一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法。該方法采用高壓均質(zhì)機(jī)快速破碎脾臟組織和細(xì)胞，無需凍融步驟，能更有效縮短生產(chǎn)周期；在均質(zhì)化處理后、過濾前引入有效的固液分離工藝，對(duì)物料進(jìn)行破乳，排出物料中的氣體，降低離心難度，再離心得到較清澈的上清液。明顯降低了用于膜過濾的料液固形物含量，增加了膜的過濾速率以及使用壽命，與膜過濾技術(shù)配合顯著縮短了原液生產(chǎn)周期，過程操作方便、自動(dòng)化程度高，符合規(guī)?；a(chǎn)需求。
【專利說明】一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，尤其涉及一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)移因子(Transfer factor,簡(jiǎn)稱TF)是淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的物質(zhì)，它能夠特異地將供體的細(xì)胞免疫信息轉(zhuǎn)移給受體，從而增強(qiáng)受體的免疫功能，目前其在國(guó)外已成為一種應(yīng)用廣泛的增強(qiáng)免疫制劑。
[0003]轉(zhuǎn)移因子存在于脾臟的淋巴細(xì)胞中，現(xiàn)有技術(shù)的轉(zhuǎn)移因子制備方法普遍是將動(dòng)物脾臟進(jìn)行絞碎、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使胞內(nèi)轉(zhuǎn)移因子釋放到漿液中，再將漿液中的轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行分離精制最終得到轉(zhuǎn)移因子產(chǎn)品。
[0004]動(dòng)物脾臟漿液成分復(fù)雜，因此動(dòng)物TF不易分離純化；動(dòng)物TF分子量一般在3~15KD，屬于小分子多肽，不含蛋白質(zhì)，含6種以上氨基酸；不同動(dòng)物和不同抗原特異性TF的分子量、肽分子大小和氨基酸種類略有差別；TF無熱原；TF的活性不被胰酶所破壞；TF的活性對(duì)熱不穩(wěn)定，在冷凍條件下穩(wěn)定。
[0005]鑒于以上特點(diǎn)，目前制備轉(zhuǎn)移因子的現(xiàn)有技術(shù)主要采用透析法(Laurence法)或過濾法。透析法是指對(duì)動(dòng)物脾臟勻漿的上清液進(jìn)行若干次透析，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移因子的分離純化，此法操作簡(jiǎn)單，但生產(chǎn)周期長(zhǎng)，操作費(fèi)用高，難以進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；過濾法是先對(duì)脾臟組織進(jìn)行破碎勻漿，再離心取上清液進(jìn)行過濾，實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)移因子的分離純化，此方法較透析法耗時(shí)短、機(jī)械化程度較高。
[0006]在利用過濾法制備豬脾轉(zhuǎn)移因子的實(shí)際操作中，由于提取轉(zhuǎn)移因子的原料豬脾臟經(jīng)組織絞碎，細(xì)胞破碎后所得到的物料固含量較高(在30%左右)，物料顆粒粒徑分布在20 μ m~80 μ m之間，且含有大量的脾臟筋膜，這些因素會(huì)顯著降低膜過濾效率，減少膜的使用壽命，增加生產(chǎn)時(shí)間和生產(chǎn)成本，因此現(xiàn)有技術(shù)在膜過濾之前普遍先對(duì)物料進(jìn)行預(yù)處理，即固液分離工藝。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)的固液分離操作普遍采用離心法來實(shí)現(xiàn)，但是由于經(jīng)細(xì)胞破碎的物料高度乳化，氣液固三相混合十分均一導(dǎo)致物料中固形物的密度小于液體，因此常規(guī)離心法難以對(duì)料液實(shí)現(xiàn)固液分離，進(jìn)而影響整體工藝效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為克服現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種效率更高的豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，該方法在對(duì)脾臟進(jìn)行絞碎、均質(zhì)化處理之后結(jié)合了有效的固液分離工藝，從而提升了過濾效果整體工藝效率。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，包括以下步驟:
[0011]I)將豬脾臟經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，粗絞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜總質(zhì)量0.1~0.5倍質(zhì)量的純化水,經(jīng)膠體磨充分研磨,而后繼續(xù)加入純化水直至本步驟所加入的純化水總質(zhì)量為肉糜總質(zhì)量的1.4~1.6倍為止，混合均勻，即得到勻漿待用；
[0012]2)利用高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)步驟I)得到的勻漿進(jìn)行均質(zhì)處理，均質(zhì)處理過程中漿液溫度不高于40°C，而后控溫至23~27°C，即得到待處理漿液，待用；
[0013]3)將步驟2)得到的待處理液進(jìn)行去乳化處理，得到糜狀物，待用；
[0014]4)將步驟3)得到的糜狀物進(jìn)行若干次離心，取上清液即為待過濾液，待用；
[0015]5)將步驟4)得到的待過濾液利用微濾系統(tǒng)，以0.005~0.5 μ m孔徑進(jìn)行微濾，收集濾液待用；
[0016]6)將步驟5)得到的濾液利用超濾系統(tǒng)，以4~IOKD孔徑進(jìn)行超濾，收集濾液即為轉(zhuǎn)移因子原液。
[0017]上述技術(shù)方案中，步驟3)和步驟4)可以細(xì)化為以下步驟
[0018]I)用純化水配制含有檸檬酸0.2~0.5% (w/v)、檸檬酸鈉0.1~0.25%(w/v)、氯化鈉0.1~0.25%(w/v)的溶液，控溫至23~27°C，即得到處理液，待用；
[0019]2)將上述待處理漿液與上述處理液以1:0.8~1: 1.2(v/v)的比例混合均勻，得到糜狀物，靜置I小時(shí)；
[0020]3)將靜置完畢的糜狀物用碟片式分離機(jī)進(jìn)行一次分離，過程中溫度控制在23~27 °C，取上清 液待用；
[0021]4)將上述上清液用管式離心機(jī)進(jìn)行二次分離，過程中溫度控制在23~27°C，取上清液即為待過濾液，待用；
[0022]上述技術(shù)方案中，步驟I)所述的豬脾臟為新鮮的、去除了結(jié)締組織和脂肪的豬脾臟；步驟I)第一次加入的純化水量?jī)?yōu)選為0.2倍質(zhì)量；步驟I)第二次加入的純化水量?jī)?yōu)選為0.9倍質(zhì)量；步驟2)優(yōu)選控溫至25°C ;步驟3)優(yōu)選控溫至25°C ;步驟4)的混合比例優(yōu)選為1:1 (v/v);步驟5)所述一次分離的轉(zhuǎn)速為優(yōu)選7000rpm ;步驟6)所述二次分離的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為14000rpm。
[0023]上述微濾系統(tǒng)和超濾系統(tǒng)均自市面購得，操作方法依照設(shè)備操作規(guī)程實(shí)施；純化水標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》的規(guī)定；所用試劑均自市面購得。
[0024]本發(fā)明采用高壓均質(zhì)機(jī)快速破碎細(xì)胞，無需凍融步驟，能更有效縮短生產(chǎn)周期；在均質(zhì)化處理后、過濾前引入有效的固液分離工藝，對(duì)物料進(jìn)行去乳化處理，排出物料中的氣體，降低離心難度，再離心得到較清澈的上清液。明顯降低了用于膜過濾的料液固形物含量，增加了膜的過濾速率以及使用壽命，與膜過濾技術(shù)配合顯著縮短了原液生產(chǎn)周期，過程操作方便、自動(dòng)化程度高，符合規(guī)?；a(chǎn)需求。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
[0026]I)將冷凍的豬脾臟約65.0kg表面包裝去掉，然后用純化水過夜解凍；
[0027]2)第二天使用純化水沖洗脾臟，挑揀出不合格脾臟，去除筋膜、脂肪等大塊組織；
[0028]3)稱量以6.0kg/份脾臟經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，粗絞2遍；
[0029]4)每2份混合，加入0.1倍質(zhì)量(1.2kg)的純化水，混勻，依次經(jīng)斜行齒膠體磨研磨2遍，菱形齒膠體磨研磨I遍，放入潔凈盛料桶，共裝5桶；剩余脾臟回收冷凍保存；
[0030]5)每桶加入1.4倍質(zhì)量(16.8kg)的純化水，攪拌制成勻漿；[0031]6)勻漿經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁，均質(zhì)I遍，在線控制漿液溫度處于35~40°C，而后控溫至23°C，即得到待處理漿液，待用；
[0032]7)用純化水配制含有檸檬酸0.2% (w/v)、檸檬酸鈉0.1% (w/v)、氯化鈉0.1% (w/v)的溶液，控溫至23°C，即得到處理液，待用；
[0033]8)將步驟6)得到的待處理漿液與步驟7)得到的處理液以1:0.8(v:v=99L:79.2L)混合混勻，得到糜狀物，靜置Ih ；
[0034]9)將步驟8)得到的糜狀物用碟片式分離機(jī)以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心，過程中溫度控制在25 °C，取上清液待用；
[0035]10)將步驟9)得到的上清液用管式離心機(jī)以12000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行二次離心，過程中溫度控制在26°C，控制進(jìn)料速度在400L/h，如物料升溫過快則用管式離心機(jī)自帶降溫裝置通4°C冷卻水進(jìn)行降溫，控制物料溫度在35°C，離心完畢取上清液即為待過濾液，待用；
[0036]11)按照微濾系統(tǒng)(孔徑150KD，天津膜天膜工程技術(shù)有限公司)操作規(guī)程，進(jìn)行微濾液收集，收集30L微濾液，不斷加入純化水稀釋，直至收集300L微濾液；
[0037]12)按照超濾系統(tǒng)(孔徑4KD，天津膜天膜工程技術(shù)有限公司)操作規(guī)程，微濾液濃縮，收集透過液共310kg，即為轉(zhuǎn)移因子原液。
[0038]實(shí)施例2
[0039]I)將冷凍的豬脾臟約65.0kg表面包裝去掉，然后用純化水過夜解凍；
[0040]2)第二天使用純`化水沖洗脾臟，挑揀出不合格脾臟，去除筋膜、脂肪等大塊組織；[0041 ] 3)稱量以6.0kg/份脾臟經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，粗絞2遍；
[0042]4)每2份混合，加入0.25倍質(zhì)量(3kg)的純化水，混勻，依次經(jīng)斜行齒膠體磨研磨2遍，菱形齒膠體磨研磨I遍，放入潔凈盛料桶，共裝5桶；剩余脾臟回收冷凍保存；
[0043]5)每桶加入1.15倍質(zhì)量(13.8kg)的純化水，攪拌制成勻漿；
[0044]6)勻漿經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁，均質(zhì)2遍，在線控制漿液溫度處于30~35°C，而后控溫至25°C，即得到待處理漿液，待用；
[0045]7)用純化水配制含有檸檬酸0.35% (w/v)、檸檬酸鈉0.2% (w/v)、氯化鈉0.2% (w/v)的溶液，控溫至25°C，即得到處理液，待用；
[0046]8)將步驟6)得到的待處理漿液與步驟7)得到的處理液以1:1 (v: v=150L: 150L)混合混勻，得到糜狀物，靜置Ih ；
[0047]9)將步驟8)得到的糜狀物用碟片式分離機(jī)以7000rpm的轉(zhuǎn)速離心，過程中溫度控制在23 °C，取上清液待用；
[0048]10)將步驟9)得到的上清液用管式離心機(jī)以HOOOrpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行二次離心，過程中溫度控制在24°C，控制進(jìn)料速度在400L/h，如物料升溫過快則用管式離心機(jī)自帶降溫裝置通4°C冷卻水進(jìn)行降溫，控制物料溫度在35°C，離心完畢取上清液即為待過濾液，待用；
[0049]11)按照微濾系統(tǒng)(孔徑200KD，天津膜天膜工程技術(shù)有限公司)操作規(guī)程，進(jìn)行微濾液收集，收集30L微濾液，不斷加入純化水稀釋，直至收集300L微濾液；
[0050]12)按照超濾系統(tǒng)(孔徑6KD，天津膜天膜工程技術(shù)有限公司)操作規(guī)程，微濾液濃縮，收集透過液共289kg，即為轉(zhuǎn)移因子原液。
[0051]實(shí)施例3
[0052]I)將冷凍的豬脾臟約65.0kg表面包裝去掉，然后用純化水過夜解凍；[0053]2)第二天使用純化水沖洗脾臟，挑揀出不合格脾臟，去除筋膜、脂肪等大塊組織；
[0054]3)稱量以6.0kg/份脾臟經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，粗絞2遍；
[0055]4)每2份混合，加入0.5倍質(zhì)量(6kg)的純化水，混勻，依次經(jīng)斜行齒膠體磨研磨2遍，菱形齒膠體磨研磨I遍，放入潔凈盛料桶，共裝5桶；剩余脾臟回收冷凍保存；
[0056]5)每桶加入1.1倍質(zhì)量(13.2kg)的純化水，攪拌制成勻漿；
[0057]6)勻漿經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行破壁，均質(zhì)3遍，在線控制漿液溫度處于25~30°C，而后控溫至27°C，即得到待處理漿液，待用；
[0058]7)用純化水配制含有檸檬酸0.5% (w/v)、檸檬酸鈉0.25% (w/v)、氯化鈉0.25% (w/v)的溶液，控溫至27°C，即得到處理液，待用；
[0059]8)將步驟6)得到的待處理漿液與步驟7)得到的處理液以1: 1.2(v:v=225L:270L)混合混勻，得到糜狀物，靜置Ih ；
[0060]9)將步驟8)得到的糜狀物用碟片式分離機(jī)以SOOOrpm的轉(zhuǎn)速離心，過程中溫度控制在27 °C，取上清液待用；
[0061]10)將步驟9)得到的上清液用管式離心機(jī)以16000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行二次離心，過程中溫度控制在27°C，控制進(jìn)料速度在400L/h，如物料升溫過快則用管式離心機(jī)自帶降溫裝置通4°C冷卻水進(jìn)行降溫，控制物料溫度在35°C，離心完畢取上清液即為待過濾液，待用；
[0062]11)按照微濾系統(tǒng)(孔徑0.5μπι，上海立昌環(huán)境工程有限公司)操作規(guī)程，進(jìn)行微濾液收集，收集30L微濾液，不斷加入純化水稀釋，直至收集300L微濾液；
[0063]12)按照超濾系統(tǒng)(孔徑 10KD，天津膜天膜工程技術(shù)有限公司)操作規(guī)程，微濾液濃縮，收集透過液共308kg，即為轉(zhuǎn)移因子原液。
[0064]以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，包括以下步驟: 1)將豬脾臟經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，粗絞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜總質(zhì)量0.1~0.5倍質(zhì)量的純化水，經(jīng)膠體磨充分研磨，而后繼續(xù)加入純化水直至本步驟所加入的純化水總質(zhì)量為肉糜總質(zhì)量的1.4~1.6倍為止，混合均勻，即得到勻漿待用； 2)利用高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)步驟I)得到的勻漿進(jìn)行均質(zhì)處理，均質(zhì)處理過程中漿液溫度不高于40°C，而后控溫至23~27°C，即得到待處理漿液，待用； 3)將步驟2)得到的待處理液進(jìn)行去乳化處理，得到糜狀物，待用； 4)將步驟3)得到的糜狀物進(jìn)行若干次離心，取上清液即為待過濾液，待用； 5)將步驟4)得到的待過濾液利用微濾系統(tǒng)，以0.005~0.5 μ m孔徑進(jìn)行微濾，收集濾液待用； 6)將步驟5)得到的濾液利用超濾系統(tǒng)，以4~IOKD孔徑進(jìn)行超濾，收集濾液即為轉(zhuǎn)移因子原液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將豬脾臟經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，粗絞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜總質(zhì)量0.1~0.5倍質(zhì)量的純化水，經(jīng)膠體磨充分研磨，而后繼續(xù)加入純化水直至本步驟所加入的純化水總質(zhì)量為肉糜總質(zhì)量的1.4~1.6倍為止，混合均勻，即得到勻漿待用； 2)利用高壓均質(zhì)機(jī)對(duì)步驟I)得到的勻漿進(jìn)行均質(zhì)處理，均質(zhì)處理過程中漿液溫度不高于40°C，而后控溫至23~27°C，即得到待處理漿液，待用； 3)用純化水配制含有檸檬酸0.2~0.5%(w/v)、檸檬酸鈉0.1~0.25%(w/v)、氯化鈉0.1~0.25%(w/v)的溶液，控溫至23~27°C，即得到處理液，待用； 4)將步驟2)得到的待處理漿液與步驟3)得到的處理液以1:0.8~1:1.2(ν/ν)的比例混合均勻，得到糜狀物，靜置I小時(shí)； 5)將步驟4)靜置完畢的糜狀物用碟片式分離機(jī)進(jìn)行一次分離，過程中溫度控制在23~27 °C，取上清液待用； 6)將步驟5)得到的上清液用管式離心機(jī)進(jìn)行二次分離，過程中溫度控制在23~27°C，取上清液即為待過濾液，待用； 7)將步驟6)得到的待過濾液利用微濾系統(tǒng)，以0.005~0.5 μ m孔徑進(jìn)行微濾，收集濾液待用； 8)將步驟7)得到的濾液利用超濾系統(tǒng)，以4~IOKD孔徑進(jìn)行超濾，收集濾液即為轉(zhuǎn)移因子原液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法，其特征在于步驟I)所述的豬脾臟為新鮮的、去除了結(jié)締組織和脂肪的豬脾臟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟I)第一次加入的純化水量為0.2倍質(zhì)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟I)第二次加入的純化水量為0.9倍質(zhì)量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟2)控溫至25。。。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟3)控溫至25℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟4)的混合比例為1:1 (v/v)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟5)所述一次分離的轉(zhuǎn)速為7000rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種豬脾轉(zhuǎn)移因子提取方法，其特征在于步驟6)所述二次分離的轉(zhuǎn)速為14000rpm。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK103724420SQ201310755121
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】楊燚, 蘇建東, 王尚尚, 王甜, 田鳳菊, 李建麗, 吳全忠, 楊保收, 李守軍 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司