第一抗原結合位點，所述第二多肽在N端包括第二抗原結合位點，所述接頭連接所述第一多肽和所述第二多肽，其中所述接頭包括位于一個末端的標簽，且所述標簽連接至所述第一多肽C端或所述第二多肽N端、并包括可切割的氨基酸序列。
[0025]術語“雙特異性”在本文中是指兩種不同抗原，或甚至當這兩者是相同抗原時，它們每一個都具有針對不同表位的結合特異性。所述表位可以源自不同抗原或相同抗原。術語“雙特異性抗原結合蛋白復合物”和“雙特異性抗體”在本文中是指所有制得的具有全長抗體或帶抗原結合位點的片段的產物。所述抗體可以是人抗體，非人抗體，人源化抗體，或嵌合抗體。
[0026]術語“抗原結合位點”在本文中是指免疫球蛋白分子中結合抗原或表位的位點，所述抗原結合位點可包括互補決定區(qū)(CDR)。CDR是指免疫球蛋白重鏈或輕鏈高變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。重鏈和輕鏈各自可包含三個⑶R(例如，⑶RH1，⑶RH2，⑶RH3，以及⑶RL1，⑶RL2，⑶RL3)。⑶R可為所述抗體與抗原或表位結合而提供主要的接觸殘基。術語“重鏈”在本文中理解為包括全長重鏈，該重鏈包含具有決定抗原特異性的氨基酸序列的可變區(qū)(Vh)和具有三個恒定結構域(CH1，CH2，和CH3)的恒定區(qū)，以及它們的片段。同樣，術語“輕鏈”在本文中包括全長輕鏈，該輕鏈包含具有決定抗原特異性的氨基酸序列的可變區(qū)(Vl)，還包含恒定區(qū)(Cl)，以及它們的片段。
[0027]根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述蛋白復合物和雙特異性抗體可包括結合不同抗原或不同表位的第一抗原結合位點和第二抗原結合位點?？山Y合抗原結合位點的抗原在正常情況下可以不表達或低水平表達；但該抗原在特定的疾病條件下，例如，在瘤形成疾病或在免疫性疾病中，可以顯示增加的表達。這種抗原可選自:VEGF，EGFR，EpCAM，CCR5，CD19, HER-2neu, HER-3, HER-4, PSMA, CEA, MUC-1 (粘蛋白)，MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B，MUC7, β hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30,神經節(jié)苷脂 GD3, 9-0-乙酰基-GD3, GM2, Globo
H,巖藻糖基GMl，poly SA，⑶2，碳酸酐水化酶IX(MN/CA IX)，CD44v6，音猬因子(SonicHedgehog, Shh)，ffue-1,漿細胞抗原，(膜結合)IgE，黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(Melanoma Chondroitin Sulfate Proteoglycan, MCSP), CCR8, TNF- α 前體，STEAP,間皮素(mesothelin)，A33抗原，前列腺干細胞抗原(PSCA)，Ly_6,橋粒芯蛋白4，E-1丐粘著蛋白新表位(neo印itope)，胎兒乙酰膽堿受體，CD25, CA19-9標記物，CA-125標記物和繆氏抑制物質(Mullerian Inhibitory Substance, MIS) II，sTn (唾液酸化 Tn 抗原；TAG-72)，F(xiàn)AP (成纖維細胞激活蛋白)，內皮唾液酸蛋白&11(105^&1111)36?1^111，1^，5六5和0)63。
[0028]為了實現(xiàn)均衡的(uniform)生理效應,所述結合不同抗原的蛋白復合物和雙特異性抗體可以使用抗原組合，所述組合誘導該兩種抗原-抗體反應的協(xié)同效應、或允許一系列連鎖作用。針對抗原組合的雙特異性抗體可包括，例如，靶向腫瘤細胞抗原和細胞毒觸發(fā)分子抗原的雙特異性抗體(BsAb)，例如，抗-Fe Y RI/抗-⑶15，抗-pl85HER2/Fe Y RIII (CD 16)，抗-CD3/ 抗-惡性-B 細胞(10)，抗-CD3/ 抗-p 185HER2，抗-CD3/ 抗-p97，抗-⑶3/抗-腎細胞癌，抗-⑶3/抗-0VCAR-3，抗-⑶3/L-D1 (抗-結腸直腸癌)，抗-⑶3/抗-黑色素刺激性激素類似物，抗-EGFR/抗-⑶3，抗-⑶3/抗-CAMAl，抗-⑶3/抗-⑶19，抗-CD3/MoV18，抗-神經細胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-葉酸結合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相關抗原(AM0C-31)/抗-CD3 ;靶向腫瘤細胞抗原和抗毒素抗原的BsAb，例如，抗_阜素/抗抗-0)22/抗-阜素，抗-0)7/抗-阜素，抗-0)38/抗-阜素，抗-CEA/抗-賴氨酸A鏈，抗-干擾素-a (IFN- α ) /抗-雜交瘤獨特型，抗-CEA/抗-長春花生物堿(Vinca alkaloid);改變被酶激活的前藥的BsAb，例如，抗-⑶30/抗-堿性磷酸酶(催化絲裂霉素磷酸酶前藥變?yōu)榻z裂霉素醇)；用作纖維蛋白分解物(fibrin decomposer)的BsAb，例如，抗-纖維蛋白/抗-組織纖溶酶原激活劑(tPA)，抗-纖維蛋白/抗-尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA);靶向細胞表面受體中免疫復合物的BsAb，例如，抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fe受體(例如:Fc yRI，F(xiàn)c YRll或c YRIII);用于治療傳染病的BsAb，例如，抗-⑶3/抗-單純皰疹病毒(HSV)，抗-T-細胞受體:⑶3復合物/抗-流感，抗-Fe Y R/抗-HIV ;用于體外或體內檢測腫瘤的BsAb，例如，抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-P185HER2/抗-半抗原)；作為疫苗佐劑的BsAb ;和作為診斷工具的BsAb，例如，抗-兔IgG/抗-鐵蛋白，抗-馬辣根過氧化物酶(HRP)/抗-激素,抗-生長抑素(somatostatin)/抗-物質P，抗-HRP/抗-FITC，和抗-CEA/抗-β -半乳糖苷酶。
[0029]根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述包括抗原結合位點的多肽可以是完整抗體或者是完整抗體的片段(抗原結合片段)。
[0030]完整抗體具有以下結構:兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈，每對輕鏈和重鏈由二硫鍵(S-S鍵)相連?？贵w的恒定區(qū)分為重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，重鏈恒定區(qū)有ga_a(Y)、mu ( μ )、alpha ( α )、delta ( δ )、和 epsilon ( ε )型，還有 gamma I ( Y I) > gamma2 ( y 2) >gamma3 ( y 3)、gamma4 ( y 4)、alphal ( a I)、和 alpha2 ( a 2)亞型。輕鏈恒定區(qū)有 kappa ( κ )和 lambda( λ )型。[0031]術語"抗原結合片段"在本文中是指完整抗體中因有抗原結合位點而具有抗原結合能力的一個部分。該定義中的抗原結合片段可包括(i)輕鏈可變區(qū)(VL)，帶有輕鏈恒定區(qū)(CL)的Fab片段，重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈第一恒定區(qū)(CHl) ; (ii)Fab’片段，是在CHl結構域的C端有至少一個半胱氨酸的Fab片段；(iii)帶有VH和CHl結構域的Fd片段；(iv)在VHJP CHl結構域、和CHl結構域C端有至少一個半胱氨酸的Fd’片段；(v) Fv片段，是在抗體單臂上有\(zhòng)和Vh結構域的最小抗體片段(兩鏈Fv通過該抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的非共價鍵相連)，單鏈Fv (scFv) 一般是重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間由肽接頭經共價鍵而連成，或者，由于單鏈Fv直接連至C端，因而可以形成類似于雙鏈Fv的二聚體；(vi) dAb 片段，由 VH 結構域構成(Ward et al., Nature341, 544-546 (1989)) ;(vii)分離的⑶R區(qū)；(viii) F (ab’)2片段，是雙價片段，包括由位于絞鏈區(qū)的二硫橋連接的兩個Fab’片段；(ix)單鏈抗體分子(例如，單鏈Fv ;scFv (Bird et al.，Science242:423-426 (1988)；Huston et al.，PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)) ； (x)雙體抗體(diabody)，在同一多肽鏈上有兩個抗原結合位點，所述位點包括輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Hollinger etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:6444-6448 (1993)) ； (xi)線性抗體，包括一對串聯(lián) Fd 節(jié)段(VH-CH1-VH-CH1),與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(qū)(Zapata et al.ProteinEng.8(10):1057-1062(1995));和(xii)單域抗體，僅包括由VH、CH2、和CH3重鏈組成的重鏈?？乖Y合片段可以用蛋白酶獲得(例如，F(xiàn)ab可以由木瓜蛋白酶對完整抗體進行限制性片段化而獲得，F(xiàn)(ab’)2可以由胃蛋白酶進行片段化獲得)，所述片段也可以用重組DNA技術制得。 [0032]根據(jù)本發(fā)明一個方面，包含抗原結合位點的多肽可以是單域抗體。術語“單域抗體”在本文中是指具有單個可變區(qū)(Vh)單體的肽鏈，由不含重鏈和輕鏈CHl區(qū)的約110個氨基酸組成。所述單域抗體可以是，重鏈抗體，天然單域抗體(一種天然不具有輕鏈的抗體)，由常規(guī)的4鏈抗體衍生的單域抗體，或人工抗體；或單域支架，是并非來源于抗體的單域支架。單域抗體分子是非常小(只有IgG分子的約1/10)和非常穩(wěn)定(在極端的pH或溫度條件下都維持穩(wěn)定性)的單鏈多肽。而且，與常規(guī)抗體不同，單域抗體分子具有對蛋白酶活性的耐受，能夠在體外以較高的產量大量生成。單域抗體可包括抗原結合區(qū)或可結晶片段(fragment crystallizable, Fe)區(qū)?？乖Y合位點可以是,例如，當結合的抗原是VEGF時具有序列表中編號為2或3的氨基酸序列，當結合的抗原是EFGR時具有序列表中編號為5或6的氨基酸序列。Fe區(qū)可包括絞鏈區(qū)或兩個恒定區(qū)(CH2和CH3)，例如，可具有序列表中編號為4的氨基酸序列。
[0033]根據(jù)本發(fā)明一個方面，包含抗原結合位點的多肽可以選自序列號8-44的氨基酸序列。
[0034]術語〃標簽〃在本文中是指結合在融合蛋白末端的蛋白或多肽，所述標簽是連接不同融合蛋白的媒介。所述標簽可以連接至多肽的N端或C端。根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述標簽可以在體外或體內切割。所述體外或體內切割可通過蛋白酶來進行。
[0035]根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述標簽可以選自泛素、泛素-樣蛋白、和TEV切割肽。泛素(Ub)是自然界發(fā)現(xiàn)的最保守的蛋白，其序列中有76個氨基酸，可溶于水，在諸如昆蟲、虹鱒和人類等多個進化上各異的物種之間有非常大的同源性。而且，泛素已知是在PH改變時顯示穩(wěn)定的蛋白，在高溫時不容易變性，有蛋白酶時也顯示穩(wěn)定。[0036]泛素或泛素-樣蛋白可選自野生型泛素、野生型泛素-樣蛋白、突變的泛素、和突變的泛素-樣蛋白。根據(jù)本發(fā)明一個方面，泛素可以由序列號7的氨基酸序列組成。泛素-樣泛素蛋白是具有與泛素相似的性質的蛋白，可選自，例如，Nedd8, SUMO-1, SUMO-2, NUB1，PIC1，UBL3，UBL5，和ISG15。突變的泛素是指野生型泛素的氨基酸序列變成另一種氨基酸序列，例如，突變的泛素包括，野生型泛素的Lys被Arg取代，以及野生型泛素的C端RGG被RGA取代。根據(jù)本發(fā)明一個方面，考慮到Lys被Arg取代的突變泛素，所述取代可見于序列號6，11，27，29，33，48，和63所示的野生型泛素中的Lys，且所述取代可以獨立地發(fā)生或組合地發(fā)生。
[0037]根據(jù)本發(fā)明一個方面，泛素或泛素-樣蛋白可包括能在體外或體內在C端被蛋白酶切割的氨基酸序列。能被蛋白酶切割的氨基酸序列可在本領域已知的搜索數(shù)據(jù)庫中找到。例如，蛋白酶和可切割的氨基酸序列可見于http://www.expasy.0rR/tools/peptidecutter/peptidecutter enzymes, html。當包括可切害I]的氨基酸序歹lj時，蛋白復合物可以在體外或體內切割其標簽，從而該蛋白復合物可形成雙特異性抗體的三級結構，由此行使其功能。
[0038]根據(jù)本發(fā)明一個方面，蛋白復合物可包括連接所述第一多肽和所述第二多肽的接頭。所述接頭可以是肽接頭?？梢圆捎帽绢I域已知的多種接頭，例如，所述接頭可以由多個氨基酸組成。根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述接頭可以是，例如，由約1-100個或約2-50個隨機氨基酸組成的多肽。
[0039]所述肽接頭可以通過充分分隔所述第一多肽和所述第二多肽而折疊成功能性的二級或三級結構。例如，肽接頭可包括Gly、AsnJP Ser殘基,并可包括諸如Thr和Ala等中性氨基酸。適于肽接頭的氨基酸序列是本領域已知的。另一方面，接頭的長度可以多種多樣，只要該長度不影響融合蛋白的功能。
[0040]根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述接頭可以在至少一個末端包括標簽。而且，所述標簽連接至接頭的該末端，并可以包括可切割的氨基酸序列。
[0041 ] 根據(jù)本發(fā)明另一方面，蛋白復合物還可以包括分泌信號序列。
[0042]分泌信號序列是指，通過連接至編碼序列位于細胞膜外側或細胞外側的N端而誘導所表達的蛋白或肽的分泌的序列，所述信號序列可以是由約18-30個氨基酸組成的肽序列。所有能轉運到細胞膜外側的蛋白有不同的信號序列，所述信號序列被細胞膜上的信號肽酶切割。通常，對于并非宿主細胞天然表達的外來蛋白而言，可以采用能將該蛋白分泌到細胞周質或培養(yǎng)基中的分泌信號序列，或采用修飾的序列。
[0043]根據(jù)本發(fā)明一個方面，蛋白復合物的氨基酸序列可以適當改變，只要目標功能或特性如抗原特異性未真正改變。氨基酸中的變化基于氨基酸殘基取代產物的相似性而發(fā)生，例如，基于疏水特性、親水特性、電荷、和/或大小，為此，可以考慮氨基酸疏水指數(shù)。所述變化可以是，例如，部分地取代、缺失、和/或添加氨基酸，特別地，所述取代可以是保守取代。術語“保守取代”在本文中是指不改變所得分子的生物活性的取代，使得取代的氨基酸不影響蛋白的三級結構或局部荷電狀態(tài)。不完全影響分子活性的氨基酸取代是本領域已知的，例如可包括以下氨基酸取代:Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Thy/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val, Ala/Glu,和 / 或 Asp/Gly。[0044]本發(fā)明另一方面中，提供了編碼所述蛋白復合物的多核苷酸。
[0045]術語“多核苷酸”在本文中是指以單鏈或雙鏈形式存在的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物。所述多核苷酸包括RNA基因組序列，DNA(gDNA和cDNA)或從DNA轉錄的RNA序列，而且，除非特別指明，所述多肽還包括天然多核苷酸、糖、或堿基改變的類似物。根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述多核苷酸是輕鏈多核苷酸。
[0046]所述多核苷酸包括編碼蛋白復合物氨基酸序列的核苷酸序列，也包括與其互補的核苷酸序列。所述互補序列包括完全互補的序列和基本上互補的序列，這是指能在本領域已知的嚴謹條件下與編碼蛋白復合物氨基酸序列的核苷酸序列雜交的序列。
[0047]而且，編碼蛋白復合物氨基酸序列的核苷酸序列可以被改變或突變。所述改變包括添加、缺失、或非保守取代或保守取代。編碼蛋白復合物氨基酸序列的多核苷酸可以被解釋為，包括相對于該多核苷酸有實質性同一'I"生的核苷酸序列。所述實質性同一'I"生將該核苷酸序列與另外的隨機序列以使得它們最大對應的方式進行比對，當用本領域常見的算法分析所比對的序列時，所述序列可顯示大于80%的同源性，大于90%的同源性，或大于95%的同源性。
[0048]根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述多核苷酸可具有選自序列號45-81的堿基序列。
[0049]制備所述蛋白復合物可以使用所述多核苷酸，并可以涉及本領域已知的遺傳工程技術和/或化學合成。所述遺傳工程技術可涉及制備克隆載體或表達載體以便用該載體轉化宿主細胞,并培養(yǎng)所述宿主細胞以便表達目標蛋白。
[0050]因此，本發(fā)明一個方面提供制備雙特異性抗體的方法，所述方法包括，制備重組表達載體，其中插入了編碼上述蛋白復合物的多核苷酸，用所述重組表達載體轉化宿主細胞，培養(yǎng)所轉化的宿主細胞，以及收集在宿主細胞中表達的雙特異性抗體。
[0051]術語“載體”在本文中是指表達目標基因的工具，將它導入宿主細胞后，它產生多個拷貝的外來DNA，所述DNA是獨立地克隆并插入所述載體和引入所述細胞中的。術語“重組表達載體”在本文中是指插入了外來DNA片段用以擴增目標蛋白的載體，所述外來DNA片段可以是編碼蛋白復合物的多核苷酸。產生用于表達或克隆的載體系統(tǒng)的方法是本領域已知的。
[0052]所述載體可包括與所述多核苷酸序列可操作相連的調控序列。
[0053]術語“調控序列”在本文中是指用于表達編碼序列的核酸序列，調控序列的特性可以因宿主生物而有不同。在原核生物中，調控序列一般包括啟動子、核糖體結合位點、以及轉錄/翻譯終止子。在真核生物中，調控序列一般包括啟動子、終止子，在某些情況下，還包括增強子，反式活化因子，或轉錄因子。術語“可操作相連”在本文中是指因功能性結合所致的連接，使得各組分能按照預想的進行操作?？刹僮飨噙B至編碼序列的調控序列是在編碼序列的表達能與調控序列并存的情況下進行連接的。
[0054]以原核細胞作為宿主時,重組載體可包括:能處理轉錄的強啟動子(例如，tac啟動子，Iac啟動子，lacUV5啟動子，Ipp啟動子，pL λ啟動子，pRA啟動子，rac5啟動子，amp啟動子，recA啟動子，SP6啟動子，trp啟動子,和/或T7啟動子);用于啟動翻譯的核糖體結合位點；和轉錄/翻譯終止子。以大腸桿菌(例如，HB101,BL21,或DH5 α )作為宿主細胞時，可以采用大腸桿菌啟動子和色氨酸生物合成途徑的多個操縱子(Yanofsky，C.(1984) ,J.Bacteriol.，158:1018-1024)，和/或噬菌體λ的左向啟動子(pL λ啟動子，Herskowitz, 1.和 Hagen, D.(1980), Ann.Rev.Genet., 14:399-445)作為調控區(qū)。以真核細胞為宿主時，可以采用源自哺乳動物細胞前體的啟動子(例如:金屬硫蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(例如:腺病毒晚期啟動子，S.苗病毒啟動子7.5K,SV40啟動子或巨細胞病毒啟動子，以及HSV的atk啟動子)，并可以有聚腺苷酸化序列作為轉錄終止序列。
[0055]除了調控序列，所述重組表達載體還可包括限制性位點，諸如耐藥基因等標記基因、分泌信號序列、或先導序列。限制性位點是指被限制性酶特異性識別的特定堿基序列。限制性位點可以是被諸如下列的限制性酶特異性識別的序列:例如，EcoRI, BamHI,Hind II1、kpn 1、Not 1、Pst 1、Sma 1、和/或Xho I。標記基因起可選擇標記的作用，可以是針對諸如氨芐青霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、遺傳霉素、新霉素、和/或四環(huán)素等藥物的耐藥基因。分泌信號序列或先導序列都是誘導所合成的蛋白移動至細胞隔室(例如，周質空間)的序列，或誘導所合成的蛋白分泌至細胞外的培養(yǎng)基中的序列，所述序列可以包括在多核苷酸序列的編碼序列中。所述序列可以由本領域普通技術人員適當?shù)剡x擇，以便對應于所引入的DNA、宿主細胞類型、和/或培養(yǎng)基的各方面情況。
[0056]包含所述多種因子的合適載體已知有，例如，Okayama-Berg cDNA表達載體pcDVl(Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3(Invitrogen)), pEF-DHFR, pEF-ADA 或pEF-neo,或 pSPORTl(GIBCO BRL)。
[0057]根據(jù)本發(fā)明一個方面，宿主細胞可以通過用所述重組表達載體或雙特異性抗原結合蛋白復合物轉化或轉染宿主來制得。
[0058]宿主細胞可以是本領域已知有可能穩(wěn)定重組載體并有可能持續(xù)地克隆和表達的原核細胞或真核細胞。原核生物是指可以用DNA分子或RNA分子轉化以便表達蛋白的細菌。例如，大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌屬的菌株如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)、鏈霉菌(Streptomyces) >單胞菌(Pseudomonas)(例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas putida))、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)、 葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus))、大鼠傷寒(rattyphus)(鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium))、或粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)。真核細胞包括酵母、高等植物、昆蟲或哺乳動物細胞。根據(jù)本發(fā)明一個方面，宿主細胞可以是哺乳動物細胞。有用的哺乳動物細胞的例子有猴腎細胞，用SV40轉化的CVl細胞系(COS-7，ATCC CRL1651);人胚腎細胞系(HEK-293或亞克隆的 hEK-293 細胞用于在懸浮培養(yǎng)中的生長，Graham et al.，J.Gen Virol.36:59(1977))；倉鼠幼鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub etal., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA77:4216 (1980))；小鼠 sertoli 細胞(TM4, Mather, Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CVIATCC CCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76, ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL2);犬腎細胞(MDCK, ATCC CCL34) ；buffalo大鼠肝細胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺細胞(W138, ATCC CCL75);人肝細胞(HepG2, HB8065);小鼠乳腺癌細胞(MMT060562, ATCCCCL51) ; TRl 細胞(Mather et al.,AnnalsN.Y.Acad.Sc1.383:44-68 (1982)) ;MRC5 細胞；FS4 細胞；和 / 或人肝腫瘤細胞系(Hep G2)。
[0059]將重組表達載體轉化至宿主細胞中可以通過，例如，DEAE-葡聚糖介導的轉染、電穿孔、轉到、磷酸鈣轉染、陽離子脂質介導的轉染、刮拭加載(scrapeloading)、和/或感染來進行。
[0060]培養(yǎng)宿主細胞可通過用本領域已知的合適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件來進行?？梢悦子蒙唐坊囵B(yǎng)基，例如，Ham’s FlO (Sigma), MEM (Minimal EssentialMedium,Sigma),RPM1-1640 (Sigma),和 / 或 DMEM(Dulbecco，s ModifiedEagle'sMedium, Sigma)。需要時，可以根據(jù)已知的合適濃度添加激素或其它生長因子，鹽，緩沖液，核苷酸，抗生素，痕量元素和/或葡萄糖。培養(yǎng)條件例如溫度和/或PH可以取決于本領域普通技術人員所選定的宿主細胞。
[0061]宿主細胞所表達的雙特異性抗原結合蛋白復合物可以通過分泌信號肽分泌到細胞外，在這種情況下，可以通過從培養(yǎng)液或培養(yǎng)基中回收而獲得該復合物。例如，通過用蛋白濾器濃縮培養(yǎng)上清，可以分離出抗體蛋白。但是，無分泌信號序列時表達的蛋白復合物可以從細胞裂解物直接獲得，因為該蛋白復合物存在于細胞的周質中。將分泌至周質中的抗體分離出的方法是本領域已知的，所述抗體通?？梢酝ㄟ^離心顆粒片段(宿主細胞的片段或解體的宿主細胞)或通過超離心來獲得。 [0062]選擇性地，從培養(yǎng)中獲得的雙特異性抗體可以進一步用本領域已知方法純化。例如，根據(jù)所回收的抗體，對雙特異性抗體的純化可以用通常已知的蛋白純化方法諸如(例如，離子交換，親水，疏水，和/或大小排阻)，層析聚焦，SDS-PAGE，和/或溶液分級分離(例如，硫酸銨沉淀)。根據(jù)本發(fā)明一個方面，雙特異性抗體可以用親和層析來純化。作為親和配體，蛋白A的合適性對應于抗體中的Fe區(qū)類型和免疫球蛋白同種型。附著有親和配體的基質可以是瓊脂糖，但不限于此，并且，機械方面穩(wěn)定的基質(例如，調孔玻璃(regulatedpore glass)或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)可以比瓊脂糖更改進流速和處理時間。
[0063]根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了包括上述雙特異性抗體的藥物組合物，和可藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑。
[0064]所述藥物組合物可以通過雙特異性抗原-抗體結合反應所致的生理效應作為治療機制來預防和治療疾病，或者所述組合物可以靶向因抗原-抗體反應導致的損傷。根據(jù)本發(fā)明一個方面，所述疾病可以是例如，增生性疾病，瘤形成疾病，炎性疾病，自身免疫病，傳染病，病毒性疾病，過敏，移植物抗宿主病，和/或宿主抗移植物病。
[0065]例如，就特異性結合VEGF和EGFR的抗體而言，所述包含雙特異性抗體的藥物組合物可用于預防和/或治療因抑制血管生成和/或抑制表皮生長而改善的疾病，例如，瘤形成病(neoplastic disease)。所述瘤形成病可以是，肺鱗狀細胞癌，肺癌(包括小細胞肺癌，非小細胞肺癌，肺腺癌，或肺鱗狀細胞癌)，腹膜癌(peritoneal cancer)，肝細胞瘤(h印atoma)，胃腺癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，膠質瘤(glioma)，膠質母細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer),膀胱癌,肝腫瘤(hepatic tumor),乳腺癌，結腸癌，結直腸癌,子宮內膜癌或子宮癌，唾液腺腫瘤，腎細胞癌，前列腺癌，外陰癌(vulva cancer)，甲狀腺癌，肝癌(hepatic carcinoma),以及各種形式的頭頸癌；B_細胞淋巴瘤(低級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL);小淋巴細胞淋巴瘤(SL);非何杰金氏淋巴瘤沖級/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤；中級分化型非何杰金氏淋巴瘤；高級免疫母細胞性非何杰金氏淋巴瘤；高級淋巴母細胞性非何杰金氏淋巴瘤；高級非裂解小細胞型非何杰金氏淋巴瘤；大腫塊(bulkydisease)非何杰金氏淋巴瘤；套細胞淋巴瘤；AIDS_相關淋巴瘤；和Waldenstrom氏巨球蛋白血癥；慢性淋巴細胞白血病(CLL);急性淋巴母細胞白血病(ALL);毛發(fā)細胞白血病；慢性髓細胞白血病；移植后淋巴增生性疾病(PTLD);和/或與斑痣性錯構瘤(phacomatosis)有關的血管內皮細胞異常增生，水腫(與腦瘤有關的水腫)，和/或麥杰綜合征(Meigesyndrome)。
[0066]根據(jù)本發(fā)明一個方面，藥物組合物中的雙特異性抗體可以是與第二種激活劑(功能分子)結合的形式。所述第二種激活劑可以是能預防或治療目標疾病的隨機功能分子，可包括化合物，肽，多肽，核酸，碳水化合物，脂質，或無機粒子。在所述藥物組合物中，雙特異性抗體可以本身具有治療活性；但它可以發(fā)揮將所述第二種激活劑靶向特異性疾病區(qū)的功能。所述疾病區(qū)可以是與抗原特異性結合的雙特異性抗體所聚集和分布的那些器官，組織，或細胞。靶向所述疾病區(qū)的藥物以高濃度存在，使得藥物效應相比注射的量增加。因此，藥物組合物可以用于治療耐藥性腫瘤，并可以減少因非特異性藥物分布所致的副作用和不利的藥物反應。
[0067]藥物組合物可以通過將具有所需純度的雙特異性抗體與可藥用載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑混合來制備。所用的可藥用載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑都是在劑量和濃度方面對受體無毒的，可包括磷酸，檸檬酸，和其它有機酸；抗氧化劑(例如，抗壞血酸和甲硫氨酸)；抗菌劑(例如，十八烷基二甲基苯氯化銨，氯化六烴季銨，苯扎氯銨，酚，丁醇或苯甲醇，烷基尼泊金，鄰苯二酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇，或間甲酚)；低分子量(不到約IOkDa)多肽；蛋白，例如，血清白蛋白，明膠，或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如，聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸(例如，甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸)；單糖，二糖和其它碳水化合物(包括例如，葡萄糖，甘露糖，或葡聚糖)；螯合劑(例如，EDTA);糖(sugar)(例如，蔗糖，甘露醇，海藻糖，或山梨醇)；成鹽反離子；金屬復合物；和/或非離子型表面活性劑(例如，包括TWEENTM，PLURONICSTM，或聚乙二醇(PEG))。此外，根據(jù)配制方法，可以由本領域普通技術人員適當選擇常用的填充劑，稀釋劑，結合劑，增濕劑，崩解劑，和/或表面活性劑。
[0068]藥物組合物中包含雙特異性抗體的激活劑可以容納在微膠囊中，或容納在膠體性質的藥物運送系統(tǒng)(如脂質體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠囊)中，或者容納在大乳劑(macroemulsions)中，所述微膠囊可以通過諸如凝聚(coacervation)技術或界面聚合作用來制備，例子分別有羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚_(異丁烯酸甲酯)微膠囊。
`[0069]而且，雙特異性抗體可以配制為延遲釋放的(extended-release)片劑。所述延遲釋放的片劑可以是，例如，包含抗體的固體疏水聚合物的半透性基質。所述基質可以是膜或微膠囊形式，并且可以是聚酯，水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚乳酸(美國專利3，773，919)，L-谷氨酸和、乙基-L-谷氨酸的共聚物，非可降解的乙烯乙酸乙酯(ethylene-vinylacetate),乳酸-羥基乙酸的可降解型共聚物，例如，LUPRON DEP0TTM(—種可注射型微球，包括乳酸-羥基乙酸的共聚物，以及乙酸亮丙瑞林)，和/或聚-D-(-)-3-羥基丁酸。當被包裹的抗體蛋白長時間留在體內時，因暴露于37°C的潮濕環(huán)境，該抗體可能會變性或聚集，從而失去生物活性并引起免疫原性改變，因此可以考慮穩(wěn)定所述抗體的適當方法。例如，當凝聚劑是經由巰基-二硫鍵交換而在細胞間形成的S-S鍵時，抗體可以通過重新形成含巰基的片段、從酸性溶液凍干、控制濕度、用合適的添加劑和/或通過開發(fā)特異性聚合物基質來穩(wěn)定。
[0070]根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了預防和/或治療和施用治療有效量的藥物組合物以預防和/或治療疾病的方法，所述疾病可選自增生性疾病，瘤形成疾病，炎性疾病，自身免疫病，傳染病，病毒性疾病，過敏，移植物抗宿主病，和宿主抗移植物病。
[0071]藥物組合物可通過多種途徑注射至實體中，所述實體包括大鼠、小鼠、家養(yǎng)動物、和/或人類。所有注射方法都可以預期，例如，□服，直腸，靜脈，鼻，腹部，皮下，或局部注射都是有可能的。組合物可以用本領域已知的其它方法(例如，最新版的Remington’sPharmaceutical Science中介紹的方法)來注射。
[0072]“治療有效量”在本文中是指，根據(jù)合理的益損比來看，能治療疾病的足夠量。治療有效量可以因患者引起的多種原因而有不同，所述原因例如，疾病類型、嚴重程度、發(fā)作、實體的年齡、體重、排泄速度、反應易感性、健康狀態(tài)、和/或并發(fā)癥；和/或藥物活性、注射途徑、注射周期和注射次數(shù)、和/或藥物組合；也可以由本領域普通技術人員根據(jù)治療目的進行適當選擇。例如，注射量可以隨機分為多次，使得該量為約0.001-100mg/kg成人體重。
[0073]本發(fā)明另一方面中，提供了用于疾病的包含雙特異性抗體的診斷組合物，所述疾病可選自增生性疾病，瘤形成疾病，炎性疾病，自身免疫病，傳染病，病毒性疾病，過敏，移植物抗宿主病，和宿主抗移植物病
[0074]根據(jù)本發(fā)明一個方面，診斷組合物應用在生物樣品上，可以用于檢測疾病特有的抗原。術語“生物樣品”可以包括細胞，組織，全血，血漿，組織尸檢樣品(腦，皮膚，淋巴結，和脊柱)，細胞培養(yǎng)上清，和/或受損的真核細胞。就收集的生物樣品而言，可以體外應用所述組合物，或者可以將組合物注射到被研究的實體中而進行體內應用。
[0075]術語“檢測”在本文中是指，通過使診斷組合物中的雙特異性抗體與生物樣品反應來證實抗原-抗體組合 物的形成，其可以利用可檢測的標記和檢測方法來進行。檢測方法可以是比色法，電化學法，熒光測量法，發(fā)光法，顆粒計數(shù)法，目測評估或閃爍計數(shù)法?？蓹z測的標記可以是酶，熒光物質，發(fā)光物質，配體，納米顆粒，或放射性同位素。用作檢測標記的酶可包括乙酰膽堿酯酶，堿性磷酸酶，β -D-半乳糖苷酶，辣根過氧化物酶，和/或β -內酰胺酶。熒光物質可包括熒光素，Eu3+，Eu3+螯合物或穴合物(cryptate)。發(fā)光物質可包括吖啶酯和/或異魯米諾衍生物，配體可包括生物素衍生物，納米顆?？砂z體或金色乳膠，放射性同位素可包括57Co, 3H, 1251, 1251-Bonton,和/或Hunter樣品。根據(jù)本發(fā)明一個方面，對抗原-抗體復合物的檢測可以用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)進行。而且，當通過將診斷組合物注射至實體中來檢測抗原-抗體反應時，可檢測的標記可以通過結合或偶聯(lián)至雙特異性抗體而被注射。
[0076]本發(fā)明另一方面中，提供了包含上述雙特異性抗體的試劑盒。所述含上述組分的試劑盒可以是用于診斷、預防、和/或治療疾病的醫(yī)用試劑盒，所述疾病選自增生性疾病，瘤形成疾病，炎性疾病，自身免疫病，傳染病，病毒性疾病，過敏，移植物抗宿主病，和宿主抗移植物病。
[0077]利用根據(jù)本發(fā)明一個方面的蛋白復合物，能有效制備識別兩種抗原或相同抗原的兩種表位的雙特異性抗體。所述雙特異性抗體可以用于診斷、預防和/或治療疾病的目的，所述疾病諸如細胞增生性疾病或免疫性疾病。
[0078]圖1和2示意了根據(jù)本發(fā)明一個方面的雙特異性抗原結合蛋白復合物(包含抗原結合位點)和雙特異性抗體。
[0079]如圖1所不,第一標簽102和第二標簽202分別連接第一多肽100 (包括第一抗原結合位點101)和第二多肽200 (包括第二抗原結合位點201)，且第一標簽102和第二標簽202都連接至由多肽組成的接頭300的末端。第一標簽102和第二標簽202都能在體外或體內切割，因為它們由諸如泛素或泛素-樣蛋白之類的蛋白組成。不管是體外還是體內，所述第一多肽100 (包括第一抗原結合位點101)和所述第二多肽201 (包括第二抗原結合位點201)可以形成通過完全自發(fā)地結合而各具有不同抗原結合位點的雙特異性抗體。
[0080] 圖2示意了一例蛋白復合物，其包括兩個或多個根據(jù)圖1中一實施方案所示的多肽(含有抗原結合位點)，但不具有第二標簽202。如上述，所述蛋白復合物通過體外或體內切割形成包括不同抗原結合位點的雙特異性抗體，但由于圖2的蛋白復合物不具有第二標簽202，其變成所述接頭300與所述第二多肽200 (包括第二抗原結合位點201)結合的形式；但由于所述接頭300包含約2-50個氨基酸的短小氨基酸序列，使得它不影響所述第二多肽200 (包括第二抗原結合位點201)的功能。
[0081 ] 實施例1:制備抗-VEGF-EGFR雙特異性抗體表達載體
[0082]為了制備雙特異性抗體，使其包括針對血管內皮細胞生長因子(VEGF)和內皮細胞生長因子受體(EGFR)的特異性結合位點，請求GeneArt制得了該雙特異性抗體蛋白復合物的表達載體，用pO)NA3.lmyc/his A(Invitrogen)作為蛋白過表達的載體。
[0083]具體地，如圖3⑷和⑶所示，合成了:信號序列(ss,序列號I)、VEGF結合位點Vl或V2 (序列號2或3)、由包括絞鏈的Fe區(qū)(序列號4)組成的單域抗體、EGFR結合位點El或E2(序列號5或6)、由包括絞鏈的Fe區(qū)(序列號4)組成的單域抗體、至少一個泛素標簽(序列號7)、以及與蛋白復合物中由接頭(Gly-Gly或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) η肽)組成的氨基酸序列對應的單鏈DNA (總共37種蛋白復合物，對應于ss的長度，V1/V2和El/Ε2的長度、接頭的長度、多個泛素的長度，以及兩個含絞鏈的Fe區(qū)的長度的總和)。將DNA片段的核苷酸序列插入質粒中，以表達由SEQ ID Νο:45-81表示的蛋白復合物。所插入的DNA片段包括，在5’端可被EcoRI切割的核苷酸序列，以及在3’端可被Xhol切割的核苷酸序列，因此該DNA片段可插入pcDNA3.lmyc`/his A載體的EcoR1-Xhol限制性位點。
[0084]實施例2.表達和純化雙特異性VEGF-EGFR
[0085]按實施例1所述，得到攜帶DNA片段SEQ ID No:78的重組載體，利用脂質體將該載體轉染至HEK-293細胞系(人胚腎-293細胞，Korean Cell Line Bank)，由此表達并純化抗-VEGF-EGFR雙特異性抗體。
[0086]在500mL Erlenmeyer 燒瓶中，對 HEK-293 細胞接種 IOOmL Freestyle?293 培養(yǎng)基，濃度是IxlO6細胞/mL，用FreestyleTMMAX制備DNA-脂質體混合物。為制備DNA-脂質體復合物，使該混合物在室溫反應10分鐘，然后將復合物混合物添加至HEK-293細胞。將細胞在37°C、8%C02搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，來誘導蛋白表達。
[0087]表達所述雙特異性抗體的細胞的培養(yǎng)基用0.2 μ m濾膜過濾。用蛋白A親和柱(GEhealthcare)對細胞培養(yǎng)基進行層析。將該細胞培養(yǎng)基中包括的雙特異性抗體與蛋白A柱結合，用磷酸緩沖鹽水(PBS，pH7.4)洗柱，用洗脫劑(IOOmM甘氨酸-HC1，pH2.7)從蛋白A柱上將抗體洗脫。向洗脫劑中加入1/10體積的Tris緩沖液(1M Tris-HCl, pH9.0)，以中和該洗脫劑。用脫鹽柱將洗脫劑更換為緩沖液(30mM Tris-HCl，pH9.0)，然后加載至MonoS柱(GE healthcare)，進行離子交換層析。結果見圖4，雙特異性抗體被洗脫。
[0088]洗脫物中雙特異性抗體的存在通過SDS-PAGE來證實。所述雙特異性抗體用β -巰基乙醇處理，以確認形成雙特異性抗體的單體的分子量。結果見圖5，它證實，包括VEGF結合位點的單臂抗體和包括EGFR結合位點的單臂抗體都以單體形式被檢測到。
[0089]實施例3:驗證抗-VEGF-EGFR雙特異性抗體的抗原結合能力
[0090]為確認實施例2制得的雙特異性抗體的雙特異性抗原-抗體反應，用BiacoreTlOO儀(GE Healthcare Bio-Sciences AB)驗證對VEGF和EGFR 的抗體結合能力。將人VEGF (R&DSystems)以約2000RU(反應單位)的濃度通過氨基偶聯(lián)化學反應結合到CM5芯片上。將按照實施例2制得的雙特異性抗體以10 μl/分鐘的流速流動I分鐘。在證實偶聯(lián)后，將人EGFR胞外域(Prospec)以10 μ l/分鐘的流速流動I分鐘。在證實偶聯(lián)后，將甘氨酸-HCl (GEHealthcare)溶液(pH2.0)以10 μl/分鐘的流速流動I分鐘。
[0091]以上分析的結果是，證實所述雙特異性抗體具有同時結合人VEGF和人EGFR的能力(圖6)。
【權利要求】
1.雙特異性抗原結合蛋白復合物，包含: 第一多肽，其在N端包含第一抗原結合位點； 第二多肽，其在N端包含第二抗原結合位點；和 接頭，其連接所述第一多肽和所述第二多肽； 其中，所述接頭在至少一個末端包括標簽，所述標簽連接至所述第一多肽C端和所述第二多肽N端這兩者中的至少一個，且所述標簽包括可切割的氨基酸序列。
2.權利要求1的蛋白復合物， 其中，所述接頭在其一端包括第一標簽并在其另一端包括第二標簽，所述第一標簽連接至所述第一多肽的C端，所述第二標簽連接至所述第二多肽的N端，且所述第一標簽和所述第二標簽各包括可切割的氨基酸序列。
3.權利要求1或2的蛋白復合物，其中所述包含抗原結合位點的第一多肽和第二多肽中的至少一個是選自Fab片段、Fab’片段、Fv片段、和scFv片段的抗體重鏈或輕鏈或其片段，或單域抗體。
4.權利要求1或2的蛋白復合物，其中所述標簽選自泛素，泛素-樣蛋白，和TEV切割肽。
5.權利要求1或2的蛋白復合物，其中所述第一抗原結合位點和所述第二抗原結合位點各自獨立地包含與選自下組的靶抗原特異性結合的位點:EpCAM，CCR5,⑶19，HER_2neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (粘蛋白)，MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7，3hCG, Lewis-Y, C`D20，CD33，CD30,神經節(jié)苷脂⑶3，9_0_ 乙酰基-GD3, GM2, Globo H,巖藻糖基 GM1，poly SA，⑶2，碳酸酐水化酶 IX(MN/CA IX), CD44v6,音猬因子(Shh)1Wue-1,漿細胞抗原，(膜結合)IgE，黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)，CCR8，TNF-alpha前體，STEAP,間皮素，A33抗原，前列腺干細胞抗原(PSCA)，Ly-6,橋粒芯蛋白4，E-鈣粘著蛋白新表位，胎兒乙酰膽堿受體，⑶25，CA19-9標記物，CA-125標記物，繆氏抑制物質(MIS) II受體，sTn (唾液酸化Tn抗原；TAG-72)，F(xiàn)AP (成纖維細胞激活抗原)，內皮唾液酸蛋白，EGFRvI 11, LG, SAS,和 CD63。
6.權利要求1或2的蛋白復合物，其中所述接頭由約1-100個隨機氨基酸組成。
7.權利要求1或2的蛋白復合物，所述第一和第二多肽具有選自序列號8至序列號44的氨基酸序列。
8.多核苷酸，編碼權利要求1或2的蛋白復合物。
9.權利要求8的多核苷酸,其中所述多核苷酸具有選自序列號45至序列號81的堿基序列。
10.制備雙特異性抗體的方法，包括: 制備重組表達載體，其中插入了權利要求8的多核苷酸； 用所述重組表達載體轉化宿主細胞； 培養(yǎng)所轉化的宿主細胞；和 收集宿主細胞中表達的雙特異性抗體。
11.用于預防或治療疾病的藥物組合物，包含: 治療有效量的由權利要求10制得的雙特異性抗體；和可藥用載體，賦形劑，或穩(wěn)定劑，其中所述疾病選自增生性疾病、瘤形成疾病、炎性疾病、自身免疫病、傳染病、病毒性疾病、過敏性疾病、移植物抗宿主疾病、以及宿主抗移植物疾病。
12.權利要求11的藥物組合物，其中所述雙特異性抗體以與第二種激活劑結合的形式存在，并將所述第二種激活劑靶向疾病部位。
13.組合物，包含權利要求10所制得的雙特異性抗體，是用于診斷疾病的組合物，所述疾病選自增生性疾病、瘤形成疾病、炎性疾病、自身免疫病、傳染病、病毒性疾病、過敏性疾病、移植物抗宿主疾病、以及宿主抗移植物疾病。
14.權利要求13的組合物，其是用于體內注射的組合物，包含附著至所述雙特異性抗體的可檢測的標記。
【文檔編號】C07K19/00GK103788212SQ201310529748
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權日:2012年10月31日
【發(fā)明者】金罠京, 李政昱, 黃修晶, 李在日 申請人:三星電子株式會社