一種一體化制備番紅花酸、京尼平及梔子藍(lán)等產(chǎn)品的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)及天然產(chǎn)物綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種以梔子為原料，經(jīng)粉碎醇提濃縮，不經(jīng)過樹脂、硅膠等復(fù)雜分離手段，直接通過簡單的化學(xué)修飾和生物催化技術(shù)，通過一套生產(chǎn)工藝，一體化制備番紅花酸、京尼平及梔子藍(lán)等多種高技術(shù)附加值產(chǎn)品的方法。所制備的番紅花酸和京尼平純度均可達(dá)到95%以上，梔子藍(lán)色素色價E590>110。
【專利說明】一種一體化制備番紅花酸、京尼平及梔子藍(lán)等產(chǎn)品的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)及天然產(chǎn)物綜合利用領(lǐng)域，具體涉及一種以桅子為原料一體化制備番紅花酸、京尼平及桅子藍(lán)等多種高技術(shù)附加值產(chǎn)品的方法。該方法設(shè)備要求低，操作簡便，不需要經(jīng)過樹脂、硅膠等復(fù)雜分離手段，即可在一套生產(chǎn)工藝流程中，同時生產(chǎn)多種深加工產(chǎn)品。
【背景技術(shù)】
[0002]桅子(Gardenia jasminoides Ellis),又名山桅子、黃桅子、紅桅子、白蝶等,是菌草科桅子屬的一種常綠灌木。桅子性苦寒、無毒，常用來清熱瀉火、解玉支毒、清胃脘血等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桅子具有解熱鎮(zhèn)靜、保肝利膽等功效，臨床上用于治療急性黃疸性肝炎、止痛、扭挫傷、冠心病等。
[0003]桅子的化學(xué)成分較為復(fù)雜，達(dá)100多種。到目前為止，已從桅子屬植物中分離鑒定的化合物有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、有機(jī)酸酯類、長鏈烷烴類等。目前對桅子的利用主要是從桅子果中提取桅子黃色素和桅子苷，以及基于這兩種原料的深加工產(chǎn)品，如番紅花酸、京尼平和桅子藍(lán)色素等。
[0004]番紅花酸是番紅花素水解后的產(chǎn)物，是番紅花的有效成分之一，具有保護(hù)肝臟，抑制腫瘤，抗氧化等多種藥理功能。但藏紅花只是柱頭入藥，產(chǎn)量極低，又因?yàn)槠滟Y源極其有限，在中國很難大面積栽培，致使其價格昂貴被譽(yù)為“植物黃金”，具有極高的醫(yī)療價值。桅子中大量存在桅子黃色素為一系列類胡蘿卜素衍生物，在結(jié)構(gòu)上與番紅花酸及其相似，因此人們嘗試采用桅子為原料制備番紅花酸來彌補(bǔ)市場的需求。
[0005]京尼平(Genipin)是桅子苷經(jīng)β -葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，是一種優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑，可以與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料，如人造骨骼、傷口包扎材料等，其毒性遠(yuǎn)低于戊二醛和其他常用化學(xué)交聯(lián)劑。同時，藥理學(xué)研究表明，其具有治療肝臟疾病、緩解II型糖尿病的癥狀的功效。
[0006]桅子藍(lán)色素具有著色力強(qiáng)、色澤鮮艷自然、無異味、耐熱、耐光、穩(wěn)定性好、色調(diào)不受PH值影響，對人體無毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是目前國際流行的天然食品添加劑，還可以用于高檔紡織品、化妝品等的染色。采用高純度結(jié)晶桅子苷、合適的轉(zhuǎn)色酶、精制氨基酸制備桅子藍(lán)色素，其最大吸收峰可以達(dá)到600nm以上；這種高端桅子藍(lán)的價格在國際上為普通品種2-3倍，可以說是一種高技術(shù)高附加值的產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供直接利用桅子果實(shí)醇提取液同時制備番紅花酸、京尼平及桅子藍(lán)等多種產(chǎn)品的方法。該方法設(shè)備要求低，操作過程簡便，可以同時生產(chǎn)多種高經(jīng)濟(jì)附加值的深加工產(chǎn)品，使資源得到合理的應(yīng)用，將經(jīng)濟(jì)效益最大化。
[0008]本發(fā)明目的通過以下方法實(shí)現(xiàn):包括桅子果實(shí)中主要成分的提取，番紅花酸的制備及純化，京尼平的制備及純化和桅子藍(lán)的制備及精制這幾部分內(nèi)容。[0009](I)桅子果實(shí)中主要成分的提取:桅子果實(shí)經(jīng)粉碎20目后采用70-100%甲醇溶液進(jìn)行提取，提取結(jié)束后去除藥渣并濃縮提取液。
[0010](2)番紅花酸的制備及純化:在濃縮液中加入強(qiáng)堿，對其中的番紅花苷類成分進(jìn)行堿解，過濾并收集濾渣，濾液備用。濾渣經(jīng)堿水充分溶解后加入強(qiáng)酸后再次產(chǎn)生沉淀。沉淀經(jīng)大量清水洗滌后即為番紅花酸粗品，純度達(dá)70%以上；采用乙醇、乙酸乙酯、N, N-二甲基甲酰胺對番紅花酸粗品進(jìn)行重結(jié)晶即可將純度提升至95%以上。
[0011](3)京尼平的制備及純化:將堿解反應(yīng)結(jié)束所得的濾液蒸干后采用純水復(fù)溶，并與有機(jī)溶劑構(gòu)建穩(wěn)定有機(jī)溶劑/水兩相系統(tǒng)。在兩相系統(tǒng)中加入能夠水解β (1-4)糖苷鍵的酶，并控制反應(yīng)過程的溫度及pH等因素對桅子苷進(jìn)行水解。水解過程結(jié)束后，分離有機(jī)相溶液并濃縮蒸干，即得京尼平粗品，純度達(dá)60%以上。對粗品采用乙醇、丙酮等有機(jī)進(jìn)行重結(jié)晶可將純度提升至95%以上。 [0012](4)桅子藍(lán)色素的制備及精制:制備的京尼平粗品經(jīng)水復(fù)溶后，加入的氨基酸在超聲波輔助下絡(luò)合形成桅子藍(lán)色素粗品溶液；采用膜分離技術(shù)對桅子藍(lán)色素的粗品溶液進(jìn)行精制即可得到高色價桅子藍(lán)色素，色價>110。
[0013]本發(fā)明實(shí)施時包括如下步驟:(1)桅子果實(shí)經(jīng)粉碎后過20目篩，采用溶劑進(jìn)行提取3遍，去除藥渣并合并提取液進(jìn)行濃縮至固形物含量為10-30%。所述溶劑為醇含量為70-100%的甲醇/水混合溶劑。
[0014](2)在濃縮后的提取物中加入NaOH、KOH或Na2CO3等，調(diào)節(jié)提取物溶液pH在9_11范圍內(nèi)，采用超聲波發(fā)生裝置對堿解反應(yīng)進(jìn)行催化加速。反應(yīng)過程的溫度控制在10-40°C，超聲波頻率為40kHz，功率為50-100W，反應(yīng)時間為10-30分鐘。
[0015](3)反應(yīng)結(jié)束后，通過抽濾收集溶液中產(chǎn)生的黃褐色沉淀，濾液備用。
[0016](4)取黃褐色沉淀加入pH為9-11的堿水直至不再溶解，再加入酸水調(diào)節(jié)pH到3_4之間，直至不再產(chǎn)生磚紅色沉淀。所用堿水可由NaOH、KOH或Na2CO3等溶于水進(jìn)行配置，所用酸水為HCl或H2S04。所得磚紅色沉淀經(jīng)大量清水洗滌后即為番紅花酸粗品，純度達(dá)70%以上。
[0017](5)對番紅花酸粗品進(jìn)行重結(jié)晶即可將純度提升至95%以上。采用溶劑為乙醇、乙酸乙酯或N，N-二甲基甲酰胺。
[0018](6)將堿解反應(yīng)結(jié)束所得的濾液蒸干后采用純水復(fù)溶，并與有機(jī)溶劑構(gòu)建穩(wěn)定有機(jī)溶劑/水兩相系統(tǒng)。所述有機(jī)溶劑可以為乙酸乙酯，石油醚或二氯甲烷中的一種。
[0019](7)在兩相系統(tǒng)中加入能夠水解β (1-4)糖苷鍵的酶，并采用超聲波加速酶解反應(yīng)的發(fā)生，反應(yīng)過程的溫度控制在40-55°C，采用乙酸調(diào)節(jié)pH為4.5-5.5，超聲波頻率為40kHz，功率為50-100W，反應(yīng)時間為4至12小時，最終轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%以上。所述能夠水解β (1-4)糖苷鍵的酶可以為β葡萄糖苷酶(酶活2 wU，酶用量為0.5%)、纖維素酶(酶活20wU，酶用量為5%)或半纖維素酶(酶活20 wU，酶用量為5%)。
[0020](8)取反應(yīng)結(jié)束后的有機(jī)相層，采用等體積純水洗滌3遍后，濃縮蒸干溶劑，即得京尼平粗品，純度達(dá)75%以上。
[0021](9)采用有機(jī)溶劑系統(tǒng)對京尼平粗品進(jìn)行重結(jié)晶可將純度提高至95%以上。所述有機(jī)溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、乙醇-水系統(tǒng)中的一種。
[0022](10)取京尼平粗品采用純水復(fù)溶，加入能夠與京尼平絡(luò)合的α-氨基酸，如谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸中的一種或多種混合氨基酸。采用超聲波加速桅子藍(lán)色素的絡(luò)合反應(yīng)過程，反應(yīng)過程的溫度控制在40-55°C，超聲波頻率為40kHz，功率為50-100W，反應(yīng)時間為12至24小時，所得桅子藍(lán)溶液，色價E590>60。
[0023](11)反應(yīng)結(jié)束后的桅子藍(lán)溶液通過膜分離技術(shù)，采用截留孔徑在3000-5000的中空纖維素膜或有機(jī)膜除去其中的小分子雜質(zhì)并同時對桅子藍(lán)溶液進(jìn)行濃縮，直至固形物含量超過15 %。處理后的桅子藍(lán)溶液經(jīng)噴霧干燥得到桅子藍(lán)粉末，色價E590>110。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果:本發(fā)明采用超聲波催化手段，通過堿解、酶解等方法直接從桅子果實(shí)中同時制備番紅花酸、京尼平及桅子藍(lán)等多種高附加值產(chǎn)品。
[0025](I)由于桅子中成分復(fù)雜，傳統(tǒng)工藝制備番紅花酸是通過首先從桅子中提取純化桅子黃色素(即番紅花苷類化合物)，再經(jīng)堿解等方法制備番紅花酸。該生產(chǎn)工藝過程復(fù)雜，操作繁瑣，生產(chǎn)成本較高。本專利提供了一種通過直接以桅子的醇提物為原料，通過酯交換反應(yīng)有效的將番紅花苷類化合物形成不溶于醇的沉淀產(chǎn)物，再通過過濾及水解等極其簡單的操作即可得到番紅花酸粗品；整套生產(chǎn)工藝具有操作簡便，生產(chǎn)周期短，降低成本等多方面的優(yōu)勢。
[0026](2)本發(fā)明還提出了對生產(chǎn)番紅花酸而產(chǎn)生的廢液進(jìn)行綜合利用的途徑。通過采用有機(jī)溶劑/水兩相催化方法可以利用含有桅子苷的廢液制備重要的生物醫(yī)藥材料京尼平。該方法利用桅子苷與京尼平在不同溶劑中的溶解度的差異，可以有效的將酶促反應(yīng)的產(chǎn)物京尼平富集于有機(jī)相中，從而使得水相中京尼平的含量長期處于較低水平，起到促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生、提高轉(zhuǎn)化率的作用。不僅如 此，由于京尼平會與液體環(huán)境中存在的氨基酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成色素；因此，本發(fā)明采用有機(jī)溶劑/水兩相催化的手段來進(jìn)行該水解過程，可以有效的避免反應(yīng)產(chǎn)物京尼平與水相中氨基酸和蛋白質(zhì)接觸，從而保證了產(chǎn)物京尼平的穩(wěn)定存在，提高了反應(yīng)的得率。與傳統(tǒng)通過固定化酶等技術(shù)生產(chǎn)京尼平相比，具有得率高，設(shè)備要求低，操作簡便等優(yōu)勢。
[0027](3)本發(fā)明首次將超聲波催化應(yīng)用到桅子深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中，有效實(shí)現(xiàn)了其中的多步重要反應(yīng)過程的快速完成。例如，傳統(tǒng)番紅花苷類化合物的堿解采用熱回流方法往往需要數(shù)小時才能反應(yīng)完全，而在常溫下通過超聲波輔助催化手段僅需I小時即可終止反應(yīng)；再如，現(xiàn)有工藝中采用β葡萄糖苷酶對桅子苷的酶解過程往往需要持續(xù)24至48小時，而通過超聲波輔助可以將反應(yīng)過程縮短在6至12小時之內(nèi)完成。因此，本發(fā)明將超聲波催化應(yīng)用到桅子深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中，具有縮短生產(chǎn)周期，減少能耗，縮小成本等多方面優(yōu)勢。
[0028]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1是番紅花酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。
[0029]圖2是經(jīng)精致重結(jié)晶后的番紅花酸液相色譜圖。
[0030]圖3是點(diǎn)尼平標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖。
[0031]圖4是經(jīng)精致重結(jié)晶后的京尼平液相色譜圖。
[0032]【具體實(shí)施方式】:
本發(fā)明可以通過
【發(fā)明內(nèi)容】
中說明的技術(shù)具體實(shí)施，通過下面的實(shí)例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。
[0033]實(shí)施例1:番紅花酸的制備。[0034](I)桅子果實(shí)200g經(jīng)粉碎后采用1000 ml甲醇提取2遍，經(jīng)過濾除去藥渣后，將兩次提取液合并濃縮至200ml。
[0035](2)在濃縮液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH為10.0，置于超聲波發(fā)生裝置中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)過程的溫度控制在28°C，超聲波頻率為40kHz，功率為100W，反應(yīng)時間為10分鐘。
[0036](3)反應(yīng)結(jié)束后，通過抽濾收集溶液中產(chǎn)生的黃褐色沉淀。
[0037](4)取黃褐色沉淀加入pH為10的堿水100 ml，待全部溶解后，再加入2mol/L的HCl水溶液調(diào)節(jié)pH到3，此時溶液中產(chǎn)生大量磚紅色沉淀。所得磚紅色沉淀經(jīng)大量清水洗滌后即為番紅花酸粗品1.7g。
[0038](5)取番紅花酸粗品lOOmg，在65°C下采用20ml N, N- 二甲基甲酰胺溶解，并濃縮至原體積1/3后，在4°C下進(jìn)行重結(jié)晶，得結(jié)晶番紅花酸36mg。
[0039](6)采用HPLC對重結(jié)晶后的番紅花酸進(jìn)行純度檢測，純度95%以上。
[0040]檢測結(jié)果如附圖1、2所示。
[0041]實(shí)施例2:京尼平的制備。
[0042](I)取200 ml堿解反應(yīng)結(jié)束所得的甲醇濾液，蒸干甲醇后采用200ml純水復(fù)溶，按體積比1:1加入乙酸乙酯構(gòu)建兩相系統(tǒng)。
[0043](2)在兩相系統(tǒng)中加入酶活為20wU的中溫纖維素酶(用量5%)，并置于超聲波發(fā)生器中反應(yīng)，反應(yīng)過程的溫度控制在50°C，采用乙酸調(diào)節(jié)pH為4.5，超聲波頻率為40kHz，功率為100W，反應(yīng)時間為8小時。
`[0044](3)取反應(yīng)結(jié)束后的有機(jī)相層，采用等體積純水洗滌3遍后，濃縮蒸干溶劑，即得京尼平粗品6.3 g，純度達(dá)75%以上。
[0045](4)取京尼平粗品2.0 g，采用甲醇-水系統(tǒng)在50°C下溶解后，放入4°C冰箱進(jìn)行重結(jié)晶，得結(jié)晶京尼平1.3 g。
[0046](5)采用HPLC對重結(jié)晶后的京尼平進(jìn)行純度檢測，純度在95~98%。
[0047]檢測結(jié)果如附圖3、4所示。
[0048]實(shí)施例3:桅子藍(lán)色素的制備。
[0049](I)取京尼平粗品100.0g,(含量75%)采用IOL蒸餾水溶解。
[0050](2)在水溶液中加入200.0g純度為99%以上的谷氨酸鈉，并置于超聲波發(fā)生器中反應(yīng)，反應(yīng)過程的溫度控制在50°C，超聲波頻率為40kHz，功率為100W，反應(yīng)時間為24小時。反應(yīng)結(jié)束后，所得溶液即為桅子藍(lán)粗品水溶液溶液，色價E590>60。
[0051](3)反應(yīng)結(jié)束后的桅子藍(lán)粗品水溶液，采用截留孔徑在3000-5000的中空纖維素膜進(jìn)行截留濃縮，直至截留液中固形物含量超過15%時停止。
[0052](4)截留液經(jīng)噴霧干燥得到桅子藍(lán)粉末164.7 g，色價E590>110。(色價測定按照GB 28311— 2012中方法進(jìn)行)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用桅子醇提液一體化制備番紅花酸、京尼平及桅子藍(lán)等產(chǎn)品的方法，其特征是:將桅子粉碎后經(jīng)醇提取、濃縮后，濃縮液直接通過兩次堿解法達(dá)到制備藏花酸并同時與桅子苷分離的目的，而后進(jìn)一步通過水-有機(jī)溶劑兩相酶催化手段水解桅子苷，制備京尼平和桅子藍(lán)色素。
2.權(quán)利要求1中制備藏花酸的兩次堿解法中，第一次堿解法如下:(I)桅子果實(shí)經(jīng)粉碎后過20目篩，采用醇含量為70-100%的甲醇/水混合溶劑常溫下提取3遍，去除藥渣，合并提取液，并濃縮至固形物含量為10-30% ;(2)在濃縮后的提取物中加入NaOH、KOH或Na2C03，調(diào)節(jié)提取物溶液pH在9-13范圍內(nèi)，溫度控制在20_60°C，時間為10-30分鐘，超聲波頻率為40kHz，功率為20-100W抽濾的黃褐色沉淀。
3.權(quán)利要求1中制備藏花酸的兩次堿解法中，第二次堿解法如下:取黃褐色沉淀加入pH為9-11的堿水直至不再溶解，再加入酸水調(diào)節(jié)pH到3-4之間，直至不再產(chǎn)生磚紅色沉淀，即為純度達(dá)70%以上的番紅花酸粗品，所用堿水可由Na0H、K0H或Na2C03等溶于水進(jìn)行配置，所用酸水為HCl或H2S04水溶液。
4.權(quán)利要求1中水-有機(jī)溶劑兩相催化體系水解桅子苷制備京尼平方法如下:將分離出藏花酸后所得的濾液蒸干，采用純水復(fù)溶，并與乙酸乙酯，石油醚或二氯甲烷等有機(jī)溶劑中的一種構(gòu)建穩(wěn)定有機(jī)溶劑/水兩相系統(tǒng)，中加入能夠水解β (1_4)糖昔鍵的酶，并米用超聲波加速酶解反應(yīng)的發(fā)生，反應(yīng)過程的溫度控制在40-55°C，采用乙酸調(diào)節(jié)pH為4.5-5.5，反應(yīng)時間為4至12小時，最終轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%以上。
5.權(quán)利要求1中桅子藍(lán)色素的制備方法為:取分離出藏花酸后所得的濾液，加入能夠水解β (1-4)糖苷鍵的酶和谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸中的一種或多種混合氨基酸，反應(yīng)時間為12至24小時，所得桅子藍(lán)溶液采用截留孔徑在3000-5000的中空纖維素膜或有機(jī)膜除去其中的小分子雜質(zhì)并同時對桅子藍(lán)溶液進(jìn)行濃縮，直至固形物含量超過15 %，經(jīng)噴霧干燥得到桅子藍(lán)粉末，色價Ε590>110。
6.權(quán)利要求4和5中所述能夠水解β(1-4)糖苷鍵的酶可以為β葡萄糖苷酶(酶活2wU，酶用量為0.5-5%)、纖維素酶(酶活20 wU，酶用量為5-20%)或半纖維素酶(酶活20 wU，酶用量為5-20%)。
【文檔編號】C07C57/13GK103695494SQ201310666965
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】趙伯濤, 朱羽堯, 錢驊, 黃曉德, 陳斌 申請人:中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所