一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。本發(fā)明的一種Ⅰ型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法，包括收集高免蛋、高免蛋消毒、海藻酸鈉除脂、硫酸銨沉淀、抗體的超濾膜濃縮和純化以及滅活除菌等步驟。研究結(jié)果表明，本發(fā)明采用海藻酸鈉除脂、硫酸銨沉淀提取得到的Ⅰ型和新型鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體，抗體純度高、效價(jià)高、副反應(yīng)小、治療效果明顯，能夠安全方便的用于Ⅰ型以及新型鴨肝炎病毒的同時(shí)防治。
【專利說(shuō)明】一種I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種卵黃抗體的制備方法，特別涉及一種I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。本發(fā)明屬于水禽用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨甲型肝炎(Duck Hepatitis A, DHA)是由鴨甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis AVirus, DHAV)引起雛鴨的一種以肝臟為主要病理變化的急性、高度致死性、接觸性傳染病。該病主要侵害I~3周齡的雛鴨，傳播迅速，發(fā)病嚴(yán)重，臨床癥狀主要表現(xiàn)為痙攣、抽搐和角弓反張，以肝臟腫脹和出血為主要病理變化。病鴨多在出現(xiàn)癥狀后的I小時(shí)內(nèi)死亡，10日齡雛鴨感染后死亡率可達(dá)90%以上，該病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。
[0003]鴨肝炎病毒包含嗜肝病毒科、星狀病毒科和小核糖核酸病毒科3個(gè)病毒科的4種病毒。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨乙型肝炎，其對(duì)鴨沒(méi)有顯著的致病性；星狀病毒科引起II型鴨肝炎，目前為止僅英國(guó)有發(fā)病報(bào)道；目前我國(guó)流行的是由小核糖核酸病毒科引起的I型和新型鴨甲型肝炎。對(duì)于血清I型病毒，我國(guó)已經(jīng)采用了多年的卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防和治療，并取得了一定的效果，但今年來(lái)不斷從病鴨中同時(shí)分離到I型和新型鴨肝炎病毒，證明我國(guó)多地出現(xiàn)血清I型和新型鴨肝炎混合感染的情況。血清中和試驗(yàn)表明，I型和新型之間缺乏交叉保護(hù)作用，I型卵黃抗體很難對(duì)流行的新型鴨肝炎病毒進(jìn)行預(yù)防，I型和新型二價(jià)卵黃抗體是預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎的必然要求，因此探討I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的提取方法對(duì)有效防治該病具有是十分重要的意義。
[0004]卵黃抗體(egg yolk antibodies, IgY)是指產(chǎn)蛋雞受特定抗原免疫后產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移和貯存在卵黃中的特異性抗體，從蛋黃中將IgY提取并應(yīng)用在動(dòng)物疾病的防治中已得到廣泛認(rèn)可。但I(xiàn)gY被廣泛應(yīng)用的前提是如何將卵黃中將大量的IgY提取、純化出來(lái)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了許多卵黃抗體的制備方法，但由于提取方法的不當(dāng)，缺少抗體純化過(guò)程，導(dǎo)致提取過(guò)程中，抗體大量損失，效價(jià)大幅降低，大量雜蛋白及脂肪等物質(zhì)未被除去，同時(shí)存在提取藥品的殘留。其結(jié)果是一方面，造成抗體提取成本的提高；其另一方面，造成抗體注射困難、難以吸收、注射局部腫脹、過(guò)敏反應(yīng)嚴(yán)重，直接導(dǎo)致抗體治療效果不佳，嚴(yán)重影響抗體的使用效果，極大的限制了卵黃抗體在疾病防治上的應(yīng)用。
[0005]目前常采用的方法包括酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法以及辛酸法等，其中酸化水提取法除脂效果不佳，卵黃抗體中含有大量雜蛋白；聚乙二醇法中使用聚乙二醇易溶于水，目前尚沒(méi)有辦法去除，對(duì)畜禽有一定的危害，IgY含有一定雜蛋白，抗體純度不高；氯仿法中使用氯仿有殘留和毒性，對(duì)卵黃抗體的品質(zhì)有較大影響，易引起注射部位腫脹，及動(dòng)物全身不良反應(yīng)；辛酸法 中辛酸在水中溶解度極低(0.062g/L),因此在水溶性物質(zhì)中辛酸殘留量極微。在醫(yī)學(xué)工業(yè)中辛酸已被廣泛應(yīng)用，對(duì)生物不具毒副作用。但單純使用辛酸萃提，蛋白純度低，效價(jià)低，治療效果不明顯。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的種種技術(shù)缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一，是提供一種卵黃抗體的提取方法，以解決目前存在的由于提取方法的不當(dāng)，缺少抗體純化過(guò)程，導(dǎo)致提取過(guò)程中，抗體大量損失，效價(jià)大幅降低，大量雜蛋白及脂肪等物質(zhì)未被除去，同時(shí)存在提取藥品的殘留的問(wèn)題。
[0007]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:
[0008]本發(fā)明的一種卵黃抗體(egg yolk antibodies, IgY)的提取方法,其特征在于包括以下步驟:
[0009](1)收集高免蛋；
[0010](2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤(pán)和系帶，收集卵黃；
[0011](3)除脂
[0012]量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合并調(diào)至PH5.0-5.2，置2~8°C保存過(guò)夜；
[0013]其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.1-0.15% (w/w)的海藻酸鈉以及0.02-0.08% (w/w)的NaCl，其余為純化水；
[0014](4)鹽析
[0015]次日，吸取上清液，調(diào)pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28% (w/w),再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉淀用PBS緩沖液溶解沉淀；
[0016](5)抗體的純化
[0017]沉淀溶解液經(jīng)截留分子量為50KD的超濾膜包過(guò)濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩沖液恢復(fù)至原體積再進(jìn)行濃縮，反復(fù)3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存；
[0018](6)抗體的滅活除菌
[0019]獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋后經(jīng)甲醛溶液滅活，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾得到最終的卵黃抗體提取液。
[0020]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。(v/v)新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然后用甲醛熏蒸雞蛋30分鐘。
[0021]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.12%的海藻酸鈉以及0.05%的NaCl，其余為純化水。
[0022]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(4)或(5)中所述的PBS緩沖液為0.15mol/L的PBS緩沖液，PH7.2。
[0023]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(6)中將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至病毒抗體中和效價(jià)≥1:512，經(jīng)終濃度為0.04%(v/v)的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過(guò)濾得到最終的卵黃抗體提取液。
[0024]通過(guò)與目前普遍使用的卵黃抗體的提取方法，例如酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法和海藻酸鈉硫酸銨法提取的IgY經(jīng)SDS-PAGE電泳后，純度存在明顯差異，5種方法提取的IgY均在67kD和22kD左右，出現(xiàn)IgY的重鏈和輕鏈電泳條帶，而用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法提取的IgY，還在34kD~55kD之間出現(xiàn)非目的蛋白的電泳條帶。說(shuō)明以上四種方法提取的IgY，含有雜蛋白，蛋白純度較低，結(jié)果如圖1所示。[0025]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二，是提供一種I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法，以解決方法現(xiàn)有卵黃抗體提取方法中存在的抗體效價(jià)低，抗體純度不高，治療效果不佳的問(wèn)題，同時(shí)提供一種能夠同時(shí)對(duì)I型、新型鴨肝炎起到防治作用的二價(jià)卵黃抗體。
[0026]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)手段為:
[0027]本發(fā)明的一種I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0028](I)收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體；
[0029]其中，所述的血清I型鴨肝炎病毒為鴨甲型肝炎病毒SD株，命名為DHAV-SD，分類命名為鴨甲型肝炎病毒，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2013年12月9日，微生物保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8560 ；
[0030]所述的新型鴨肝炎病毒為鴨甲肝病毒JS株，命名為DHAV-JS，分類名是:鴨甲肝病毒，微生物保藏編號(hào)是=CGMCC N0.6852。保藏時(shí)間是:2012年11月13日；保藏單位是:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該病毒株已記載在申請(qǐng)?zhí)枮?01210562151.7，發(fā)明名稱為一種鴨甲肝病毒JS株及其在鴨病毒性肝炎防治中的應(yīng)用的中國(guó)專利申請(qǐng)中；
[0031](2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤(pán)和系帶，收集卵黃；
[0032](3)除脂
[0033]量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合并調(diào)至PH5.0-5.2，置2~8°C保存過(guò)夜；
[0034]其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.1-0.15% (w/w)的海藻酸鈉以及0.02-0.08% (w/w)的NaCl，其余為純化水；
[0035](4)鹽析
[0036]次日，吸取上清液，調(diào)pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28% (w/w),再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉淀用PBS緩沖液溶解沉淀；
[0037](5)抗體的純化
[0038]沉淀溶解液經(jīng)截留分子量為50KD的超濾膜包過(guò)濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩沖液恢復(fù)至原體積再在進(jìn)行濃縮，反復(fù)3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存；
[0039](6)抗體的滅活除菌
[0040]將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至鴨肝炎病毒血清I型和新型鴨肝炎病毒的抗體中和效價(jià)≥1:512，經(jīng)終濃度為0.04% (v/v)的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用
0.45 μ m濾膜過(guò)濾得到最終的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體提取液。
[0041]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(1)中所述的高免蛋，經(jīng)中和試驗(yàn)檢測(cè)，鴨肝炎病毒血清I型和新型鴨肝炎病毒的抗體效價(jià)均> 1:1024。
[0042]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。(v/v)新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然后用甲醛熏蒸雞蛋30分鐘。
[0043]在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.12% (w/w)的海藻酸鈉以及0.05%(w/w)的NaCl,其余為純化水。
[0044]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三是提供一種由以上任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體。
[0045]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之四是提供所述的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體在制備預(yù)防或治療I型及/或新型鴨肝炎藥物中的應(yīng)用。
[0046]研究結(jié)果表明，本發(fā)明采用海藻酸鈉除脂、硫酸銨沉淀提取得到的I型和新型鴨病毒性肝炎二價(jià)蛋黃抗體，抗體純度高、效價(jià)高、副反應(yīng)小、治療效果明顯，能夠安全方便的同時(shí)用于I型以及新型鴨肝炎的防治。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0047]圖1為采用不同方法提取得到的IgY的SDS-PAGE電泳圖。
[0048]1、蛋白Marker ;2、酸化水法提取的IgY ;3、聚乙二醇法提取的IgY ;4、氯仿法提取的IgY ;5、辛酸法提取的IgY ;6、本發(fā)明的海藻酸鈉-硫酸銨法提取的IgY。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
`[0050]實(shí)施例1 I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備
[0051]1、生產(chǎn)用毒株
[0052]制苗免疫原用血清I型鴨肝炎病毒SD株和新型鴨肝炎病毒JS株，均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司分離、鑒定、保管和供應(yīng)。
[0053]血清I型鴨肝炎病毒SD株(DHAV-SD)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，微生物保藏編號(hào)為=CGMCC N0.8560。
[0054]新型鴨肝炎病毒JS株(DHAV-JS)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中，微生物保藏編號(hào)是=CGMCC N0.6852。
[0055]2、疫苗(免疫原)的制備
[0056]2.1血清I型鴨肝炎病毒SD株原液的制備
[0057]取血清I型鴨肝炎病毒SD株，用滅菌生理鹽水稀釋1000倍，經(jīng)尿囊腔接種11日齡鴨胚，每胚0.2ml，置37°C繼續(xù)孵育。鴨胚接種后，將24小時(shí)前死亡的鴨胚棄去。在24~96小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚隨時(shí)取出，氣室向上直立于2~8°C冷卻12小時(shí)后,無(wú)菌收取絨毛尿囊、胎兒、胚液及羊水，勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2~8°C保存。
[0058]2.2新型鴨肝炎病毒JS株原液的制備
[0059]取新型鴨肝炎病毒JS株，用滅菌生理鹽水稀釋1000倍，經(jīng)尿囊腔接種11日齡鴨胚，每胚0.2ml，置37°C繼續(xù)孵育。鴨胚接種后，將24小時(shí)前死亡的鴨胚棄去。在24~96小時(shí)內(nèi)死亡的鴨胚隨時(shí)取出，氣室向上直立于2~8°C冷卻12小時(shí)后，無(wú)菌收取絨毛尿囊、胎兒、胚液及羊水，勻漿后、凍融3次，4000r/min離心30min，取上清混合于無(wú)菌容器中，置2~8°C保存。
[0060]2.3抗原的濃縮
[0061 ] 將鴨肝炎病毒SD株鴨胚液和JS株鴨胚液分別倒入透析袋，扎緊透析袋兩端，放入400g/L的PEG20000中進(jìn)行濃縮，當(dāng)濃縮到原體積的1/20時(shí)取出，加適量pH7.2PBS沖洗袋壁，使最終體積為原液的1/10，并按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，無(wú)菌生長(zhǎng)，并測(cè)定毒價(jià)。每0.2ml病毒含量均不低于105_°ELD5(i。
[0062]2.4 滅活
[0063]濃縮后的抗原加入終濃度為0.2% (v/v)的甲醛溶液，密封置37°C作用48小時(shí)(期間6~8小時(shí)振搖I次)。
[0064]2.5滅活檢驗(yàn)
[0065]將滅活后的SD株和JS株病毒抗原分別經(jīng)尿囊腔接種11日齡鴨胚10枚，每胚
0.2ml置37°C培養(yǎng)觀察168小時(shí)。鴨胚全部健活且無(wú)病變。
[0066]2.6油乳劑滅活疫苗的制備
[0067]2.6.1水相制備
[0068]取濃縮并檢驗(yàn)合格的SD株和JS株病毒鴨胚液，分別按每96ml鴨胚液加入4ml吐溫-80，各自于滅菌容器內(nèi)充分振搖使吐溫-80完全溶解為止。
[0069]2.6.2油相制備
[0070]按注射用白油94份，司本-806份，硬脂酸鋁1.5份的比例配制油相，混合加熱完全熔解后，在115°C滅菌40分鐘，冷至室溫備用。
[0071]2.6.3 乳化
[0072]按水相和油相1:1.5的比例，將油相分別注入預(yù)混罐中，低溫?cái)嚢璧耐瑫r(shí)，各自緩慢加入兩種水相，再注入乳化罐乳化5分鐘。即成為接種蛋雞鴨肝炎病毒JS株和SD株滅
活疫苗。
[0073]2.7滅活疫苗檢驗(yàn)
[0074]2.7.1 性狀
[0075]外觀:乳白色乳劑
[0076]劑型:油包水型。取一清潔吸管吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴(kuò)散。
[0077]穩(wěn)定性:吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相< 0.5ml ο
[0078]黏度:用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2謹(jǐn)，上口內(nèi)徑為2.7謹(jǐn))吸取25°C左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，記錄流出0.4ml所需的時(shí)間，結(jié)果:在8秒以內(nèi)。
[0079]2.7.2無(wú)菌檢驗(yàn)
[0080]按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果:無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0081]2.7.3安全檢驗(yàn)
[0082]取健康雛鴨20只，其中10只肌肉多點(diǎn)注射鴨肝炎病毒JS株滅活疫苗2ml，另10只肌肉多點(diǎn)注射鴨肝炎病毒SD株滅活疫苗2ml。同時(shí)用條件相同的對(duì)照雛鴨10只與免疫雛鴨同條件飼養(yǎng)，觀察10日，注射組和對(duì)照組雛鴨均健活。
[0083]3高免蛋的制備
[0084]3.1高免蛋雞的選擇
[0085]產(chǎn)蛋雞應(yīng)具有商品蛋雞的生產(chǎn)性能，產(chǎn)蛋率維持在80%以上。按0.5%抽樣ELISA檢測(cè)禽白血病、禽傳染性貧血、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病，全部為陰性；監(jiān)測(cè)雞白痢和雞支原體，二者的陽(yáng)性率不超過(guò)0.1%。
[0086]3.2產(chǎn)蛋雞的免疫
[0087]3.2.1基礎(chǔ)免疫接種
[0088]將產(chǎn)蛋雞肌肉多點(diǎn)注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各1.0ml0
[0089]3.2.2加強(qiáng)免疫接種
[0090]在基礎(chǔ)免疫后10日進(jìn)行第2次接種，產(chǎn)蛋雞肌肉多點(diǎn)注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各2.0ml0
[0091]3.2.3強(qiáng)化免疫接種[0092]在加強(qiáng)免疫后10日進(jìn)行第3次接種，產(chǎn)蛋雞肌肉多點(diǎn)注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各3.0ml0
[0093]3.2.4維持免疫接種
[0094]在強(qiáng)化免疫接種后根據(jù)抗體效價(jià)，每隔2~3個(gè)月再加強(qiáng)接種I次，產(chǎn)蛋雞肌肉多點(diǎn)注射鴨肝炎病毒SD株和JS株滅活疫苗各3.0ml0
[0095]4.1型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備
[0096]4.1高免蛋的采集
[0097]產(chǎn)蛋雞強(qiáng)化免疫接種結(jié)束后10日，每隔5日抽樣測(cè)定高免雞蛋黃中的鴨肝炎病毒抗體效價(jià)。經(jīng)中和試驗(yàn)檢測(cè)，血清I型和新型鴨肝炎病毒抗體效價(jià)均> 1:1024時(shí)收集雞蛋，置2~8°C貯存。
[0098]4.2蛋殼消毒與分離卵黃
[0099]將采集的高免蛋浸入1%。(v/v)新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘。然后用甲醛熏蒸雞蛋30分鐘。打破蛋殼，除去蛋清、胚盤(pán)和系帶，收集卵黃。
[0100]4.3 除脂
[0101]量取卵黃體積，加入滅菌玻瓶?jī)?nèi)，按其2倍體積量加0.12%海藻酸鈉溶液(按重量百分比計(jì)，含0.12% (w/w)海藻酸鈉以及0.05% (w/w) NaCl，其余為純化水)混合并調(diào)至PH5.2，置2~8°C保存過(guò)夜。
[0102]4.4 鹽析
[0103]次日，吸取上清液，調(diào)pH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28% (w/w)，再攪拌均勻。以4000r/min離心20分鐘，棄掉上清。沉淀用適量的PBS (0.15mol/L, pH7.2)溶解沉淀。
[0104]4.5抗體純化
[0105]溶解液經(jīng)截留分子量為50KD的超濾膜包過(guò)濾濃縮至原體積1/5，加入PBS(0.15mol/L, pH7.2)恢復(fù)至原體積再在進(jìn)行濃縮，反復(fù)3次，脫去硫酸銨，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存。
[0106]4.6抗體的滅活除菌
[0107]提取的卵黃抗體用滅菌生理鹽水稀釋至血清I型和新型鴨肝炎病毒抗體中和效價(jià)均≥1:512,經(jīng)終濃度為0.04% (v/v)的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過(guò)濾得到最終的卵黃抗體提取液。
[0108]5成品檢驗(yàn)
[0109]5.1性狀檢驗(yàn)
[0110]本品為略帶白色澄明液體，久置有少量沉淀。
[0111]5.2無(wú)菌檢驗(yàn)
[0112]按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)菌生長(zhǎng)。
[0113]5.3支原體檢驗(yàn)
[0114]按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》 附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)支原體生長(zhǎng)。
[0115]5.4外源病毒檢驗(yàn)
[0116]按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，無(wú)外源病毒污染。
[0117]5.5安全檢驗(yàn)
[0118]用3日齡易感雛鴨10只，各頸部皮下注射抗體2.0ml/只，觀察10日，全部健活。用體重18~22g小白鼠5只,各皮下注射抗體0.5ml/只,觀察10日，小白鼠全部健活。
[0119]5.6銨鹽殘留量測(cè)定
[0120]按現(xiàn)行《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》銨鹽檢查法進(jìn)行測(cè)定，符合規(guī)定。
[0121]按照上述方法，分別制備了三批I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體，批號(hào)為201301，201302,201303。
[0122]實(shí)施例2 I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體對(duì)I型、新型鴨肝炎的預(yù)防和治療效果
[0123]1、中和試驗(yàn)
[0124]按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》2010版附錄中和試驗(yàn)法固定病毒稀釋血清法，使用檢驗(yàn)用種毒與系列稀釋的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體(實(shí)施例1制備)中和后，分別尿囊腔接種11日齡鴨胚，連續(xù)觀察7天，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:I型和新型鴨肝炎病毒抗體中和效價(jià)均≥ 1:512。
[0125]2、攻毒保護(hù)試驗(yàn)
[0126]3個(gè)批次抗體各選取3日齡易感雛鴨200只，隨機(jī)分為1、2組，每組100只，同時(shí)選取同批次雛鴨40只，設(shè)置為對(duì)照組3、4組，每組20只。1、2組每只頸部皮下注射I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體(實(shí)施例1制備)0.5ml, 3,4組每只頸部皮下注射生理鹽水0.5ml。24小時(shí)后，1、3組每只分別頸部皮下注射鴨肝炎病毒SD株強(qiáng)毒，每只0.5ml (含1000個(gè)LD5tl);
2、4組每只分別頸部皮下注射鴨肝炎病毒JS株強(qiáng)毒，每只0.5ml (含1000個(gè)LD5tl)觀察10日。3個(gè)批次的抗體攻毒保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，卵黃抗體對(duì)I型和新型鴨肝炎強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率均達(dá)98%以上，對(duì)照組雛鴨80%以上死亡。結(jié)果表明提取的卵黃抗體對(duì)I型和新型鴨肝炎病毒有較好的攻毒保護(hù)效果。
[0127]表1 I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的攻毒保護(hù)效果
【權(quán)利要求】
1.一種卵黃抗體(egg yolk antibodies, IgY)的提取方法,其特征在于包括以下步驟: (1)收集高免蛋； (2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤(pán)和系帶，收集卵黃； (3)除脂 量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)， 按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合并調(diào)至ρΗ5.0-5.2，置2~8°C保存過(guò)夜； 其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.1-0.15%的海藻酸鈉以及0.02-0.08%的NaCl，其余為純化水； (4)鹽析 次日，吸取上清液，調(diào)PH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28%，再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉淀用PBS緩沖液溶解沉淀； (5)抗體的純化 沉淀溶解液經(jīng)截留分子量為50KD的超濾膜包過(guò)濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩沖液恢復(fù)至原體積再進(jìn)行濃縮，反復(fù)3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存； (6)抗體的滅活除菌 獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋后經(jīng)甲醛溶液滅活，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾得到最終的卵黃抗體提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然后用甲醛熏蒸30分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.12%的海藻酸鈉以及0.05%的NaCl，其余為純化水。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于步驟(6)中將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至病毒抗體中和效價(jià)≥1:512，經(jīng)終濃度為0.04%的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過(guò)濾得到最終的卵黃抗體提取液。
5.一種I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體，所述的血清I型鴨肝炎病毒為鴨甲型肝炎病毒SD株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2013年12月9日，微生物保藏編號(hào)為=CGMCCN0.8560 ;所述的新型鴨肝炎病毒為鴨甲肝病毒JS株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2012年11月13日，微生物保藏編號(hào)為=CGMCC N0.6852 ； (2)將高免蛋浸入新潔爾滅水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋殼，除去蛋清、胚盤(pán)和系帶，收集卵黃； (3)除脂 量取卵黃體積，加入滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，按其體積的1.5-2.5倍加入海藻酸鈉溶液，混合并調(diào)至ρΗ5.0-5.2，置2~8°C保存過(guò)夜； 其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.1-0.15%的海藻酸鈉以及.0.02-0.08%的NaCl，其余為純化水； (4)鹽析 次日，吸取上清液，調(diào)PH7.2，加入硫酸銨至終濃度為28%，再攪拌均勻，離心，棄掉上清，沉淀用PBS緩沖液溶解沉淀； (5)抗體的純化 沉淀溶解液經(jīng)截留分子量為50KD的超濾膜包過(guò)濾濃縮至原體積1/5，加入PBS緩沖液恢復(fù)至原體積再在進(jìn)行濃縮，反復(fù)3次，獲得卵黃抗體原液，置2~8°C保存； (6)抗體的滅活除菌 將獲得的卵黃抗體原液用滅菌生理鹽水稀釋至血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體中和效價(jià)≥1:512，經(jīng)終濃度為0.04%的甲醛溶液37°C滅活24h ;再用0.45 μ m濾膜過(guò)濾得到最終的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體提取液。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的高免蛋，經(jīng)中和試驗(yàn)檢測(cè)，血清I型鴨肝炎病毒和新型鴨肝炎病毒的抗體效價(jià)均> 1:1024。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中是將高免蛋浸入1%。新潔爾滅水溶液中消毒15分鐘，然后用甲醛熏蒸30分鐘。
8.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中按所量取的卵黃體積的2倍加入海藻酸鈉溶液，其中，所述的海藻酸鈉溶液中，按重量百分比計(jì)，含有0.12%的海藻酸鈉以及0.05 %的NaCl，其余為純化水。
9.由權(quán)利要求5-8所述的制備方法制備得到的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體。
10.權(quán)利要求9所述的I型、新型鴨肝炎二價(jià)卵黃抗體在制備預(yù)防或治療I型及/或新型鴨肝炎藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/02GK103709247SQ201310744694
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】宋揚(yáng), 王彬, 柴華, 藏玉婷, 于洪濤, 閆冰, 王昊, 陳海娟, 田野, 戴金玲 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司