一種重組蛋白復(fù)性緩沖液及其配制方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組蛋白復(fù)性緩沖液及其配制方法和應(yīng)用，所述緩沖液由基礎(chǔ)液和5‰的β-巰基乙醇、1%的吐溫-20、10mM的β-環(huán)糊精、1M的L-半胱氨酸以及4M的尿素組成；其配制方法為先向基礎(chǔ)液中加入4M的尿素；后加入體積比為5‰的β-巰基乙醇、1%的吐溫-20以及10mM的β-環(huán)糊精和1M的L-半胱氨酸，即形成重組蛋白復(fù)性緩沖液；本發(fā)明所述緩沖液應(yīng)用于初始蛋白濃度高于1mg/mL的重組蛋白復(fù)性，操作簡單，成本低，方便工業(yè)化生產(chǎn)，復(fù)性后蛋白體積增大較少，蛋白濃度稀釋較小，并且復(fù)性率較高。
【專利說明】一種重組蛋白復(fù)性緩沖液及其配制方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是一種重組蛋白復(fù)性緩沖液及其配制方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]由于重組蛋白在細(xì)菌體內(nèi)表達(dá)導(dǎo)致肽鏈的不完全修飾、錯誤折疊和聚集，一般以包涵體的形式存在。破碎細(xì)菌獲得純凈的包涵體，經(jīng)變性劑(6M鹽酸胍或8M尿素)溶解后，必須經(jīng)過復(fù)性使蛋白正確折疊，提高溶解度并且恢復(fù)生物活性后才能達(dá)到臨床應(yīng)用的水平。如果蛋白不能很好地復(fù)性，則直接表現(xiàn)為溶解度下降，蛋白析出沉淀，從而造成蛋白的大量損失。由于技術(shù)水平的限制，蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化是限制生物制藥領(lǐng)域快速發(fā)展的瓶頸。目前常用的包涵體蛋白復(fù)性的技術(shù)主要有:透析復(fù)性、稀釋復(fù)性、人工分子伴侶、柱色譜復(fù)性以及反膠團溶解復(fù)性等。上述各復(fù)性方法多少存在著種種問題，例如:透析復(fù)性將變性蛋白放入透析袋中，通過緩慢聯(lián)系的降低變性劑的濃度實現(xiàn)蛋白復(fù)性，雖然操作簡單但是耗時長，處理體積小，無法大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。稀釋復(fù)性是通過將變性蛋白溶液用水或復(fù)性緩沖液稀釋，實現(xiàn)變性劑濃度的緩慢下降，達(dá)到蛋白復(fù)性的目的，但是在目前沒有通用的復(fù)性緩沖液，而且據(jù)目前文獻(xiàn)報道，通過該方法復(fù)性時，需將蛋白濃度控制在較低的水平，不適用于高濃度的蛋白，目前的稀釋復(fù)性方法中一般將初始蛋白濃度控制在10-100Pg/mL，甚至更低。因此，用傳統(tǒng)的復(fù)性方法會大量稀釋蛋白，最終造成體積的快速增加，導(dǎo)致后期蛋白濃縮困難，也不適用于工業(yè)化的生產(chǎn)。人工分子伴侶的復(fù)性常用Hsp家族蛋白和GroES /GroEL等，人工分子伴侶能夠顯著提高蛋白復(fù)性率，但同時也會顯著提高生產(chǎn)成本。柱色譜復(fù)性以及反膠團溶解復(fù)性需要材料和設(shè)備特殊、成本較高、不適用于制藥工業(yè)的大量制備等，而且操作過程相對繁瑣?？傊壳吧形从羞m用于初始蛋白濃度高于lmg/mL的復(fù)性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供針對蛋白復(fù)性技術(shù)的不足，提供一種高濃度重組蛋白快速復(fù)性的緩沖液。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種重組蛋白復(fù)性緩沖液，其特征在于，所述緩沖液由基礎(chǔ)液和5%。(6-巰基乙醇、1%的吐溫-20、IOmM的P -環(huán)糊精、IM的L-半胱氨酸以及4M的尿素組成；所述基礎(chǔ)液包括20mM 的 Tris-HCl、200mM 的 NaCl 和無菌水。
[0004]本發(fā)明中，所述的緩沖液的配制方法:
A)基礎(chǔ)液的配制:在無菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl，調(diào)節(jié)pH為8.0 ；
B)向步驟A所述基礎(chǔ)液中加入4M的尿素；
C)向步驟B溶液中加入體積比為5%。的P-巰基乙醇、1%的吐溫-20以及IOmM的^ -環(huán)糊精和IM的L-半胱氨酸，形成重組蛋白復(fù)性緩沖液。
[0005]一種如權(quán)利要求1所述的緩沖液在初始蛋白濃度高于lmg/mL的重組蛋白復(fù)性中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點在于:操作簡單，成本低，所需的儀器藥品均為實驗室常規(guī)用品，方便工業(yè)化生產(chǎn)，而且可以對濃度高于lmg/mL的蛋白進行復(fù)性。復(fù)性后蛋白體積增大較少，蛋白濃度稀釋較小，并且復(fù)性率較高；復(fù)性后的蛋白可以經(jīng)過等電點沉淀后，去除殘留的藥物，同時可以除去一部分雜蛋白，等電點脫鹽和初步純化的蛋白為清澈透明液體，方便后續(xù)純化操作。
【具體實施方式】
[0007]實施例1重組蛋白復(fù)性緩沖液配置
A)基礎(chǔ)液的配制:在無菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl，調(diào)節(jié)pH為
8.0 ；
B)向步驟A所述基礎(chǔ)液中加入4M的尿素；
C)向步驟B溶液中加入體積比為5%。的P-巰基乙醇、1%的吐溫-20以及IOmM的^ -環(huán)糊精和IM的L-半胱氨酸，形成重組蛋白復(fù)性緩沖液。
[0008]實施例2初始蛋白溶液的配制 基礎(chǔ)液的配制:
在無菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的 NaCl，調(diào)節(jié)pH為8.0 ;
向基礎(chǔ)液中加入8M的尿素，攪拌均勻，配制成混合溶液，將初步純化的重組豬抑制素a亞基蛋白包涵體1Og溶解在500mL所述混合溶液中，得到初始濃度為20mg/mL的重組豬抑制素a亞基蛋白包涵體溶液(以下簡稱初始蛋白溶液)。
[0009]本實施例涉及的初步純化的重組豬抑制素a亞基蛋白包涵體是 申請人:依據(jù)中國專利CN201010618516.4公開的方法獲得。
[0010]實施例3重組蛋白的復(fù)性 基礎(chǔ)液的配制:
在無菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的 NaCl，調(diào)節(jié)pH為8.0 ;
(1)將實施例2獲得的濃度為20mg/mL的初始蛋白溶液在4°C下慢速加入實施例1獲得的重組蛋白復(fù)性緩沖液(以下簡稱緩沖液)中，同時緩慢攪拌，所述初始蛋白溶液與緩沖液的體積比為1:1 ;攪拌均勻后在4°C環(huán)境下，12000rpm離心lOmin，收集蛋白上清液；
(2)將基礎(chǔ)液慢速加入緩沖液中，形成稀釋的復(fù)性緩沖液，其中尿素的終濃度為1M，所述基礎(chǔ)液與緩沖液的體積比為3:1 ;將步驟(1)獲得的蛋白上清液在4°C環(huán)境下緩慢加入所述稀釋的緩沖液中，同時緩慢攪拌，所述的蛋白上清液與稀釋的緩沖液的體積比為1:1 ;攪拌均勻后，在4°C環(huán)境下，以12000rpm離心lOmin，收集蛋白上清液；
(3)將步驟(2)獲得的蛋白上清液慢速加入等體積的基礎(chǔ)液中，同時緩慢攪拌，攪拌均勻后，在4°C以12000rpm離心lOmin，收集蛋白上清液，即為復(fù)性的重組豬抑制素a亞基蛋白溶液，完成重組豬抑制素a亞基蛋白的復(fù)性。
[0011]經(jīng)OD280法檢測，復(fù)性的重組豬抑制素a亞基蛋白溶液中蛋白終濃度約為2.2 mg/mL。蛋白的復(fù)性，直接表現(xiàn)在蛋白的溶解度上，即:復(fù)性好的蛋白呈溶解狀態(tài)，未復(fù)性的蛋白則沉淀析出，經(jīng)過離心去除。根據(jù)復(fù)性前和復(fù)性后呈溶解狀態(tài)的蛋白的含量，復(fù)性蛋白占總蛋白的百分比，計算出蛋白的復(fù)性率。[0012]復(fù)性率計算公式如下:
,
【權(quán)利要求】
1.一種重組蛋白復(fù)性緩沖液，其特征在于，所述緩沖液由基礎(chǔ)液和5%。的(6-巰基乙醇、1%的吐溫-20、IOmM的P -環(huán)糊精、IM的L-半胱氨酸以及4M的尿素組成；所述基礎(chǔ)液包括20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl和無菌水。
2.一種如權(quán)利要求1所述的緩沖液的配制方法，其特征在于: A)基礎(chǔ)液的配制:在無菌水中加入20mM的Tris-HCl、200mM的NaCl，調(diào)節(jié)pH為8.0 ； B)向步驟A所述基礎(chǔ)液中加入4M的尿素； C)向步驟B溶液中加入體積比為5%。的P-巰基乙醇、1%的吐溫-20以及IOmM的^ -環(huán)糊精和IM的L-半胱氨酸，形成重組蛋白復(fù)性緩沖液。
3.—種如權(quán)利要求1所述的緩沖液在初始蛋白濃度高于lmg/mL的重組蛋白復(fù)性中的應(yīng)用。`
【文檔編號】C07K1/14GK103626834SQ201310668749
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】李輝, 施振旦 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院