抗人心肌肌鈣蛋白i的重組抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，其包括由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的輕鏈可變區(qū)與人IgG1的輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成的輕鏈和由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的重鏈可變區(qū)與人IgG1的重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的重鏈。該重組抗體與鼠源性抗體相比，既保留了親本抗體的識別抗原的特異性和親和力，而且避免了與人血清中的抗鼠抗體發(fā)生非特異性反應(yīng)，因此，從臨床診斷應(yīng)用方面來看，上述重組抗體比鼠源性抗體更具有應(yīng)用價值。此外，本發(fā)明還涉及一種抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體的構(gòu)建方法以及該重組抗體的應(yīng)用。
【專利說明】抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗體工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]20世紀80年代前，世界衛(wèi)生組織(WHO) —直將心肌酶譜活性作為急性心肌梗死(AMI)的診斷標(biāo)準之一。20世紀80年代末,科研人員發(fā)現(xiàn),肌鈣蛋白(troponin, Tn)的敏感性和特異性高于磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等生物標(biāo)志物。心肌肌鈣蛋白I(cTnl)僅存于心肌，是心肌細胞的標(biāo)志物，其異常改變可影響心臟的舒縮功能，并可用于診斷心肌壞死，判斷心肌損傷等，成為心肌細胞損傷敏感性和特異性最強的標(biāo)志物之一，是公認的快速診斷AMI和急性冠脈綜合征(acutecoronary syndromes, ACS)以及協(xié)助ACS危險分層和反映其預(yù)后的主要生化標(biāo)志。
[0003]正常人血液中cTnl含量一般低于0.3 μ g/L。當(dāng)心肌細胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破壞時，游離的cTnl可迅速透過細胞膜進入血流。因此，在發(fā)病初期快速、靈敏且準確的測定人血中的cTnl及其變化趨勢對急性心肌梗死的診斷、急性冠狀動脈綜合征的危險分層、監(jiān)測各種因素導(dǎo)致的心肌損傷等有著重要的臨床意義。臨床上用于檢測cTnl水平的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，化學(xué)發(fā)光，膠體金等，不同方法都有各自的優(yōu)缺點，但是都需要針對于cTnl的特異性單克隆抗體。傳統(tǒng)的臨床診斷使用的都是鼠源的單克隆抗體(mAb)ο
[0004]長期以來，鼠源性的單克隆抗體被廣泛的應(yīng)用于科研、臨床診斷和治療，但是由于鼠源性的mAb會引起人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，從而限制了其在臨床方面的應(yīng)用。因此，對鼠源性抗體進行人源化改造是非常必要的。從上個世紀80年代以來，用于治療的單克隆抗體的發(fā)展趨勢是從鼠源抗體到人源化抗體再到全人源抗體，目前已經(jīng)被FDA批準上市的抗體藥物中有近半是人源化抗體。 而在臨床診斷領(lǐng)域，現(xiàn)在使用的基本上還是鼠源性的抗體，但是由于人平常會接觸到鼠類接觸過的物品，血液中可能會出現(xiàn)HAMA反應(yīng)，從而存在人抗鼠的抗體，在臨床診斷中會出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，即會出現(xiàn)假陽性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于此，有必要提供一種能顯著降低假陽性出現(xiàn)概率的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0006]一種抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，包括由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的輕鏈可變區(qū)與人IgGl的輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成的輕鏈和由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的重鏈可變區(qū)與人IgGl的重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的重鏈。
[0007]在其中一個實施例中，所述抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體由保藏號為CCTCCC2013185的雜交瘤細胞產(chǎn)生。
[0008]在其中一個實施例中，所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。[0009]在其中一個實施例中，所述重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
[0010]一種抗人心肌肌鈣蛋白I重組抗體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0011]分別構(gòu)建含有如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表達載體，其中，含有SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表達載體含有人IgGl的輕鏈恒定區(qū)的表達基因，含有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表達載體含有人IgGl的重鏈恒定區(qū)的表達基因；
[0012]將所述表達載體轉(zhuǎn)染到同一宿主細胞中；
[0013]從所述宿主細胞中回收得到所述抗人心肌肌鈣蛋白I重組抗體。
[0014]在其中一個實施例中，待插入如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表達載體預(yù)留有Xbal和Pmll雙酶切位點；待插入如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表達載體預(yù)留有Nhel和Hindlll雙酶切位點。
[0015]在其中一個實施例中，所述如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列是通過如下步驟制
備獲得:
[0016]從保藏號為CCTCC C2013185的雜交瘤細胞中提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR，RT-PCR擴增產(chǎn)物70°C酶失活后作為模板，以SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6所示的引物序列進行PCR，回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用rTaq DNA聚合酶進行加A反應(yīng)后插入到pMD_18T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞中表達；
[0017]回收DH5a感受態(tài)細胞表達的產(chǎn)物，使用如SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8所示的引物序列進行PCR，得到所述SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列；
[0018]所述如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列是通過如下步驟制備獲得:
[0019]從保藏號為CCTCC C2013185的雜交瘤細胞中提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR，RT-PCR擴增產(chǎn)物70°C酶失活后作為模板，以SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10所示的引物序列進行PCR，回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用rTaq DNA聚合酶進行加A反應(yīng)后插入到PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞中表達；
[0020]回收DH5 α感受態(tài)細胞表達的產(chǎn)物，使用如SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12所示的引物序列進行PCR，得到所述SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
[0021]一種編碼如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA。
[0022]一種編碼如SEQ ID Ν0.2所示的氨基酸序列的DNA。
[0023]一種包含編碼如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA和/或編碼如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的DNA的真核細胞表達載體。
[0024]一種由上述真核細胞表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
[0025]上述重組抗體在制備檢測心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或檢測儀器中的應(yīng)用。
[0026]一種心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙，包括上述重組抗體。
[0027]在其中一個實施例中，所述檢測試紙包括支撐薄片、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo) 墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有所述重組抗體包附膠體金顆粒形成膠體金標(biāo)記的重組抗體，所述檢測線為親和純化的抗心肌肌鈣蛋白I的兔多抗，所述質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。
[0028]一種檢測試劑盒，包括上述心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙。
[0029]上述重組抗體與鼠源性抗體相比，既保留了親本抗體的識別抗原的特異性和親和力，而且避免了與人血清中的抗鼠抗體發(fā)生非特異性反應(yīng)，因此，從臨床診斷應(yīng)用方面來看，上述重組抗體比鼠源性抗體更具有應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為一實施方式的檢測試紙的正面示意圖；
[0031]圖2為圖1中檢測試紙的縱截面示意圖；
[0032]圖3為檢測試劑盒示意圖；
[0033]圖4為以雜交瘤細胞提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，用重鏈和輕鏈兼并引物擴增含Vh和\的基因片段的電泳圖，\的mKF5/mKR引物對和Vh的mHF2/mHR引物對擴增出420bp左右的條帶，M為DL2000DNAMarker ；
[0034]圖5為重組抗體真核表達載體， a為pFP-1gCK，b為pFP-1gCH ；
[0035]圖6為用'和Vh特異的引物擴增的V1^ (395bp^PVH (405bp)基因片段，M為DL2000DNAMarker ；
[0036]圖7為重組抗體用proteinG親和層析柱純化時的穿透峰和吸收峰；
[0037]圖8為重組抗體純化后SDS-PAGE分析，a為4 μ g鼠源抗體，b為4 μ g重組抗體，M 為 Protein Marker。
【具體實施方式】
[0038]以下結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用作進一步詳細的說明。
[0039]一實施方式的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，包括由抗人心肌肌鈣蛋白IChcTnI)的鼠源抗體(mAb)的輕鏈可變區(qū)(L鏈V區(qū)，\)與人IgGl的輕鏈恒定區(qū)(L鏈C區(qū)，Q，如k鏈C區(qū)(Ck)等)構(gòu)成的輕鏈和由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的重鏈可變區(qū)(H鏈V區(qū)，Vh)與人IgGl的重鏈恒定區(qū)(H鏈C區(qū)，Ch)構(gòu)成的重鏈。
[0040]其中，上述抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體由保藏號為CCTCC C2013185的雜交瘤細胞產(chǎn)生，該雜交瘤細胞命名為CTN1-C4，已于2013年11月13日保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心(即中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。上述輕鏈可變區(qū)含有如SEQ IDN0.1所示的氨基酸序列，其對應(yīng)的DNA序列為序列表中SEQ ID N0.3 ;重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，其對應(yīng)的DNA序列為序列表中SEQ ID N0.4。
[0041]SEQIDN 0.3 的序 列為:ATGMGTTGC CTGTTAGGCT G
ATGTTCTGG A T.CCTGCTTC.C AGC AGT; (; Λ T GTTTTGATGACCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA GCCTCCATC TCTTGC AGATCTAGTCAG AG CATTG TA CAT AGTA ATGG AA ACACCTATTT AGAA I'CiGTAC
【權(quán)利要求】
1.一種抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，其特征在于，包括由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的輕鏈可變區(qū)與人IgGl的輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成的輕鏈和由抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體的重鏈可變區(qū)與人IgGl的重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的重鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，其特征在于，所述抗人心肌肌鈣蛋白I的鼠源抗體由保藏號為CCTCC C2013185的雜交瘤細胞產(chǎn)生。
3.如權(quán)利要求1所述的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)含有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)含有如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。
5.一種抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: 分別構(gòu)建含有如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表達載體，其中，含有SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表達載體含有人IgGl的輕鏈恒定區(qū)的表達基因，含有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表達載體含有人IgGl的重鏈恒定區(qū)的表達基因； 將所述表達載體轉(zhuǎn)染到同一宿主細胞中； 從所述宿主細胞中回收得到所述抗人心肌肌鈣蛋白I重組抗體。
6.如權(quán)利要求5所述的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體的構(gòu)建方法，其特征在于，待插入如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列的表達載體預(yù)留有XbaI和PmlI雙酶切位點；待插入如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的表達載體預(yù)留有NheI和HindIII雙酶切位點。
7.如權(quán)利要求6所述的抗人心肌肌鈣蛋白I的重組抗體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述如SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列是通過如下步驟制備獲得: 從保藏號為CCTCC C2013185的雜交瘤細胞中提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR，RT-PCR擴增產(chǎn)物70°C酶失活后作為模板，以SEQ ID N0.5及SEQ ID N0.6所示的引物序列進行PCR，回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用rTaq DNA聚合酶進行加A反應(yīng)后插入到pMD_18T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞中表達； 回收DH5a感受態(tài)細胞表達的產(chǎn)物，使用如SEQ ID N0.7及SEQ ID N0.8所示的引物序列進行PCR,得到所述SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列； 所述如SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列是通過如下步驟制備獲得: 從保藏號為CCTCC C2013185的雜交瘤細胞中提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行RT-PCR，RT-PCR擴增產(chǎn)物70°C酶失活后作為模板，以SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10所示的引物序列進行PCR，回收PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物用rTaq DNA聚合酶進行加A反應(yīng)后插入到pMD_18T載體中，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞中表達； 回收DH5a感受態(tài)細胞表達的產(chǎn)物，使用如SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12所示的引物序列進行PCR,得到所述SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列。
8.—種編碼如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA。
9.一種編碼如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的DNA。
10.一種包含編碼如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA和/或編碼如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的DNA的真核細胞表達載體。
11.一種如權(quán)利要求10所述的真核細胞表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
12.如權(quán)利要求1所述的重組抗體在制備檢測心肌肌鈣蛋白I檢測試劑或檢測儀器中的應(yīng)用。
13.一種心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的重組抗體。
14.如權(quán)利要求13所述的心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙，其特征在于，包括支撐薄片、樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè)在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有所述重組抗體包附膠體金顆粒形成膠體金標(biāo)記的重組抗體，所述檢測線為親和純化的抗心肌肌鈣蛋白I的兔多抗，所述質(zhì)控線為羊抗鼠IgG抗體。
15.一種檢測試劑盒，包括 如權(quán)利要求13或14所述的心肌肌鈣蛋白I的檢測試紙。
【文檔編號】C07K16/46GK103694355SQ201310676769
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】李泓彥, 霍永庭, 彭亮 申請人:深圳市菲鵬生物股份有限公司