棉花GhMATE1基因及其在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改良棉花纖維色澤基因技術(shù)，尤其涉及一種棉花基因及其構(gòu)建的植物表達雙元載體并在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用。棉花GhMATE1基因，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID：NO.1所示。一種由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ?ID：NO.2所示。本發(fā)明在前期克隆棉花GhTT12a基因（中國發(fā)明專利申請?zhí)枺?01310380270.5，申請日：2013-8-27）基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析及電子克隆的方法，克隆了一個新的含有MATE保守結(jié)構(gòu)域的基因，但基因結(jié)構(gòu)、剪切方式與GhTT12a基因完全不同，該基因與擬南芥種皮棕色素合成TT12基因核苷酸序列存在78%的序列同源性。
【專利說明】棉花GhMATEI基因及其在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及ー種改良棉花纖維色澤基因技木，尤其涉及ー種棉花基因及其構(gòu)建的植物表達雙元載體并在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]天然彩色棉是ー種棉纖維具有自然色彩的特殊類型棉花，因其具有獨特的自然色彩，在紡織及加工過程中無需漂染，對人類和環(huán)境無污染、穿著舒適，特別適合制作貼身衣物，是真正的“生態(tài)”、“環(huán)?！泵?，從而引起國內(nèi)外棉花育種家和紡織、服裝エ業(yè)界的廣泛關(guān)注，被譽為21世紀(jì)國際市場最具潛力的生態(tài)紡織品。中國彩色棉的研究與開發(fā)雖起步較遲，但發(fā)展很快。從1998年到2010年，中國天然彩色棉種植面積從每年I萬畝擴大到毎年20多萬畝，皮棉產(chǎn)量從每年800噸增加到每年2萬多噸，10年間，彩棉種植面積和皮棉產(chǎn)量分別增長了 20倍和25倍。
[0003]彩色棉主要有棕色和綠色兩大系列色彩，在彩色棉新品種選育方面，借助于常規(guī)育種技術(shù)，世界各國和我國一些育種單位紛紛開展研究并選育出ー批彩色棉新品種，在一定程度上改善了彩色棉的品質(zhì)和性狀。國內(nèi)各研究單位選育出的彩色棉品種有:新彩棉系列品種(I號至20號)、中棉所51、浙彩棉2號、蘇彩雜I號等品種。在這些選育的品種中，主要是棕色棉系列品種在紡織、服裝エ業(yè)上得到了一定程度的應(yīng)用。與白棉花相比，彩色棉品種依然存在著以下突出問題:纖維比強度不高，纖維長度偏短、衣分偏低，色素穩(wěn)定性差，色彩単一，從而限制了棕色棉在紡織エ業(yè)中的應(yīng)用。因此，創(chuàng)新彩色棉的纖維色澤并提高棕色棉的纖維強度、纖維長度是關(guān)系到我國紡織エ業(yè)和彩色棉產(chǎn)業(yè)發(fā)展興衰成敗的兩個關(guān)鍵因素，也是廣大棉花育種科研工作者面臨的ー個重要課題。
[0004]在自然界 中，植物色素可分為光合色素(如葉綠素)和非光合色素(如類黃酮和類胡蘿卜素)。研究表明，天然彩色棉纖維色素屬于非光合色素，并且與棉纖維發(fā)育的特定時期有夫。國內(nèi)外學(xué)者通過對棕色棉纖維色素形成過程及生化特征本質(zhì)的研究，初歩認為存在以下2種推測:(1) Ryser、Xiao和詹等推測認為天然棕色棉纖維色素最初來源是位于液泡里的兒茶素衍化形成的原花色素(Proanthocyanidins),也稱為縮合單寧(CondensedTannins)，并由縮合單寧接觸空氣氧化而形成具有棕色的醌類化合物；(2)趙等認為棕色棉纖維色素屬于類黃酮化合物。而且，Xiao和詹的實驗都證實棕色棉纖維色素的前體物質(zhì)屬于原花色素(縮合單寧)。詹等對棕色棉、白棉纖維和種皮中分布的色素含量進行了分析，研究認為:決定纖維顏色的主要原因是色素在纖維和種皮之間的分配比例。棉纖維是由種皮細胞分化而來，棉纖維的形成過程與種皮細胞的發(fā)育關(guān)系密切。擬南芥、棉花同屬于雙子葉植物，了解擬南芥種皮色素的合成代謝及調(diào)控途徑對于掲示棉花種皮棕色素、棉纖維棕色素發(fā)育、纖維與色素的共沉積分子機理具有重要理論意義。
[0005]擬南芥種皮色素的合成代謝途徑受到多種基因的調(diào)控，屬于植物次生代謝。通過對擬南芥種皮Transparent testa系列突變體的研究表明:苯丙氨酸(Phenylpropanoid)是形成縮合單寧的最初氨基酸，它在一系列酶的催化作用下，最終形成無色的縮合單寧，再經(jīng)空氣氧化而呈現(xiàn)出種皮的棕色特征。其中，TT4編碼查爾酮合酶(CHS，chalconesynthase), TT5編碼查爾酮異構(gòu)酶(CHI, chalcone isomerase)等作為結(jié)構(gòu)基因編碼類黃酮代謝途徑中的酶，TTl，TT2，TTGl，TTG2，TT8等作為轉(zhuǎn)錄因子對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控，TT12和TT19則編碼色素轉(zhuǎn)運蛋白參與類黃酮物質(zhì)的轉(zhuǎn)運與積累。在棕色棉纖維色素發(fā)育的相關(guān)研究中，國內(nèi)外學(xué)者采用不同的分子生物學(xué)手段，從棉花中克隆了多個與擬南芥種皮色素合成代謝途徑相關(guān)的同源基因，如GhCHS，GhCHI, GhF3H, GhDFR, GhANS, GhANR等，這些基因參與色素合成的蛋白質(zhì)功能推測均基于同源序列分析及生物信息學(xué)的功能推測，究竟是否同時參與棉花種皮色素、纖維的色素合成代謝有待進一步證實。針對棉花棕色素研究中存在的上述重要理論課題，迫切需要以擬南芥種皮棕色素合成途徑相關(guān)基因為參照，在棉花中克隆相關(guān)同源基因，并通過分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)加以功能驗證，以明確這些相關(guān)基因是否同時參與棉花纖維棕色素的合成。上述問題的研究證實，將為我們進一步開展棕色棉纖維色素合成代謝途徑的研究提供理論支持，并通過分子生物學(xué)手段改良棕色棉纖維品質(zhì)、突破棉纖維色澤多樣性研究具有重要的理論和實踐意義。
[0006]近年來,隨著基因克隆技術(shù)的快速進展,在差異顯示(differential display)技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)展了引物退火控制技術(shù)(Annealing Control Primer, ACP),也稱為GeneFish ing技術(shù)。本發(fā)明利用Gene Fishing技術(shù),在陸地棉棕色纖維浙彩棉2號和白色纖維棉浙棉11號纖維發(fā)育的特定階段，篩選參與棉纖維棕色素代謝的特異表達基因，從而克隆了 GhTT12a基因，依據(jù)于生物信息學(xué)分析，初步明確了 GhTT12a基因與其它物種TT12基因的同源性和進化性關(guān)系。同進，利用熒光定量PCR方法分析了 GaTT12a基因在亞洲棉纖維及種皮發(fā)育中的表達特征，為進一步研究該基因在棉纖維棕色素代謝中參與的生物學(xué)功能奠定了一定研究基礎(chǔ)。
[0007]在植物基 因功能研究中，轉(zhuǎn)基因功能互補和基因沉默是揭示基因功能的有效技術(shù)手段。功能互補通過構(gòu)建目的基因的正義表達載體轉(zhuǎn)化該基因缺失突變體，從而驗證該基因在植物體內(nèi)執(zhí)行的功能。對于同源基因功能的驗證，也可以采用轉(zhuǎn)化近似物種的突變體，從而快速完成同源基因的功能驗證。對于棉花轉(zhuǎn)基因周期較長、單一性狀突變體庫缺乏，采用轉(zhuǎn)化擬南芥突變體進行同源基因或相似基因結(jié)構(gòu)域的功能驗證是一種比較快捷的方法?；虺聊巧矬w的一種古老機制，它在生長和發(fā)育過程中通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發(fā)揮作用。近年來，該技術(shù)作為一個重要的遺傳操作工具在植物分子生物學(xué)研究和遺傳改良方面得到廣泛應(yīng)用，多種植物基因沉默技術(shù)相繼建立，包括反義RNA、dsRNAi (雙鏈RNA干涉)和人工microRNA，特別是dsRNAi和microRNA在基因沉默的精確性和高效性等方面有了新突破。dsRNAi和microRNA在降解目標(biāo)基因mRNA的效率上比反義RNA技術(shù)更高，能在低于反義RNA幾個數(shù)量級的濃度下使目標(biāo)基因表達降到極低的水平甚至功能完全喪失；而且，在轉(zhuǎn)基因過程中，不存在插入位點隨機性的問題，理論上任何基因都可被針對性的dsRNAi或m icroRNA特異性沉默。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克隆并了解棉花纖維棕色素合成相關(guān)基因并進而對棕色棉纖維品質(zhì)進行改良，利用生物技術(shù)等手段實現(xiàn)棉花纖維色澤多樣化，本發(fā)明的第一個目的是提供棉花GhMATEl基因和由該基因編碼的蛋白質(zhì)，并通過實驗證明該基因既參與種皮棕色素的形成，又參與纖維棕色素的形成，有望在棕色棉育種上得以應(yīng)用。本發(fā)明的第二個目的是提供含有上述的基因的表達載體和宿主細胞。本發(fā)明的第三個目的是提供上述的基因在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用。
[0009]為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
[0010]棉花GhMATEl基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示。
[0011]—種由上述的基因編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氣基酸序列如SEQ ID:N0.2所不。
[0012]為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:[0013]棉花GhMATEl基因的植物正義互補雙元表達載體，該表達載體以植物表達雙元載體PFGC5941為骨架載體，選取含有GhMATEl基因完整蛋白質(zhì)編碼框的一段序列作為該基因的正義表達結(jié)構(gòu)，并分別引入BamHI和XhoI酶切位點，從而構(gòu)建了含有GhMATEl基因的正義表達載體。
[0014]ー種宿主細胞，該宿主細胞采用所述的棉花GhMATEl基因的植物正義互補雙元表達載體轉(zhuǎn)化。作為優(yōu)選，所述的轉(zhuǎn)化用的菌株采用農(nóng)桿菌EHA105。進ー步，所述的宿主細胞采用滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥突變體ttl2。
[0015]棉花GhMATEl基因的雙鏈RNA干涉表達載體，該表達載體以植物表達雙元載體pCAMBia2301為骨架載體，選取植物表達雙元載體pBI121的表達核結(jié)構(gòu)，酶切、連接構(gòu)建成載體PCAMBIA2301-121，再以SEQ ID:N0.1所示的棉花基因組中一段序列作為構(gòu)建雙元干涉載體的中間Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)的序列SEQ ID:N0.3所示，引物為上游引物:AGAAGCGAGATGAGGGATGT，下游引物:CATTT TCATGCGAAGGATTC。
[0016]ー種宿主細胞，該宿主細胞采用所述的棉花GhMATEl基因的雙鏈RNA干涉表達載體轉(zhuǎn)化。
[0017]為了實現(xiàn)上述的第三個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
[0018]核苷酸序列如SEQ ID:N0.1所示的基因在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明在前期克隆棉花GhTT12a基因(中國發(fā)明專利申請?zhí)?2013103802705，申請日:2013-8-27)基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析及電子克隆的方法，克隆了一個新的含有MATE保守結(jié)構(gòu)域的基因，但基因結(jié)構(gòu)、剪切方式與GhTT12a基因完全不同，該基因與擬南芥種皮棕色素合成TT12基因核苷酸序列存在78%的序列同源性。隨后利用RT-PCR的方法克隆了該基因，命名為GhMATEl，該基因編碼497個氨基酸殘基，分子量約53.6KD，屬于MATE超基因家族中的ー個成員。利用熒光定量PCR分析了 GhMATEl基因在發(fā)育不同階段纖維、種皮的表達特征，結(jié)果表明=GhMATEl基因在二倍體棉和四倍體棉的棕色纖維、白色棉種皮和棕色棉種皮中均優(yōu)勢表達，在白色棉纖維中幾乎不表達，說明該基因既參與種皮棕色素的形成，又參與纖維棕色素的形成。針對棉花GhMATEl基因的功能分析，構(gòu)建植物正義雙元表達載體啟動子35S::GhTT12a::Nos終止子表達核結(jié)構(gòu)互補擬南芥突變體ttl2，分子鑒定及轉(zhuǎn)基因生理學(xué)分析均表明該基因能使擬南芥突變體ttl2恢復(fù)野生型表型，從而證明該基因參與種皮棕色素的合成；根據(jù)該基因的分子結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域特征，構(gòu)建2種不同類型的雙鏈RNA干涉載體(dsRNAi，載體序列見附件)，通過損傷的花粉管通道法轉(zhuǎn)化棕色棉花，對棕色棉30個轉(zhuǎn)基因株系Ttl代及T1代的分子鑒定及轉(zhuǎn)基因棉花生理學(xué)指標(biāo)分析均表明該基因均能不同程度降低棉花棕色纖維的色澤，從而證明該基因參與棉花纖維棕色素的代謝。在研究過程中，利用GhTT12a基因并通過生物技術(shù)方法獲得不同深淺程度的棕色纖維棉種質(zhì)資源10份，創(chuàng)新的這些種質(zhì)材料有望在棕色棉纖維品質(zhì)改良上得以應(yīng)用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0020]圖1為棉花GhMATEl基因的內(nèi)含子和外顯子示意圖。
[0021]圖2為棉花GhMATEl基因與其他物種TT12同源基因的氨基酸序列比較圖。
[0022]圖3為棉花GhMATEl基因的核苷酸序列系統(tǒng)進化分析圖。
[0023]圖4為GhMATEl基因在二倍體、四倍體棕色、白色棉纖維不同發(fā)育時期的表達水平圖。
[0024]圖5為含有GhMATEl基因植物正義表達載體的構(gòu)建圖。
[0025]圖6、圖7為含有GhMATEl基因2個不同結(jié)構(gòu)雙元干涉載體的構(gòu)建流程圖。
[0026]圖8為棉花GhMATEl基因轉(zhuǎn)擬南芥ttl2突變體所獲得的陽性株的PCR擴增鑒定圖；M:DNA marker DL2000, 1:含有棉花 GhMATEl 基因的陽性質(zhì)粒 pFGC5941_GhMATEl ;2、3、
4、5、6:噴灑Basta具有抗性的擬南芥單株；7:野生型擬南芥植株。
[0027]圖9為轉(zhuǎn)棉花GhMATEl基因在互補擬南芥ttl2突變體陽性株根、莖、葉、角果和花中的表達水平圖。
[0028]圖10為轉(zhuǎn)棉花GhMATEl基因在互補擬南芥ttl2突變體陽性株中的含量圖。
[0029]圖11為棉花GhMA TEl基因干涉載體中部分片段在轉(zhuǎn)深棕色纖維棉中的PCR擴增鑒定圖；M:DNA marker DL2000, 1:含有棉花GhMATEl基因干涉載體的陽性質(zhì)粒PFGC5941-GhMATElRA ;2、3、4、5、6、7:噴灑千分之四卡鈉霉素具有抗性的轉(zhuǎn)基因棉單株；8:野生型棉T586單株。圖12為棉花GhMATEl干涉深棕色棉纖維的應(yīng)用圖；ZM11:未轉(zhuǎn)基因白色棉浙棉11 ；T586:深棕色棉T586品系(轉(zhuǎn)基因親本株);TO-1:深棕色棉干涉株I ;T0_2:深棕色棉干涉株2 ;T0-3:深棕色棉干涉株3 ；T0-4:深棕色棉干涉株4 ；T0-5:深棕色棉干涉株5 ;T0-6:深棕色棉干渉株6。
【具體實施方式】
[0030]1.材料與方法
[0031]1.1植物材料和生長條件
[0032]陸地棉棕色纖維浙彩棉2號、白色纖維棉花浙棉11、二倍體棕色纖維棉慈溪紫棉和白色纖維棉余姚中棉均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所經(jīng)濟作物研究室提供并于2011年5月初直播播種于本院杭州院本部實驗田。在棉花開花后的第9d (開花后，DPA，Day Post Anthesis)、12d、15d、18d、21d和24d，分別選取正在發(fā)育的棉纖維組織和種皮組織開展相關(guān)研究。
[0033]1.2實驗方法
[0034]1.2.1棉花基因組DNA和棉纖維、種皮組織總RNA的提取
[0035]棉花基因組DNA提取采用CTAB法(Li et al.，2001)。采用多酚、多糖類植物RNA提取試劑盒提供的方法提取棉花纖維組織、種皮組織總RNA，試劑盒購自北京百泰克Bioteck生物技術(shù)有限公司。
[0036]1.2.2利用生物信息學(xué)分析篩選并克隆棉花GhMATEl基因
[0037]根據(jù)已經(jīng)克隆的棉花棕色纖維色素GhTT12a基因和擬南芥種皮棕色素AtTT12基因的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域序列，搜索棉花ESTs數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/),共選出 3 條序列(GenBank 登錄號為 DT563323.1，DT568479.1，ES823453.1)。再以這3條EST序列搜索ESTs數(shù)據(jù)庫并拼接，最終獲得一條序列，該序列含有一個完整開放閱讀框(ORF, Opening Reading Frame ),根據(jù)該序列ORF預(yù)測的蛋白質(zhì)與擬南芥TT12蛋白存在約82%的同源性。依據(jù)與ORF的序列特征，設(shè)計I對PCR擴增的特異引物(P1:TGTAAAGCATGGGTTCAGAGG 和 P2:ACATCTCAAGTGCCATCTACCT)。[0038]分別以浙彩棉2號發(fā)育MDPA的棉纖維組織總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板，結(jié)合PCR技術(shù)，擴增條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，56°C退火30s，68°C延伸2min ;30個PCR循環(huán)，最后68°C延伸lOmin，15°C保溫。擴增體系為50ul:2X KOD擴增反應(yīng)液，IOul dNTP，2ul Pl引物，2ul P2引物，Iul KOD FX，5ul轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物，5ul超純水；再將PCR產(chǎn)物加A，加A反應(yīng)體系為IOul:5ul連接緩沖液，Iul pTA2載體，Iul連接酶，Iul加A連接液，2ul KOD擴增產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TG1，篩選陽性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。采用MBI公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，利用KOD FX酶擴增獲得推測的GhMATEl基因(Τ0Υ0Β0，上海，東洋紡生物科技有限公司)。本實驗所涉及到的引物均合成自上海生工生物技術(shù)工程服務(wù)有限公司。[0039]1.2.3引物設(shè)計和生物信息學(xué)分析[0040]研究中涉及到的引物設(shè)計利用Primer Premier5.0[0041](http: //www.premierbiosoft.com/index, html)完成，利用 DNAman6.0 軟件[0042](http://www.lynnon.com)對氨基酸序列進行同源性比較和核酸系統(tǒng)進化樹分析，蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域的推測采用Genbank數(shù)據(jù)庫中的Blast在線分析系統(tǒng)[0043](http://blast.ncb1.nlm.nih.gov),具體的結(jié)構(gòu)域位置分析利用SMART在線軟件分析[0044](http://smart.embl~heidelberg.de)。[0045]1.2.4棉花GhMATEl基因的結(jié)構(gòu)特征分析[0046]連接后的陽性克隆經(jīng)測序后，分4段設(shè)計引物，擴增其對應(yīng)的基因組DNA片段，經(jīng)加A，切膠回收，克隆至pTA2載體，經(jīng)測序拼接獲得該基因的DNA序列。實驗中所用的酶和載體同上。[0047]1.2.5利用熒光定量PCR分析二倍體棉和四倍棉中GhMATEl基因的表達特征[0048]根據(jù)棉花不同發(fā)育時期的纖維組織、種皮組織的cDNA，用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測GhTT12a基因在發(fā)育不同階段纖維、種皮組織中的相對表達水平。棉花GBQ7基因用作熒光定量PCR的內(nèi)參基因(擴增引物)(Tu et al.，2007)，GhTT12a基因的特異性擴增引物見表2。實驗操作均參考試劑盒說明書(Τ0Υ0Β0 SYBR Green Supermixture，上海，東洋紡生物科技有限公司)，熒光定量PCR的溫度循環(huán):50°C，Imin ;94°C預(yù)變性3min ;94°C變性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸45s ;共計30個PCR循環(huán)。[0049]表2熒光定量PCR中所用的引物及序列[0050]
【權(quán)利要求】
1.棉花GhMATEl基因，其特征在于:該基因的核苷酸序列如SEQID:N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述的基因的植物正義互補雙元表達載體，其特征在于:該表達載體以植物表達雙元載體PFGC5941為骨架載體，選取含有GhMATEl基因完整蛋白質(zhì)編碼框的一段序列作為該基因的正義表達結(jié)構(gòu)，并分別引入BamHI和XhoI酶切位點，從而構(gòu)建了含有GhMATEl基因的正義表達載體。
3.一種宿主細胞，其特征在于:該宿主細胞采用權(quán)利要求2所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種宿主細胞，其特征在于:轉(zhuǎn)化用的菌株采用農(nóng)桿菌EHA105。
5.權(quán)利要求1所述的基因的雙鏈RNA干涉表達載體，其特征在于:該表達載體以植物表達雙元載體pCAMBia2301為骨架載體，選取植物表達雙元載體pBI121的表達核結(jié)構(gòu)，酶切、連接構(gòu)建成載體PCAMBIA2301-121，再以SEQ ID:N0.1所示的棉花基因組中一段序列作為構(gòu)建雙元干涉載體的中間Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)，Loop環(huán)狀結(jié)構(gòu)的序列SEQ ID:N0.3所示，引物為上游引物:AGAAGCGAGATGAGGGATGT，下游引物:CAITT TCATGCGAAGGATTC。
6.一種宿主細胞，其特征在于:該宿主細胞采用權(quán)利要求5所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
7.—種蛋白質(zhì)，其特征在于該蛋白質(zhì)的氣基酸序列如SEQ ID:N0.2所不。
8.權(quán)利要求1所 述的基因在改良棉花棕色纖維色澤中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/415GK103602687SQ201310557520
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】李付振, 祝水金, 邱新棉, 吳學(xué)龍, 王美興 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江大學(xué)