一種高效、低毒的石墨烯多功能載體的構(gòu)建及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。利用石墨烯易于進(jìn)行各種功能化的特點(diǎn)，將小尺寸氧化石墨烯進(jìn)行合理的多功能化，構(gòu)建了一種高效、低毒的石墨烯多功能載體，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子輸送、蛋白質(zhì)純化三種功能中的任意兩種或兩種以上功能。同時(shí)本發(fā)明也提供了該石墨烯多功能載體的詳細(xì)制備步驟。本發(fā)明的主要用途為基因轉(zhuǎn)染、活性分子輸送、蛋白純化等蛋白質(zhì)作用機(jī)制的研究，可用于疾病發(fā)病機(jī)理的研究、藥物設(shè)計(jì)以及基因治療等領(lǐng)域。
【專利說明】一種高效、低毒的石墨烯多功能載體的構(gòu)建及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效、低毒的石墨烯多功能載體，集基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子輸送 和蛋白質(zhì)純化功能于一體，可一步完成蛋白質(zhì)作用機(jī)制的研究工作，提高了蛋白質(zhì)作用機(jī) 制研究的效率和準(zhǔn)確性。

【背景技術(shù)】：
[0002] 石墨烯是由單層碳原子形成的二維平面型納米材料，易于進(jìn)行各種功能化，目前 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)領(lǐng)域。已有的研究證實(shí)，石墨烯可分別成功應(yīng)用于藥物運(yùn)載、基因 轉(zhuǎn)染、和蛋白質(zhì)分離領(lǐng)域。
[0003] 2008年，Hongjie Dai課題組報(bào)道了石墨烯用于小分子藥物阿霉素 (doxorubicin)的負(fù)載，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)獲得良好的抗腫瘤活性，他們利用超支化聚乙二醇 (PEG)功能化的石墨烯細(xì)胞毒性非常小，說明石墨烯是一種良好的藥物運(yùn)載試劑。同年，陳 永勝課題組報(bào)道了氧化石墨烯對(duì)阿霉素可實(shí)現(xiàn)超高的負(fù)載率（2. 35mg mg-1)和可控釋放。 2009至2011年間，張智軍和陳永勝課題組分別報(bào)道了對(duì)石墨烯進(jìn)行多功能化，采用不同方 法制備了多功能化石墨烯，用以負(fù)載藥物并靶向腫瘤細(xì)胞，均取得良好效果。
[0004] 2010年，劉遵峰在世界上首次提出將石墨烯應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，可將蛋白質(zhì) (或復(fù)合物）進(jìn)行快速親和性分離。由于石墨烯具有極好的電子透射性能，無需進(jìn)行洗脫， 可直接使用透射電鏡進(jìn)行單顆粒三維結(jié)構(gòu)分析，從而使整個(gè)分離過程可快速完成。目前獲 得對(duì)人類細(xì)胞中的航海蛋白（Navigator)的分離純度可達(dá)到90%。2011年劉莊報(bào)道了石 墨烯可降低聚乙烯基亞胺（PEI)在基因轉(zhuǎn)染過程中的毒性；張智軍將石墨烯應(yīng)用于DNA和 siRNA中的轉(zhuǎn)染，獲得低毒性和良好的效率。
[0005] 本專利發(fā)明人在多年從事石墨烯的性質(zhì)和生物化學(xué)中的應(yīng)用研究過程中，利用 超小尺寸氧化石墨烯（<20nm)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，獲得高轉(zhuǎn)染效率（90% )和相當(dāng)?shù)偷亩拘?(〈10%死亡率），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于經(jīng)典商業(yè)化試劑lipofectamin(?30% )，在生物組織（斑馬魚 卵模型）中也顯示出很好的性能。
[0006] 通過上述背景資料可以看出，石墨烯在基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子輸送、蛋白質(zhì)純化 領(lǐng)域中均表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。所以發(fā)明人認(rèn)為，通過對(duì)石墨烯進(jìn)行合理多功能化，完全有可 能將上述多種功能集石墨烯于一身。本發(fā)明即在以上技術(shù)背景之上，設(shè)計(jì)并制備發(fā)出集基 因轉(zhuǎn)染、生物活性分子輸送、和蛋白質(zhì)純化功能于一體的高效率、低毒性多功能載體，使蛋 白質(zhì)作用機(jī)制的研究可一步完成，提高了蛋白質(zhì)作用機(jī)制研究的效率和準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 針對(duì)以上技術(shù)背景，提出本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明的內(nèi)容是提供一種研究蛋白質(zhì)作用機(jī)制的高效率、低毒性的石墨烯多功能 載體的構(gòu)建和制備方式，克服現(xiàn)有蛋白質(zhì)研究工作流程繁復(fù)、效率低下、準(zhǔn)確性難以保證等 不足，可同時(shí)完成基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子輸送和蛋白質(zhì)純化的研究。
[0009] 本發(fā)明涉及的石墨烯多功能載體示意圖祥見說明書附圖1。
[0010] 本發(fā)明涉及的石墨烯多功能載體具有以下特性：
[0011] 1.以超小尺寸氧化石墨烯（<20nm)為基本載體：超小尺寸氧化石墨烯（<20nm)尺 寸小，利于在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，并易于進(jìn)行功能化，且毒性?。?br> [0012] 2.聚乙烯基亞胺（PEI)提供基因負(fù)載和轉(zhuǎn)染能力，并提供反應(yīng)性大量官能團(tuán) NH2 ；
[0013] 3.多臂聚乙二醇增加載體的溶解性、生物相容性、延長(zhǎng)載體活性成分在細(xì)胞內(nèi)的 酶降解半衰期、并減小毒性；
[0014] 4.鏈酶親和素可專一性識(shí)別生物素標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)，提供純化功能。使用功能 性多肽（多肽1、2、3)利于載體跨越細(xì)胞內(nèi)部屏障，提高轉(zhuǎn)染效率；
[0015] 5.牛血清蛋白可減少甚至消除非目標(biāo)蛋白質(zhì)的非專一性吸附，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)純 度。
[0016] 本發(fā)明涉及的多功能載體的構(gòu)建、合成步驟如說明書附圖2。詳細(xì)說明如下：
[0017] 1.首先使用鱗片石墨（純度99. 95% )，根據(jù)改進(jìn)的Hummer's法制備氧化石墨烯。 然后超聲分散于MilliQ水中，使用離心過濾膜（100Kd，Millip 〇re)過濾，使用MilliQ水洗 滌，得超小尺寸氧化石墨烯（尺寸小于20nm)。
[0018] 2.將上述超小尺寸氧化石墨烯分散于MilliQ水中，加入超支化PEI (分子量： 25KD)和6臂聚乙二醇（單臂分子量：2000KD)，加入N-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽室溫?cái)嚢?，使用離心過濾膜（l〇〇Kd，Millipore)過濾、MilliQ水洗滌，分散于 MilliQ水中即完成PEI和6臂PEG的功能化，得載體1。
[0019] 3.將上步驟得到的載體1加入生物素、N-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺鹽 酸鹽（EDC)，室溫?cái)嚢柽^夜，使用離心過濾膜過濾，再用MilliQ水洗滌三次，分散于MilliQ 水（中。即完成生物素的功能化，得載體2。
[0020] 4.將上步驟得到的載體2加入4-(N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥 珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC)，溶解在DMS0中，室溫下反應(yīng)2h。之后使用離心過濾膜過濾， 再用MilliQ水/ DMS0混合液洗滌三次，分散于PBS緩沖液中，得活化的載體2。活化的載 體2加入三羧乙基膦（TCEP)，攪拌、反應(yīng)24h。使用離心過濾膜（lOOKd，Millipore)過濾， 再用PBS緩沖液洗滌三次，分散于PBS緩沖液中，即完成功能性多肽的功能化，得載體3。
[0021] 5.將上步驟得到的載體3在2h內(nèi)使用蠕動(dòng)泵緩慢滴加到上述鏈酶親和素與PBS 緩沖溶液中，然后過夜混合。使用離心過濾膜（l〇〇Kd，Millip〇re)過濾，再用PBS緩沖液洗 滌三次，分散于PBS緩沖液中，即完成鏈酶親和素的功能化，得載體4。
[0022] 6.將上步驟得到的載體4加入牛血清蛋白溶解于PBS緩沖液中，孵育lh，即完成 牛血清蛋白在該多功能載體上的物理吸附，得到最終多功能載體。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0023] 圖1.集基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子運(yùn)載和蛋白質(zhì)純化功能于一體的多功能石墨烯 載體的設(shè)計(jì)示意圖
[0024] 圖2.集基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子運(yùn)載和蛋白質(zhì)純化功能于一體的多功能石墨烯 載體合成步驟示意圖。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于研究蛋白質(zhì)作用機(jī)制的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是可同時(shí) 實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染、生物活性分子輸送、蛋白質(zhì)純化三種功能中的任意兩種或兩種以上功能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：以超小尺寸氧化 石墨烯為基本載體，超小尺寸的氧化石墨烯尺寸需小于500nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：使用高分子或陽 離子高分子提供基因負(fù)載和轉(zhuǎn)染能力，并提供反應(yīng)性大量官能團(tuán)NH2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的陽離子高分子包含聚乙烯基亞胺（PEI)、聚酰胺-胺樹形高 分子（dendrimer)、脫乙酰殼多糖（chitosan)、陽離子聚磷酸酯、聚乙烯基批陡鹽、聚（二甲 氨基）乙基甲基丙烯酸酯。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：使用多臂聚乙二 醇增加載體的溶解性、生物相容性、延長(zhǎng)載體活性成分在細(xì)胞內(nèi)的酶降解半衰期、并減小毒 性。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：使用親和性分離 基團(tuán)可專一性識(shí)別其標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)，提供純化功能。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的親和性分離基團(tuán)包含鏈酶親和素、6倍組氨酸（6XHis)、谷胱 甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與谷胱甘肽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體，其特征是：可使用牛血清蛋 白或雞血清蛋白減少或消除非目標(biāo)蛋白質(zhì)的非專一性吸附，提高目標(biāo)蛋白質(zhì)純度。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效、低毒的石墨烯多功能載體的制備，包含以下步驟： (1) 制備權(quán)利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯：選取純度99. 95%以上的鱗片石墨， 根據(jù)改進(jìn)的Hu_er' s法制備氧化石墨烯；然后超聲分散于MilliQ水中，使用離心過濾膜 過濾，MilliQ水洗滌，得到權(quán)利要求2所述的超小尺寸氧化石墨烯（尺寸小于500nm); (2) 進(jìn)行陽離子高分子的功能化：將步驟（1)制得的超小尺寸氧化石墨烯分散于 Mi 11 iQ水中，加入超支化PEI、6臂聚乙二醇、N-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸 鹽，室溫?cái)嚢韬笫褂秒x心過濾膜過濾、MilliQ水洗滌，得到載體1 ; ⑶進(jìn)行生物素的功能化：將步驟⑵制得的載體1加入生物素、N-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫?cái)嚢柽^夜，使用離心過濾膜過濾，MilliQ水洗滌，得到載 體2 ; ⑷進(jìn)行功能性多肽的功能化：將步驟⑶制得的載體2加入4-(N-馬來酰亞胺甲基） 環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC)，溶解在DMS0中，室溫下反應(yīng)2h ; 之后使用離心過濾膜過濾，MilliQ水/ DMS0混合液洗滌，分散于PBS緩沖液中；加入三羧 乙基膦，攪拌反應(yīng)24h ;使用離心過濾膜過濾，PBS緩沖液洗滌，得到載體3 ; (5) 進(jìn)行鏈酶親和素的功能化：將步驟⑷制得的載體3在此內(nèi)使用蠕動(dòng)泵緩慢滴加 到上述鏈酶親和素與PBS緩沖溶液中，混合；使用離心過濾膜過濾，PBS緩沖液洗滌，分散于 PBS緩沖液中，得到載體4 ; (6) 將步驟（5)制得的載體4加入血清蛋白，溶解于PBS緩沖液中，孵育lh，即完成血 清蛋白在該多功能載體上的物理吸附，得到最終的高效、低毒的石墨烯多功能載體。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK104140981SQ201310729272
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月20日
【發(fā)明者】賈鳳美, 劉遵峰, 劉倩 申請(qǐng)人:常州碳宇納米科技有限公司