香蜂草苷和異櫻花素的制備方法及其在抗糖尿病藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了香蜂草苷和異櫻花素在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用和制備方法。香蜂草苷和異櫻花素是從風(fēng)輪菜(Clinopodium.chinense(Benth.)O.Kuntze)全草中分離得到。風(fēng)輪菜全草干燥粉碎、醇提取、減壓回收后得到濃縮的提取物，經(jīng)堿溶酸沉、乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯提取物，經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺、硅膠、凝膠柱層析和重結(jié)晶，得到香蜂草苷和異櫻花素。異櫻花素和香蜂草苷具有顯著地降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，降低血清總膽固醇含量，改善游離脂肪酸所致的血管內(nèi)皮細胞胰島素抵抗和高糖對血管內(nèi)皮細胞的損傷的作用。可用于制備預(yù)防和治療糖尿病、糖尿病引起的脂代謝紊亂、冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管面疾病以及糖尿病周圍血管病變。
【專利說明】香蜂草苷和異櫻花素的制備方法及其在抗糖尿病藥物中的應(yīng)用
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及黃酮類化合物香蜂草苷及其苷元異櫻花素的制備方法，并涉及香蜂草苷和異櫻花素在制備預(yù)防和治療糖尿病、糖尿病引起的脂代謝紊亂、冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病以及糖尿病周圍血管病變的藥物中的應(yīng)用。
二、【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一組代謝異常綜合征，以高血糖為特征，代謝紊亂為表現(xiàn)，與胰島素分泌密切相關(guān)。糖尿病可分為胰島素依賴型糖尿病(Insulin Dependent Diabetes Mellitus, IDDM又稱I型)和非膜島素依賴型糖尿病(Noinsulin Dependent Diabetes Mellitus, NIDDM 又稱 II 型)，后者約占患者總數(shù)的95% -99%。糖尿病目前已成為嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率急速增長，成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后第三位嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。據(jù)《2007年版中國2型糖尿病防治指南》的數(shù)據(jù)表明，2007年全球有2.33億糖尿病患者，預(yù)計到2025年全球?qū)⒂?.80億，增長72%，其中亞洲增長尤為迅速達91%。目前資料顯示，我國20歲以上成人糖尿病的患病率已達到9.7%，位居世界第一。
[0003]糖尿病病人致死、致殘率高的主要原因是糖尿病并發(fā)癥，包括急性和慢性并發(fā)癥兩種。其中慢性并發(fā)癥包括大血管病變(主要是動脈粥樣硬化)和微血管病變，嚴(yán)重影響糖尿病患者生命和生活質(zhì)量。其中心血管病變是糖尿病的主要死亡原因,約占糖尿病患者的80%。糖尿病的慢性高血糖、胰島素抵抗和血脂代謝異常通過影響內(nèi)皮細胞功能，最終導(dǎo)致血管損傷,使之易患動脈硬化和冠心病等心血管疾病。其中，內(nèi)皮細胞損傷或內(nèi)皮功能失調(diào)是糖尿病血管并發(fā)癥的始動因素。因此，保護內(nèi)皮細胞免受有害因素的損傷，維護其正常功能對預(yù)防糖尿病慢性血管并發(fā)癥具有重要的意義。
[0004]血管內(nèi)皮細胞在糖尿病血管并發(fā)癥的生理病理過程中行使著重要的調(diào)節(jié)功能。研究證明血管內(nèi)皮功能障礙是血管并發(fā)癥的重要發(fā)生因素。高血糖可通過多種途徑引起血管內(nèi)皮細胞凋亡，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。研究表明，長期的高血糖可能通過以下途徑引起血管內(nèi)皮細胞凋亡:(I)高糖引起的氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激；(2)線粒體依賴性和非依賴性凋亡；(3)MAPK介導(dǎo)的細胞凋亡；(4)p53介導(dǎo)的細胞凋亡；(5)高糖通過影響細胞周期進程導(dǎo)致細胞凋亡。高血糖環(huán)境誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡顯著增加，最終導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞受損。
[0005]血管內(nèi)皮細胞是胰島素的靶器官之一，胰島素介導(dǎo)的血管舒張主要是通過增加內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和釋放一氧化氮(NO)而起作用的。游離脂肪酸(FFA)通過抑制葡萄糖氧化、抑制肌糖原合成、促進糖異生、引起高胰島素血癥以及激活氧化應(yīng)激過程導(dǎo)致胰島素抵抗。循環(huán)血中游離脂肪酸升高后，內(nèi)皮細胞胰島素受體底物(IRS)-1酪氨酸磷酸化水平以及蛋白激酶B(Akt) (Ser473)磷酸化水平明顯降低，同時，血清NO水平降低，血管內(nèi)皮細胞中eNOSmRNA表達亦下降，eNOS活性降低。故認(rèn)為高FFA血癥通過抑制內(nèi)皮細胞eNOS磷酸化水平及基因表達使內(nèi)皮源性NO生成減少，從而導(dǎo)致代謝綜合征內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損，引起血管收縮痙攣、血小板被激活、白細胞附壁、平滑肌細胞增生和血管重塑等病理過程，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病以及糖尿病周圍血管病變。
[0006]目前，臨床使用的抗糖尿病藥物主要有胰島素、二甲雙胍、磺酰脲類、噻唑烷二酮類藥物、α-葡糖苷酶抑制劑等。這些藥物具有良好的療效，但仍存在一些局限性。中藥治療糖尿病已經(jīng)有了幾千年的經(jīng)驗積累，且有著自己獨特的優(yōu)勢:采用中藥治療糖尿病不僅僅是降低血糖，重在調(diào)理人體全面機能，整體恢復(fù)血管彈性，增加心、肝、腎、視網(wǎng)膜等組織營養(yǎng)性血流量，特別是中藥能夠克服化學(xué)合成藥在降血糖的同時產(chǎn)生的副作用或誘發(fā)加重并發(fā)癥的事實。因此，開發(fā)中藥及天然藥物作為預(yù)防和治療糖尿病的藥物具有廣闊的發(fā)展前景。
[0007]近年來眾多中外學(xué)者從天然藥物中提取、分離出多種具有降低血糖作用的化合物，主要有黃酮類、多糖、皂苷、生物堿等，其中關(guān)于黃酮類化合物抗糖尿病的研究受到了極大的關(guān)注。黃酮類化合物抗糖尿病機制主要表現(xiàn)在以下幾個方面:(I)保護胰島β細胞免受損傷并促進胰島β細胞再生，研究表明，黃酮類成分可通過抗氧化作用或抗炎作用保護胰島β細胞免受損傷，促進破壞的胰島β細胞再生而促進胰島素的分泌；(2)類胰島素作用；(3) α -葡萄糖苷酶抑制劑；(4)改善胰島素抵抗，有些黃酮類物質(zhì)可通過抗炎，抗氧化，調(diào)節(jié)脂肪因子，促進外周靶細胞、靶器官對葡萄糖的利用改善胰島素抵抗。風(fēng)輪菜為唇形科風(fēng)輪菜屬植物風(fēng)輪菜(Clinopodium.chinense (Benth.) 0.Kuntze)的全草。風(fēng)輪菜微苦、澀，涼，歸肝經(jīng)。傳統(tǒng)藥學(xué)用于治療子宮肌瘤出血、牙眼出血、尿血、創(chuàng)傷出血、感冒、中暑、急性膽囊炎、肝炎、腸炎、痢疾、乳腺炎、疔瘡腫毒、過敏性皮炎等癥狀，在民間，風(fēng)輪菜廣泛用于治療糖尿病。風(fēng)輪菜含有黃酮類、有機酸類、芳香族類、三萜及其皂苷類、留體類等多種類型的化學(xué)成分，其中黃酮類和三萜皂苷類成分為該屬植物的主要活性成分。香蜂草苷是風(fēng)輪菜黃酮的主要成分之一，屬于二氫黃酮苷類?，F(xiàn)代藥理研究表明，香蜂草苷具有抗氧化，引起神經(jīng)腫瘤細胞凋亡的作用，也可用于出血癥的防治。但是，尚未有香蜂草苷和異櫻花素(香蜂草苷的苷元)在降血糖、降血脂、改善游離脂肪酸所致的血管內(nèi)皮細胞胰島素抵抗和高糖所致的血管內(nèi)皮細胞損傷的報道。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明包括了兩部分內(nèi)容，第一部分:異櫻花素和香蜂草苷的制備方法；第二部分:異櫻花素和香蜂草苷在降血糖、降血脂、改善血管內(nèi)皮細胞胰島素抵抗和保護高糖對血管內(nèi)皮細胞損傷的作用，及其在防治糖尿病、糖尿病引起的脂代謝紊亂、冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管方面疾病以及糖尿病周圍血管病變的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明之所以用堿溶酸沉，乙酸乙酯萃取，再用大孔吸附樹脂的方法富集香蜂草苷，是因為傳統(tǒng)的乙酸乙酯萃取富集香蜂草苷的效果不理想，總浸膏直接用大孔樹脂富集，柱填料用量太大，大大延長了生產(chǎn)時間。之后用聚酰胺柱層析分離得到香蜂草苷，是因為硅膠和凝膠S^hadex LH-20的分離效果不明顯，且香蜂草苷屬于二氫黃酮類，聚酰胺對它的死吸附量少，目標(biāo)產(chǎn)物損失少。整個發(fā)明中，所用到的柱填料都可再生利用，而且再生方法簡單，所用到的洗脫劑為乙醇水溶液，低成本，回收率高。此方法可適用于工業(yè)生產(chǎn)。
[0010]香蜂草苷和異櫻花素的制備方法如下:
[0011](I)將風(fēng)輪菜全草干燥粉碎；用8_10倍量80%乙醇回流提取，或浸潰提取，提取液減壓濃縮；
[0012](2)將濃縮的提取物用I % NaOH水溶液溶解，后用5% HCl調(diào)pH為5，再用乙酸乙酯萃取8-10次，得到乙酸乙酯浸膏。
[0013](3)乙酸乙酯提取物進行大孔樹脂柱層析，先用30%乙醇除去部分雜質(zhì)，再用50%乙醇和95%乙醇洗脫。收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥得到香蜂草苷粗品。
[0014](4)香蜂草苷粗品進行聚酰胺柱層析，收集15%乙醇洗脫液，減壓濃縮，重結(jié)晶得香蜂草苷。
[0015](5)將步驟(3)中的95%的乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯(5:1)洗脫，濃縮，干燥得到異櫻花素粗品。
[0016](6)異櫻花素粗品進行凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(I:1)為洗脫劑，收集洗脫液，減壓濃縮，重結(jié)晶得異櫻花素。
[0017](7)步驟(3)中大孔樹脂可選用CAD-40和DlOl中任意一種，洗脫劑也可用60%乙醇水。
[0018](8)步驟(5)中也可用石油醚:丙酮(10:1)洗脫。
[0019]香蜂草苷，白色粉末(氯仿-甲醇)，C28H34O14, mp209~210 °C,溶于氯仿-甲醇、甲醇、DMSO。Molish反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)均呈陽性，提示該化合物為黃酮苷類化合物。1HNMR (500MHz, DMS0_d6，TMS) δ:12.00(1Η, s，5-0Η)，7.46 (2Η，d, J = 8.7Ηζ, Η_2，，6’)，6.98 (2Η, d, J = 8.7Ηζ, Η_3，，5，)，6.13 (2Η, d, J = 1.1Hz, Η_6，8)，5.58 (1Η, dd, J =2.8Ηζ，12.5Ηζ，Η-2)，2.79(lH，dd，J = 3.0Hz, 17.0Hz，H_3a)，4.97(lH，d，J = 7.5Hz，G_l)，
4.52 (1Η, s，Rha-1)，3.77 (3H, s，4’ -OMe)，1.09 (3H, d, J = 6.2Hz, Rha-Me)，3.10 ~4，98 為糖區(qū)質(zhì)子信號，H-3e信號(3.10左右)淹沒在糖區(qū)質(zhì)子信號中。以上數(shù)據(jù)與文獻報道的香蜂草苷理化性質(zhì)與光譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定為香蜂草苷(Didymin)。其結(jié)構(gòu)如下圖所示:
【權(quán)利要求】
1.香蜂草苷和異櫻花素在制備預(yù)防和治療糖尿病、糖尿病引起的脂代謝紊亂、冠心病、動脈粥樣硬化等心腦血管疾病以及糖尿病周圍血管病變的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用中香蜂草苷和異櫻花素通過降低血糖、降血脂，改善游離脂肪酸所致的胰島素抵抗和高糖所致的血管內(nèi)皮細胞損傷來發(fā)揮作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于其中的香蜂草苷和異櫻花素的制備方法是: (1)將風(fēng)輪菜全草干燥粉碎；用8-10倍量80%乙醇回流提取，或浸潰提取，提取液減壓濃縮； (2)將濃縮的提取物用I% NaOH溶解，后用5% HCl調(diào)pH為5，再用乙酸乙酯萃取8-10次，得到乙酸乙酯浸膏； (3)乙酸乙酯提取物進行大孔樹脂柱層析，先用30%乙醇除去部分雜質(zhì)，再用50%、95%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮，干燥得到香蜂草苷粗品； (4)香蜂草苷粗品進行聚酰胺柱層析，收集15%乙醇洗脫液，減壓濃縮，重結(jié)晶得香蜂草苷; (5)將步驟(3)中的95%的乙醇洗脫液減壓濃縮，干燥，進行硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯(5:1)洗脫，濃縮，干燥得到異櫻花素粗品； (6)異櫻花素粗品進行凝膠柱層析，二氯甲烷-甲醇(I:1)為洗脫劑，收集洗脫液，減壓濃縮，重結(jié)晶得異櫻花素； (7)步驟(3)中大孔樹脂可選用CAD-40和DlOl中任意一種，洗脫劑也可用60%乙醇水； (8)步驟(5)中也可用石油醚:丙酮(10:1)洗脫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述香蜂草苷、異櫻花素與一種或多種輔助劑和/或賦形劑混合制成藥學(xué)上可以接受的劑型。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于劑型為針劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、糖衣丸劑或溶液劑。
【文檔編號】C07D311/40GK103536615SQ201310548167
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】吳斐華, 梁敬鈺, 曾彪, 薛世姣, 任蓓 申請人:中國藥科大學(xué)