一種薩氏海鞘抗腫瘤多肽及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種薩氏海鞘抗腫瘤多肽及制備方法和應(yīng)用，所述多肽是一種新的顆粒體蛋白多肽，是一個(gè)由58個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，命名為HQ59；根據(jù)Edman降解法測(cè)定得到的該肽的N-端序列，設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，通過(guò)快速分離cDNA末端技術(shù)對(duì)編碼CS5931基因的cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行了擴(kuò)增，克隆了編碼該肽的cDNA全長(zhǎng)，命名為Cs-pgrn-1。Cs-pgrn-1由685個(gè)堿基組成，其中編碼CS5931多肽為核苷酸序列的15-189位和252-426，即蛋白序列的1-58位和80-137位。多肽HQ59可作為制備治療或預(yù)防腫瘤疾病藥中的應(yīng)用，在開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物方面有很大應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種薩氏海鞘抗腫瘤多肽及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種來(lái)自薩氏海鞘(.CionasavignyO的抗腫瘤多肽以及編碼該肽的基因，同時(shí)還涉及該多肽在預(yù)防和/或治療腫瘤疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是人類健康的第一殺手，其發(fā)病率和致死率均居各中疾病之首?？拱┧幬锏难芯亢烷_(kāi)發(fā)已成為本世紀(jì)新藥研究的重大課題。從海洋中分離純化抗腫瘤活性物質(zhì)已經(jīng)成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)之一。
[0003]海鞘(Ascidian)屬于脊索動(dòng)物門(Chordates),尾索動(dòng)物亞門(Urochordata),海鞘綱(Ascidiacea)，全世界大約有1600種。到目前為止已經(jīng)從海鞘中發(fā)現(xiàn)了許多具有新的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的環(huán)肽、線性肽及desipeptides。Didemnins (膜海鞘素)最早是從加勒比海鞘中分離的，是desip印tides的家族，具有抗腫瘤，抗病毒和免疫抑制作用，其中Didemnins B是抗腫瘤活性最強(qiáng)的環(huán)肽(體外對(duì)L1210的IC5tl為2.5ng/ml),也是第一種進(jìn)入臨床試驗(yàn)的海洋天然產(chǎn)物。由兩種海鞘Didemnumcuculiferum和Polysyncrantonlithostrotum中發(fā)現(xiàn)的一種13個(gè)氨基酸的環(huán)肽可顯著抑制微管聚合,并能延長(zhǎng)小鼠P388淋巴細(xì)胞白血病的生存期；但由薩氏海鞘中分離出抗腫瘤蛋白鮮見(jiàn)報(bào)道。
[0004]薩氏海鞘屬于內(nèi)性目、玻璃海鞘科，為我國(guó)北方海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要生物污染物，國(guó)內(nèi)有關(guān)薩氏海鞘的研究還非常少見(jiàn)。僅有中國(guó)科學(xué)院海洋研究所的相建海研究員對(duì)其作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)種做了報(bào)道。從薩氏海鞘體內(nèi)分離得到一種分子量為59kDa的多肽，命名為海鞘多肽(HQ59)。HQ59對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，而對(duì)正常肝細(xì)胞HL-7702的生長(zhǎng)不具有抑制作用，通過(guò)Edman降解法對(duì)多肽的N-末端氨基酸序列進(jìn)行了測(cè)定，得到了由15個(gè)氨基酸殘基組成的序列:
Met-Val-Val-Cys-Pro-Asp-Gly-Gln-Ser-Glu-Cys-Pro-Asp-Gly-Asn,經(jīng) Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，此序列與人顆粒體蛋白(granulin, GRN)有同源性。
[0005]顆粒體蛋白GRN，是由一些分子量小，富含二硫鍵并具有多種功能的多肽組成的蛋白家族。GRN家族成員的保守結(jié)構(gòu)域含有12個(gè)Cys，形成分子內(nèi)的6個(gè)二硫鍵，這使GRN多肽具有緊湊的空間結(jié)構(gòu)特征。
[0006]本發(fā)明中提供了一種薩氏海鞘來(lái)源的GRN多肽HQ59，具有體外抗腫瘤活性。在本發(fā)明之前未見(jiàn)以薩氏海鞘多肽為原料制備藥物劑型并用于預(yù)防和治療腫瘤疾病的報(bào)道，也未見(jiàn)從薩氏海鞘中鑒定出GRN多肽的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種來(lái)自薩氏海鞘的抗腫瘤多肽，它是從的內(nèi)臟組織中的天然多肽的基礎(chǔ)上獲得的多肽，具有GRN保守結(jié)構(gòu)域，是一種GRN多肽，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，具體地說(shuō)為1-58位和80-137位。以質(zhì)譜分析的方法分析測(cè)定該多肽分子量為5931道爾頓，我們將此多肽命名為HQ59，為簡(jiǎn)化說(shuō)明以下用此名稱表示此發(fā)明所述抗腫瘤多肽。
[0008]本發(fā)明提供了編碼HQ59的cDNA序列，該序列如SEQ ID N0.1所示，命名為Cs-pgrn-Ι。該cDNA的克隆方法如下:
A.提取薩氏海鞘內(nèi)臟組織總RNA，轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA;
B.根據(jù)N-末端氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Pl:5’ ATGGTNGTNTGYCCNGAYG 3，(SEQ IDN0.3);P2:5’ TGYCCNGAYGGNCARffSNGARTG 3’ (SEQ ID N0.4);通過(guò) 3’ RACE 的方法擴(kuò)增該全長(zhǎng)cDNA的3’末端； C.根據(jù)3’RACE擴(kuò)增出來(lái)的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物P3:5’TTCGTTCGGATTTTCACCGAAGAC 3’ (SEQ ID N0.5) ;P4:5’ CCTCCGCATTAGGTGAGAATCGAAGT 3’(SEQ ID N0.6);通過(guò)5’ RACE的方法擴(kuò)增該全長(zhǎng)cDNA的5’末端；
D.將獲得的上述兩條序列進(jìn)行拼接，獲得編碼抗腫瘤多肽的全長(zhǎng)cDNA。
[0009]本發(fā)明提供了一種制備重組HQ59的方法，該方法簡(jiǎn)便，成本低廉。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，提供了包含SEQ ID N0.2中所示的氨基酸序列或SEQ ID N0.1的核酸編碼的氨基酸序列，或其變體多肽或變體多核苷酸，其中所述變體多肽與SEQ ID N0.2中所出示的序列至少80%的序列同一性，或所述變體多核苷酸編碼與SEQ ID N0.2中所示的序列具有至少80%序列同一性的多肽。
[0011]根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，可以從本發(fā)明所公開(kāi)的氨基酸序列中推導(dǎo)出編碼本發(fā)明所述的抗腫瘤多肽的基因序列，因此，所有可以編碼本發(fā)明所述的抗腫瘤多肽即HQ59的基因均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。發(fā)明人也從構(gòu)建的薩氏海鞘的cDNA文庫(kù)中獲得編碼HQ59的基因序列，即 Cs-pgrn-l。
[0012]優(yōu)選地，編碼本發(fā)明所述的抗腫瘤多肽HQ59的cDNA序列即Cs-pgrn-l，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。SEQ ID N0.1顯示了發(fā)明人從薩氏海鞘的內(nèi)臟組織新鮮分離的mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)然后克隆得到編碼HQ59的全長(zhǎng)cDNA序列，其中5’ -UTR (5’非翻譯區(qū))為14bp，3’ -UTR (3，非翻譯區(qū))為149bp (含PolyA尾巴)，開(kāi)放閱讀框(ORF)為522bp，編碼173個(gè)氨基酸和I個(gè)終止子，包括兩個(gè)序列一樣的GRN保守結(jié)構(gòu)域，即由58個(gè)氨基酸組成的多肽HQ59。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例，利用基因工程的方法，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化出重組HQ59。在該實(shí)例中，采用含6XHis tag (六個(gè)組氨酸組成的標(biāo)簽)的pET21a-g載體，表達(dá)出重組HQ59，采用親和層析的方法可以將重組HQ59純化出來(lái)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明所揭示的原理和方法，采用任意已知的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)出重組HQ59。因此，包含本發(fā)明所述的編碼HQ59的基因或核苷酸序列的重組表達(dá)載體，以及采用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞得到的轉(zhuǎn)化體，以及從所述的轉(zhuǎn)化體中獲得的重組HQ59，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明所揭示的原理和方法，針對(duì)任意的采用包含本發(fā)明所述的編碼HQ59的基因或核苷酸序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所的轉(zhuǎn)化體，可選擇合適的培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化體，并通過(guò)合適的提取方法回收所表達(dá)的重組HQ59，以及復(fù)性重組HQ59。這些制備本發(fā)明所述的重組HQ59的發(fā)明方法均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0015]本發(fā)明還涉及了 HQ59的氨基酸序列(SEQ ID N0.2)在作為制備治療和/或預(yù)防結(jié)腸癌、宮頸癌、肺癌、白血病等多種腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。它可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,殺死腫瘤細(xì)胞,該多肽有開(kāi)發(fā)成抗腫瘤藥物的潛力。所以,HQ59和編碼HQ59的基因或核酸序列在制備治療和/或預(yù)防腫瘤的產(chǎn)品的應(yīng)用以及在制備抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和/或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明對(duì)于抗腫瘤多肽HQ59的生理藥理研究及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0017]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0018]附圖1是編碼HQ59的全長(zhǎng)cDNA和氨基酸序列分析圖。該圖中核苷酸及氨基序號(hào)位于左側(cè)；終止密碼子由星號(hào)標(biāo)記；不穩(wěn)定基序(ATTTA)由下劃線表示；兩個(gè)GRN保守結(jié)構(gòu)域由灰色標(biāo)記；GRN保守結(jié)構(gòu)域的N-末端的15個(gè)氨基酸序列以粗體表示；24個(gè)保守的Cys以方框標(biāo)記。
[0019]附圖2是HQ59抗瘤譜的測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0021]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0022]實(shí)施例一:HQ59的cDNA克隆和基因分析 根據(jù)已經(jīng)測(cè)得的HQ59的N-末端的氨基酸序列(MVVCPDGQSECPDGN)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)快速分離cDNA末端(RACE)技術(shù)對(duì)編碼HQ59基因的cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行了擴(kuò)增，并且通過(guò)序列分析確定了 HQ59的一級(jí)序列結(jié)構(gòu)。具體操作如下:
1.3’ RACE:根據(jù)HQ59的N-末端15個(gè)氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用Takara公司生產(chǎn)的3’full RACE kit擴(kuò)增編碼HQ59基因的cDNA的3’末端。(I)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):將薩氏海鞘RNA和3’ RACE Adaptor (試劑盒提供)的混合液在70°C熱變性lOmin，冰上快速冷卻，然后再加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的其余試劑(試劑盒提供)，進(jìn)行42°C,60min延伸反應(yīng),得到cDNA的第一鏈。(2 )巢式PCR反應(yīng):以上述cDNA為模板，用正向引物PI (序列為5 ’ ATGGTNGTNTGYCCNGAYG3’ )和反向引物Tl (試劑盒提供，序列為5’ TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3’ )進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性3 min ;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為:94 °〇變性30 s，57°C退火30 s,72 °C延伸I min ;循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用正向引物P2 (序列為5’TGYCCNGAYGGNCARWSNGARTG 3’)和反向引物T2 (試劑盒提供，序列為5’CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG3’)進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性3 min;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為:94 °C變性30 s,60°C退火30 s,72 °C延伸I min;循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10 min。
[0023]經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增得到了 450bp的產(chǎn)物，將其克隆到pMD19_T Vector后測(cè)序。
[0024]2.5’ RACE:首先以薩氏海鞘總RNA為模板，用Oligo (dT)-adaptor (序列為5’ GGCCACGCGTCGACTAGTACT17 3’)為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA第一鏈。然后，根據(jù)3’ RACE擴(kuò)增出來(lái)的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增多肽HQ59編碼基因cDNA的5’末端。具體步驟如下:(I) cDNA加尾:以上述純化過(guò)的cDNA第一鏈為模板，用末端脫氧核糖核酸合成酶(TdT)處理cDNA第一鏈，使其5’末端加上poly (C)尾巴。(2)巢氏PCR擴(kuò)增:以上述cDNA為模板，用特異性正向引物P3 (序列為5 ’ TTCGTTCGGATTTTCACCGAAGAC3’)和反向引物 Oligo (dG)-adaptor (參考 invitrogen 公司生產(chǎn)的 5Λ RACE System forRapidAmplification of cDNA Ends試劑盒設(shè)計(jì)，序列為 5’GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGHN 3’ )進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，
反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性3 min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為:94 °C變性30 s，62°C退火30 s，72 °C延伸I min ;循環(huán)結(jié)束后72 °C再延伸10 min。
[0025]以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，用正向引物P4 (序列為5，CCTCCGCATTAGGTGAGAATCGAAGT 3’)和反向引物 01 igo (dG) -adaptor 進(jìn)行第二輪 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件:前20個(gè)循環(huán)采用touch down PCR，94°C30 s，70°C30 s(每循環(huán)降低0.5°C )，72°C I min，隨后 20 個(gè)循環(huán) 94°C 30 s,63°C 30 s，72 °C lmin，最后 72°C延伸 10 min。經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增得到了 460bp的產(chǎn)物，將其克隆到pMD19-T Vector后測(cè)序。序列分析:序列分析后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)片段間約有200bp的重疊，將兩個(gè)片段序列合并從而獲得編碼HQ59的全長(zhǎng)cDNA,命名為Cs-pgrn-l (GeneBank注冊(cè)號(hào)為JQ743626)。Cs-pgrn-l的核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列可參見(jiàn)圖1和序列表。
[0026]該cDNA 全長(zhǎng) 685bp，其中 5’ 非翻譯區(qū)(UTR)為 14bp，3’UTR 為 149bp (含 PolyA尾巴)，開(kāi)放閱讀框(ORF)為522bp，編碼一條由173個(gè)氨基酸殘基組成的多肽.經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)基因Cs-pgrn-l編碼的多肽含有兩個(gè)序列一樣的顆粒體蛋白(granulin, GRN)保守結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸序列的1-58位和80-137位(圖1)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有12個(gè)保守的Cys，具有GRN類多肽特征性保守序列:X2_3CX5_6CX5CCX8CCX6CCX5CCX5CX5_6CX2。通常這12個(gè)半胱氨酸共價(jià)連接形成6個(gè)二硫鍵，這些共價(jià)鍵是維持GRN類多肽3D結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。我們發(fā)現(xiàn)推導(dǎo)出的GRN保守結(jié)構(gòu)域的N端氨基酸序列和通過(guò)Edman降解法所測(cè)得的多肽HQ59的N端序列一致(MVVCPDGQSECPDGN)。通過(guò)軟件計(jì)算發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)一級(jí)結(jié)構(gòu)一樣，含有58個(gè)氨基酸的GRN保守結(jié)構(gòu)域(Met1- Lys58和Met8°_Lys137)，其理論分子量為5944Da。當(dāng)GRN保守結(jié)構(gòu)域中的12個(gè)半胱氨酸形成6個(gè)二硫鍵時(shí)，其理論分子量應(yīng)該為5932Da，這和我們前期研究中測(cè)得的多肽HQ59的分子量5931Da接近。在哺乳動(dòng)物中，顆粒蛋白前體(progranulin, PGRN)，含有一個(gè)信號(hào)肽和七個(gè)半前后銜接重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域分別命名為paragranulin、GRN G、F、B、A、C、D、E,不同的結(jié)構(gòu)域之間由連接區(qū)域隔開(kāi)。成熟的PGRN經(jīng)絲氨酸蛋白酶水解后可產(chǎn)生一組分子量約6kDa的單體GRN多肽(GN A-G)。因此，多肽HQ59由基因Cs-pgrn-l編碼，為一種GRN樣多肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)序列由58個(gè)氨基酸組成，為GRN保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。根據(jù)cDNA序列推導(dǎo)的理論氨基酸序列(一級(jí)結(jié)構(gòu))為:
MVVCPDGQSECPDGNTCCKLASGQYGCCPQPNAVCCSDHIHCCPEGYTCNVGGGTCVK(58aa)。多肽 HQ59的氨基酸序列用BLASTP進(jìn)行相似性檢索，并用CLUSTAL-W生物軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。目前，多種GRN多肽已經(jīng)從哺乳動(dòng)物、魚(yú)類、雙殼貝類和線蟲(chóng)等動(dòng)物中分離并鑒定出來(lái)。與其它包括人、小鼠、大鼠和魚(yú)類等動(dòng)物的已鑒定序列的GRN多肽比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，多肽HQ59與來(lái)源蝦夷扇貝的GRN同源性最高為62.1% (圖2)，所以HQ59為GRN家族的新成員。
[0027]實(shí)施例:HQ59抑瘤譜測(cè)定
采用MTT法檢測(cè)HQ59對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。細(xì)胞為:人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(RK0)、人白血病細(xì)胞(HL60)和人肺癌細(xì)胞(A549)。以上細(xì)胞均為中科院海洋所海洋藥物實(shí)驗(yàn)室提供。
[0028]具體實(shí)驗(yàn)步驟:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用細(xì)胞培養(yǎng)液將樣品稀釋成不同濃度梯度，加入到每孔中，每個(gè)梯度有4個(gè)平行孔。于37°C，培養(yǎng)48 h后，用移液槍將96孔板中液體洗凈后每孔加入MTT (I mg/ml)100μΙ，置C02培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)4 h。棄去MTT用培養(yǎng)液洗板一次，每孔加入DMSO 200μ1，置搖床搖勻10 min。最后用酶標(biāo)儀在570 nm下檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)上方差分析的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率(％) =(0D值對(duì)照孔-OD值給藥孔)/0D值對(duì)照孔X 100%ο實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值土 SD表示。 [0029]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HQ59對(duì)用于試驗(yàn)的5種腫瘤細(xì)胞，Hela細(xì)胞、HCTl 16細(xì)胞、RKO細(xì)胞、HL60細(xì)胞和A549細(xì)胞均有增殖抑制作用，48h的IC50值分別為3.17，2.00，5.14，4.29和4.78 μ Μ,并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116有很高的抑制作用，并且呈一定的劑量依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為0.4,0.8、1.6,3.2,6.4 μ M時(shí)，多肽HQ59對(duì)HCTl 16細(xì)胞的抑制率分別為7.2%、19.0%、40.0%、64.9%,88.0%。不同濃度的HQ59對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的抑制譜見(jiàn)附圖2。
【權(quán)利要求】
1.一種薩氏海鞘抗腫瘤多肽，其為自薩氏海鞘iCionasavignyi )分離純化得到的抗腫瘤多肽，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2所示的序列。
2.編碼如權(quán)利要求1所述的多肽的基因，其cDNA序列為SEQID N0.1所示序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤活性多肽，其特征在于:包含SEQID N0.2中所示的氨基酸序列或SEQ ID N0.1的核酸編碼的氨基酸序列，或其變體多肽或變體多核苷酸，其中所述變體多肽與SEQ ID N0.2中所出示的序列至少80%的序列同一性，或所述變體多核苷酸編碼與SEQ ID N0.2中所示的序列具有至少80%序列同一性的多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗腫瘤活性多肽，其特征在于:所述多肽包含基因的重組表達(dá)載體以及獲得的重組抗腫瘤多肽。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的薩氏海鞘抗腫瘤多肽cDNA的克隆方法，它包括下列步驟: A.提取薩氏海鞘內(nèi)臟組織總RNA，轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA； B.根據(jù)N-末端氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Pl:5’ ATGGTNGTNTGYCCNGAYG 3’ ；P2:5’ TGYCCNGAYGGNCARffSNGARTG 3’ ；通過(guò) 3’ RACE 的方法擴(kuò)增該全長(zhǎng) cDNA 的 3’ 末端； C.根據(jù)3’RACE擴(kuò)增出來(lái)的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物P3:5’TTCGTTCGGATTTTCACCGAAGAC 3’ ；P4:5’ CCTCCGCATTAGGTGAGAATCGAAGT 3’ ；通過(guò) 5’ RACE 的方法擴(kuò)增該全長(zhǎng)cDNA的5’末端； D.將獲得的上述兩條序列進(jìn)行拼接，獲得編碼抗腫瘤多肽的全長(zhǎng)cDNA。
6.權(quán)利要求1所述的抗腫瘤多肽在制備治療和/或預(yù)防多種腫瘤引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。`
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的抗腫瘤多肽是重組抗腫瘤多肽。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK103880937SQ201310739341
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】林秀坤, 趙進(jìn), 程林友, 許煥麗 申請(qǐng)人:林秀坤, 趙進(jìn), 程林友