一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應(yīng)用，屬于免疫快速篩檢【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過(guò)將環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的VH和VL基因進(jìn)行整合得到能同時(shí)與上述2種殘留藥物發(fā)生反應(yīng)的多特異性抗體。以此多聯(lián)特異性融合單鏈抗體為探針建立一種快速的免疫學(xué)檢測(cè)方法，從而達(dá)到一次性、快速、篩檢多種殘留藥物的目的。
【專利說(shuō)明】一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應(yīng)用，特別是一種能同時(shí)與2種殘留藥物發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)的抗體，屬于免疫快速篩檢【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的單克隆抗體由于其分子本身F。龐大結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使得其在疾病診斷和治療方面存在諸多弊端:首先傳統(tǒng)單克隆抗體的異源性使得誘發(fā)免疫反應(yīng)普遍較強(qiáng)；其次，在體內(nèi)代謝快，特異性稍差；再次，雜交瘤技術(shù)篩選的單克隆抗體多數(shù)只能保持天然抗體的活性，且挑選的抗體無(wú)中和抗原生物活性的能力，要挑選中和性抗體是相當(dāng)復(fù)雜和困難的。最后，許多特異性抗體在體內(nèi)并不能夠完全發(fā)揮其預(yù)期的凝集活性；許多優(yōu)良的抗體雜交瘤細(xì)胞株在傳代過(guò)程中穩(wěn)定性不強(qiáng)，容易丟失。再附以制備工作過(guò)程繁瑣拖沓和費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使得單克隆抗體技術(shù)的普及一度受限。
[0003]單鏈抗體，是在DNA水平上將抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账?Linker)連起來(lái)，使之在適當(dāng)生物體中表達(dá)成為一條單一肽鏈，稱為單鏈抗體(SinglechainFv, ScFv)。作為一個(gè)重要基因工程抗體,ScFv更易于在原核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和在基因水平進(jìn)行改造。對(duì)ScFv的進(jìn)一步研究中，在取得了重大進(jìn)展的同時(shí)，一些應(yīng)用于臨床出現(xiàn)的問(wèn)題也暴露出來(lái)，如親和力較低，穩(wěn)定性較差，半衰期短等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)也限制著ScFv在治療過(guò)程中的普及性。`
[0004]利用兩種不同的單鏈抗體的Vh和\基因，使其在表達(dá)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)重新組合，形成具有雙特異性的單鏈抗體，這種雙特異性單鏈抗體可以同時(shí)與兩種抗原特異性地結(jié)合。與傳統(tǒng)的雙特異性抗體相比，雙特異性單鏈抗體既保持了特異性結(jié)合抗原的特點(diǎn)，又具有以下優(yōu)點(diǎn):缺失Fe片段，減少了與FcR陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性；最大限度地降低了鼠源性蛋白，降低了免疫變態(tài)反應(yīng)的可能性；分子量小，有利于穿透腫瘤組織；避免了傳統(tǒng)制備雙特異性抗體需要進(jìn)行細(xì)胞雜交的步驟，減少了工作量，提高了制備的成功率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種環(huán)丙沙星與克倫特羅雙特異性融合抗體及其應(yīng)用，是將來(lái)源于小鼠的2種單鏈抗體的Vh和\基因進(jìn)行整合得到，含有4個(gè)抗體重鏈與4個(gè)抗體輕鏈。
[0006]所述2種單鏈抗體分別是環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體，編碼相應(yīng)抗體的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:3所示。
[0007]所述多特異性抗體，包含(a)環(huán)丙沙星單鏈抗體的Vh和 '基因片段；(b)克倫特羅單鏈抗體的單鏈抗體片段；所述片段(a)、(b)通過(guò)有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。
[0008]所述融合抗體包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域可與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域可與克倫特羅的表位結(jié)合。[0009]編碼所述融合抗體的基因序列為SEQ ID NO:1所示。
[0010]獲得所述融合抗體的方法是采用自行設(shè)計(jì)的特異性簡(jiǎn)并引物，PCR獲取環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體的Vh和\，再通過(guò)重疊PCR將重鏈輕鏈片段分別組裝成單鏈抗體，利用柔性linker串聯(lián)連接，純化后雙酶切、回收、分別連接到表達(dá)載體pGEX_6P_l，得到重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL，(構(gòu)建方案如圖2所示)轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，測(cè)序驗(yàn)證后，將重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL轉(zhuǎn)化DE3在20°C條件下培養(yǎng)表達(dá)融合抗體。
[0011]本發(fā)明所提供的多特異性融合抗體具有廣譜特異、低耗高效和靈敏便捷地同步篩檢多種殘留獸藥的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為構(gòu)建重組蛋白pET-22b_CPFX - ScFv的載體。
[0013]圖2為構(gòu)建重組蛋白pET-22b-CPFX_CL - ScFv的載體。
[0014]圖3pET-22b-CPFX-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析；
[0015](l,0h ;2，lh ;3，2h ;4，3h ;5，4h ;6，5h ；7,Marker ;8，空載體對(duì)照；9，空載體對(duì)照)。
[0016]圖4pET-22b-CL-ScFv不同時(shí)間內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析；
[0017](l，2h ;2，3h ;3，4h ;4，5h ;5，對(duì)照；6，Marker ;7，6h ;8，7h ;9，8h ;10，9h)。
[0018]圖5IPTG誘導(dǎo)表達(dá)雙特異性融合蛋白電泳圖；
[0019](I,Oh ;2，Ih ;3，2h ;4，3h ;5，4h ;6，5h ;7，6h ;8，蛋白 Marker)D
`【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1環(huán)丙沙星和克倫特羅單鏈抗體的制備
[0021]采用化學(xué)合成的方法分別獲得環(huán)丙沙星和克倫特羅單鏈抗體。編碼環(huán)丙沙星單鏈抗體、克倫特羅單鏈抗體的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示。
[0022]實(shí)施例2環(huán)丙沙星和克倫特羅單鏈抗體在pET_22b (+)原核載體中表達(dá)
[0023]利用實(shí)施例1中的2個(gè)基因與pET_22b表達(dá)系統(tǒng)，分別構(gòu)建pET-22b-CPFX_ScFV和pET-22b-CL-ScFv。以pET_22b_CPFX - ScFv的構(gòu)建為例進(jìn)行說(shuō)明，詳見(jiàn)圖1，pET-22b-CL-ScFv質(zhì)粒的構(gòu)建參見(jiàn)pET_22b_CPFX - ScFv的構(gòu)建方法。
[0024]目的基因產(chǎn)物與表達(dá)載體質(zhì)粒的雙酶切體系為如表1。雙酶切的目的片段純化回收，按表2體系連接，瞬時(shí)離心混勻于管底。4°C連接過(guò)夜，備用。
[0025]表lpET-22b-CPFX_ScFv 雙酶切體系
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種雙特異性融合抗體，其特征在于，是將來(lái)源于小鼠的2種單鏈抗體的V1^P '基因進(jìn)行整合得到；所述2種單鏈抗體分別是環(huán)丙沙星單鏈抗體和克倫特羅單鏈抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗體，其特征在于，2種單鏈抗體的Vh和\基因通過(guò)有別于組裝單鏈抗體基因的連接肽連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合抗體，其特征在于，所述融合抗體包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，第一結(jié)構(gòu)域可與環(huán)丙沙星的表位結(jié)合，第二結(jié)構(gòu)域可與克倫特羅的表位結(jié)合。
4.編碼權(quán)利要求1所述融合抗體的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
5.含有權(quán)利要求4所述基因的質(zhì)粒或細(xì)胞。
6.獲得權(quán)利要求1所述融合抗體的方法，其特征在于，是化學(xué)合成序列如SEQID NO:2, SEQ ID NO:3所示的2條單鏈抗體基因，連接表達(dá)載體pET_22b，分別構(gòu)建pET-22b-CPFX-ScFv和pET-22b-CL_ScFv ;設(shè)計(jì)合成引物，通過(guò)PCR方法從制備的2個(gè)重組質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得2個(gè)單鏈抗體的Vh和\基因片段，再通過(guò)重疊PCR組裝起來(lái)，所得目的基因純化后連接到表達(dá)載體PGEX-6P-1上，得到重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX-CPFX-CL轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)BL21 (DE3)，在20°C條件下誘導(dǎo)表達(dá)融合抗體。
7.權(quán)利要求1所述融合抗 體在殘留藥物檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/44GK103694354SQ201310749804
【公開(kāi)日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】王穎, 張東杰, 柳增善, 姚笛, 霍方珍 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)