新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一類(lèi)新型抗人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的受體DR（deathreceptor）胞外區(qū)的抗體。該類(lèi)死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體可以識(shí)別DR4、DR5的相同或相似的表位，形成多價(jià)抗體，誘導(dǎo)表達(dá)DR4和/或DR5的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)人的p53結(jié)構(gòu)域連接，形成四價(jià)抗體，該四價(jià)抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序如SEQIDNO.1所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序如SEQIDNO.2所示。該類(lèi)激動(dòng)性抗體誘導(dǎo)同時(shí)表達(dá)DR4、DR5的腫瘤凋亡的能力明顯強(qiáng)于只針對(duì)DR4或DR5的激動(dòng)性抗體。本發(fā)明還提供了該類(lèi)死亡受體激動(dòng)性抗體在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一類(lèi)新型死亡受體的激動(dòng)性多價(jià)抗體，該類(lèi)抗體可以誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/^01?的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，可用于制備抗腫瘤藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(1111110111601-0818 ^801:01-1-0181:6(1 8^0^1:0818111(1110111? 11職11(1，I狀]；0是# 11丫等于1995年發(fā)現(xiàn)的I'研7超家族新成員。實(shí)驗(yàn)證實(shí)I'狀]X對(duì)幾乎所有系統(tǒng)惡性腫瘤的大部分細(xì)胞系均有殺傷作用，而對(duì)正常組織無(wú)殺傷作用(他七10(1, 1999，5: 157-63),因此以I'狀I(lǐng)[受體為靶點(diǎn)的腫瘤治療已成為研究的熱點(diǎn)。
[0003]11^11的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物學(xué)效應(yīng)主要是通與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體:0尺4(0681:11 1-6061)1:01-4) ? 01？5 (0681:11 1-6061)1:01-5)結(jié)合而產(chǎn)生的。當(dāng) I狀]X 與冊(cè)4 或 0尺5結(jié)合后，0財(cái)與005可以形成同源/異源三聚體，通過(guò)其含有的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域((1681:11(101118111, 00)傳導(dǎo)凋亡信息至胞質(zhì)內(nèi)，激活(^81)2186系統(tǒng)最終引起細(xì)胞凋亡(3(3161106.1997:276:111 - 113.1臟皿1七^(guò) 2000； 12:611 - 620.0611 81^1.2004； 16: 139 -144.?0
[0004]有些研究小組研發(fā)出死亡受體激動(dòng)性抗體,這些抗體與0財(cái)或005特異性結(jié)合后，模擬I'狀I(lǐng)[的作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(恥七16土 2001； 7:954 - 960.1 01111 011001 25:1390 - 1395.?0由于抗體的分子量較大，在體內(nèi)半衰期比I狀I(lǐng)I長(zhǎng)，因此研制死亡受體的激動(dòng)性抗體代替I'狀I(lǐng)I，成為開(kāi)發(fā)藥物的主要方向。
[0005]理論上，激活0財(cái)和0陽(yáng)的激動(dòng)性抗體具有以下優(yōu)點(diǎn):對(duì)于同時(shí)表達(dá)0財(cái)和0陽(yáng)的腫瘤，其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力明顯強(qiáng)于只針對(duì)0財(cái)或0陽(yáng)的激動(dòng)性抗體；對(duì)于只表達(dá)0尺4或085的腫瘤，也只需一種抗體藥物，便于臨床應(yīng)用。然而目前雖然已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道獲得了 0財(cái)或085的激動(dòng)性抗體，但是沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道制備出具有同時(shí)激活0財(cái)和0尺5能力的激動(dòng)性抗體。這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明按照傳統(tǒng)思路，制備同時(shí)激活0財(cái)和0陽(yáng)的激動(dòng)性抗體可行性不強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的在于提供一類(lèi)新型的能同時(shí)激活0`財(cái)和0陽(yáng)的死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，及其在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
[0007]新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，識(shí)別0財(cái)、01？5的相同或相似的表位，形成多價(jià)抗體，可以誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/或0陽(yáng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0008]新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，識(shí)別0財(cái)、0陽(yáng)的相同或相似的表位，通過(guò)基因工程的方法形成多價(jià)抗體，從而可以誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/或085的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0009]新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，識(shí)別0財(cái)、01？5的相同或相似的表位，通過(guò)人的？53結(jié)構(gòu)域連接，形成四價(jià)抗體，從而可以同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/或0陽(yáng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，該四價(jià)抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序如SEQ ID N0.1所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序如SEQ ID N0.2所示。
[0010]上述的新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0011]在本發(fā)明中，采用基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)，利用人的B細(xì)胞，采用噬菌體展示技術(shù)，獲得一株識(shí)別人DR4和DR5的相同或相似表位的單鏈抗體，將其多聚化，形成多價(jià)抗體。該類(lèi)多價(jià)抗體可以在體外強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。因此該類(lèi)抗體可以用于新型抗腫瘤藥物的研發(fā)?，F(xiàn)有的死亡受體激動(dòng)性抗體均為只激活DR4或DR5 (如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?200680009970.1 ；200410070093.1 ;200580018426.9)。
[0012]本發(fā)明還涉及了新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體的制備方法，它主要包括以下步驟:利用健康人的B細(xì)胞建立抗體庫(kù)，利用噬菌體展示技術(shù)淘篩識(shí)別DR4、DR5相同或相似的表位的抗體，得到單鏈抗體。將其構(gòu)建為多價(jià)抗體。表達(dá)、純化后，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)多價(jià)抗體具有使表達(dá)DR4和/或DR5的腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。
[0013]本發(fā)明與國(guó)內(nèi)外只針對(duì)DR4或DR5的類(lèi)似專(zhuān)利相比，該類(lèi)激動(dòng)性抗體識(shí)別DR4和DR5的共同或相似表位，將其制成多價(jià)抗體，可以使表達(dá)DR4和/或DR5的腫瘤細(xì)胞凋亡。該類(lèi)激動(dòng)性抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力強(qiáng)于只能激活DR4或DR5傳統(tǒng)的激動(dòng)性抗體；這些結(jié)果均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所想象不到。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1顯示癌細(xì)胞Jurkat轉(zhuǎn)染DR4前后表達(dá)DR4、DR5情況:轉(zhuǎn)染前DR4低表達(dá)，DR5高表達(dá)；轉(zhuǎn)染后DR4明顯升高，DR5表達(dá)基本不變；
圖2顯示2.5mg/L死亡受體激動(dòng)性四價(jià)抗體作用于轉(zhuǎn)染DR4前、后Jurkat細(xì)胞20h作用結(jié)果:該抗體可以使轉(zhuǎn)染前主要表達(dá)DR5的Jurkat食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，還可以使轉(zhuǎn)染后同時(shí)高表達(dá)DR4和DR5的Jurkat食管癌細(xì)胞的進(jìn)一步升高；
圖3顯示細(xì)胞EC970轉(zhuǎn)染DR5前后表達(dá)DR4、DR5情況:轉(zhuǎn)染前DR5低表達(dá)，DR4高表達(dá)；轉(zhuǎn)染后DR5明顯升高，DR4表達(dá)基本不變；
圖4顯示2.5mg/L死亡受體激動(dòng)性四價(jià)抗體作用于轉(zhuǎn)染DR4前、后EC970細(xì)胞20h作用結(jié)果:該抗體可以使轉(zhuǎn)染前主要表達(dá)DR4的EC970食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，還可以使轉(zhuǎn)染后同時(shí)高表達(dá)DR4和DR5的EC970食管癌細(xì)胞的進(jìn)一步升高。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0016]實(shí)施例1死亡受體單鏈抗體的制備
采集50個(gè)健康成年人的外周單個(gè)核血細(xì)胞，提取總RNA。根據(jù)《重組抗體》(沈倍奮，科學(xué)出版社)方案，以cDNA為模板，擴(kuò)增全套VH和VL基因，將擴(kuò)增得到的重、輕鏈產(chǎn)物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增出ScFv片段。ScFv片段和載體pcantab_5E經(jīng)Sfi 1、Not I酶切后，T4連接酶連接，電轉(zhuǎn)化入E.coli XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，制備噬菌體抗體庫(kù)。用死亡受體抗原包被 96 孔板(第 I 輪 DR4、DR5 各 100 μ g/ml;第 2 輪先 DR4 30 μ g/ml，再 DR5 30 μ g/ml ;第3 輪先 DR4 10yg/ml$DR5 10 μ g/ml ;第 4 輪先 DR4 lyg/ml$DR5 I μ g/ml。)，1%BSA封閉后每孔加50 μ I噬菌體抗體庫(kù)，37°C放置2 h，用TBST洗滌(第I輪10遍，后幾輪20遍)。將得到的噬菌粒送上海英駿生物公司測(cè)序。
[0017] cDNA第一鏈人重鏈恒定區(qū)引物
IgM (F): TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT
(1)重鏈正向引物
H-1(F): CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG
H-2b (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG
H-3b (F): CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG
H-3c(F): CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG
H-4b (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG
H-4c (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG
H-5(F): CAG CCG GCC ATG GCC GAR GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG
H-6 (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG
H-7 (F): CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG
HuVH1:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTC CAG CTG GTR CAG
TCT GG (Sfi I )
HuVH2b:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTC ACC TTG AAG GAGTCT GG (Sfi I )
HuVH3b:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTG CAG CTG GTG GAGTCT GG (Sfi I )
HuVH3c:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAGWCY GG (Sfi I )
HuVH4b:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAGTGG GG (Sfi I )
HuVH4c:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG STG CAG CTG CAG GAGTCS GG (Sfi I )
HuVH5:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAR GTG CAG CTG GTG CAGTCT GG (Sfi I )
HuVH6:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAGTCA GG (Sfi I )
HuVH7:GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTG CAG CTG GTG CARTCT GG (Sfi I )
(2)重鏈反向引物
H-8(R): TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC
H-9(R): TGA AGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC
H-1O(R): TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC
H-extension(R)1\2: ggagccgccgccgcc(agaaccaccaccacc)2 TGA GGA GAC GGT GACCAG GGT GCC
H-extension(R)3: ggagccgccgccgcc(agaaccaccaccacc)2 TGA AGA GAC GGT GAC CATTGT CCC
【權(quán)利要求】
1.新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，其特征在于:識(shí)別0財(cái)、01？5的相同或相似的表位，形成多價(jià)抗體，可以誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/^01?的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
2.如權(quán)利要求1所述的新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，其特征在于:識(shí)別0財(cái)、01？5的相同或相似的表位，通過(guò)基因工程的方法形成多價(jià)抗體，從而可以誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/或冊(cè)5的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
3.如權(quán)利要求2所述的新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體，其特征在于:識(shí)別0財(cái)、01？5的相同或相似的表位，通過(guò)人的？53結(jié)構(gòu)域連接，形成四價(jià)抗體，從而可以同時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)0財(cái)和/或0陽(yáng)的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，該四價(jià)抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序如3即10勵(lì).1所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序如3即10勵(lì).2所示。
4.如權(quán)利要求1至3任一所述的新型死亡受體激動(dòng)性多價(jià)抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK103833853SQ201310725221
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】馬遠(yuǎn)方, 劉峰濤, 柴立輝, 張軍, 劉廣超, 李淑蓮 申請(qǐng)人:河南大學(xué)