針對細胞內(nèi)靶分子的結(jié)合劑的制作方法
【專利摘要】本申請?zhí)峁┝税辽僖粋€Alphabody或基本由其組成的多肽，其中所述Alphabody能夠被內(nèi)化入細胞并且特異性結(jié)合細胞內(nèi)靶分子。本申請還提供了編碼這樣的多肽的核酸；用于制備這樣的多肽的方法；表達或能夠表達這樣的多肽的宿主細胞；包含這樣的多肽、核酸和/或宿主細胞的組合物，特別地藥物組合物；以及這樣的多肽、核酸、宿主細胞和/或組合物的用途，特別地用于預(yù)防性、治療性或診斷性目的的用途。
【專利說明】針對細胞內(nèi)靶分子的結(jié)合劑 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請涉及針對細胞內(nèi)祀分子，更具體地針對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，例如參與細胞凋亡 和受控細胞死亡的蛋白質(zhì)的結(jié)合劑的領(lǐng)域。本申請還涉及這樣的結(jié)合劑用于預(yù)防、治療或 診斷目的以及用于篩查和檢測的用途。
[0002] 背景
[0003] 與細胞的細胞內(nèi)組分的相互作用需要預(yù)期與這樣的細胞內(nèi)組分相互作用的藥劑 穿過細胞膜。
[0004] 在治療領(lǐng)域，大分子（例如多肽和核酸）一直為主要焦點，因為對于許多疾病，小 分子藥物（即包含少于100個原子的化合物）極難被發(fā)現(xiàn)和/或開發(fā)。大分子用作治療劑 的用途具有優(yōu)于小化學藥物的許多有利方面，最重要的有利方面是能夠采用大的穩(wěn)定的三 維構(gòu)象，所述三維構(gòu)象適合于對靶的強結(jié)合，從而允許干擾與難以使用小分子實現(xiàn)的天然 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-核酸界面。此外，大分子的穩(wěn)定性、尺寸和復雜性可導致使用小 分子不容易實現(xiàn)的特異性。
[0005] 然而，巨大的困難是這樣的大分子不能擴散進入細胞，從而雖然絕大部分疾病目 標靶位于細胞內(nèi)，但大多數(shù)大分子治療劑僅能夠針對細胞外靶。
[0006] 雖然已發(fā)展了促進或增強大分子的細胞內(nèi)化的不同策略，但它們的適用性受到限 制，因為這些方法利用內(nèi)化的細胞機制，例如胞吞作用。這些細胞內(nèi)化機制導致作用子在內(nèi) 體或溶酶體中的積累，最終導致作用子化合物的蛋白酶降解和失活。
[0007] 已描述的解決這些問題的一種策略是產(chǎn)生經(jīng)裝訂肽（hydrocarbon stapled peptide)。該概念基于這樣的事實：蛋白酶僅在肽基本上以未折疊狀態(tài)存在時才能識別和 降解它們。已發(fā)現(xiàn)，當被鎖入某些折疊狀態(tài)時，肽在很大程度上得到保護而免于蛋白酶攻 擊。然而化學裝訂法需要復雜的化學合成。
[0008] 因此，雖然過去已努力將（多）肽遞送至細胞并使它們形成在細胞內(nèi)環(huán)境中賦予 它們穩(wěn)定性和對蛋白酶的抗性的穩(wěn)定狀態(tài)，但生物活性的丟失、不充足的滲入細胞的能力 (雖然維持功能性）或復雜的制造過程已阻礙了作用于細胞內(nèi)組分的生物治療劑的成功開 發(fā)。
[0009] Alphabody是具有10至14kDa分子量的單鏈、三鏈卷曲螺旋蛋白質(zhì)。已開發(fā)了以 高親和力結(jié)合特異性分子靶的Alphabody(W02011003935，W02011003936)。然而，迄今為止， 僅開了抗細胞外祀的Alphabody。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本申請?zhí)峁┝丝蛇x擇的改善的結(jié)合劑，特別地多肽，所述結(jié)合劑
[0012] (1)能夠穿過細胞膜，
[0013] ⑵在細胞內(nèi)環(huán)境中高度穩(wěn)定，和
[0014] (3)能夠特異性結(jié)合細胞中的細胞內(nèi)靶分子。更具體地，結(jié)合劑從而能夠高效地抑 制或至少調(diào)節(jié)相關(guān)細胞內(nèi)靶分子在其中起作用的生物學機制和/或信號傳導途徑。
[0015] 在第一方面，提供了包含至少一種Alphabody或基本上由至少一種Alphabody組 成的多肽，其中所述多肽能夠被內(nèi)化入細胞，并且特異性結(jié)合該細胞中的細胞內(nèi)靶分子。事 實上，已發(fā)現(xiàn)Alphabody結(jié)構(gòu)可用于產(chǎn)生被細胞高效攝入并用作這些細胞內(nèi)的細胞內(nèi)革巴的 穩(wěn)定和特異性結(jié)合劑的多肽。
[0016] 在某些實施方案中，本文中提供的多肽包含確保它們能夠進入細胞的序列，在所 述細胞中它們可與目標靶蛋白相互作用。因此，本文中設(shè)想的多肽包含確保它們能夠穿過 細胞膜或增強它們的細胞進入的序列。
[0017] 因此，已專門設(shè)計了本文中提供的多肽，即它們的結(jié)構(gòu)相較于現(xiàn)有技術(shù)的 Alphabody序列已被修飾，從而允許使多肽內(nèi)化入細胞。
[0018] 具體地，本文中提供的多肽可包含修飾來允許通過例如（但不限于）如下方式來 進行細胞內(nèi)化：（i)Alphabody序列與至少一個允許內(nèi)化入細胞的基團、部分、蛋白質(zhì)或肽 的融合或綴合，和/或（ii)通過一個或多個含氨基酸殘基基序或氨基酸殘基模式的內(nèi)化區(qū) 域在Alphabody序列內(nèi)的存在。
[0019] 在某些具體實施方案中，本文中提供的多肽包含至少一個Alphabody或基本上由 至少一個Alphabody組成，所述Alphabody主要通過存在于Alphabody上的結(jié)合位點而特 異性結(jié)合細胞內(nèi)靶分子。
[0020] 在一些具體實施方案中設(shè)想的Alphabody和多肽可特異性結(jié)合的細胞內(nèi)靶分子 的實例包括例如但不限于參與細胞過程的蛋白質(zhì)，所述細胞過程選自細胞信號傳導、細胞 信號轉(zhuǎn)導、細胞和分子運輸（例如主動運輸或被動運輸）、滲透、吞噬作用、自噬、細胞衰老、 細胞粘附、細胞運動、細胞遷移、胞質(zhì)流、DNA復制、蛋白質(zhì)合成、增殖（例如細胞周期、減數(shù) 分裂、有絲分裂、分裂間期、胞質(zhì)分裂）、細胞代謝（例如糖酵解和呼吸、能量供應(yīng)）、細胞通 訊、DNA修復、細胞凋亡和程序化細胞死亡。
[0021] 在一些具體實施方案中，某些實施方案中設(shè)想的Alphabody和多肽可特異性結(jié)合 的細胞內(nèi)靶分子包括細胞內(nèi)蛋白，所述細胞內(nèi)蛋白天然地參與在真核細胞例如動物細胞， 具體地哺乳動物細胞或人細胞中發(fā)生的過程。
[0022] 由于本文中設(shè)想的多肽具有影響細胞內(nèi)部的細胞內(nèi)靶的生物功能的潛能，因此它 們特別適合用于許多疾病適應(yīng)征的醫(yī)學應(yīng)用，即診斷、治療或預(yù)防性應(yīng)用。
[0023] 本文中設(shè)想的多肽具有針對細胞內(nèi)靶（即一類對于兩個主要種類的治療藥物即 小的化學藥物和治療性抗體來說是"無藥可及的"蛋白質(zhì)）的潛能。事實上，所有已知的人 蛋白靶中大部分不能被小的化學藥物或生物制品尋找到。小的化學藥物通常與疏水口袋相 互作用，這將它們的靶空間限定于約10%的所有人蛋白質(zhì)；類似地，生物制品（即基于蛋白 質(zhì)的治療劑如抗體）缺乏穿過細胞膜的能力，從而僅可尋找到另外10% (作為細胞外蛋白 質(zhì)存在的那些靶蛋白）。這意味著在所有治療領(lǐng)域內(nèi)、所有潛在（主要地細胞內(nèi)）蛋白靶中 絕大部分（據(jù)估計>80%)目前被認為對于兩個主要已知種類的治療藥物來說是"無藥可 及的"。
[0024] 此外，許多細胞內(nèi)蛋白屬于最吸引人的種類的潛在藥物靶，即參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì) 間相互作用的蛋白質(zhì)。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用調(diào)節(jié)眾多種必需細胞過程，所述細胞過程 中的許多過程已知牽涉重要的疾病過程，例如引起癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或代謝疾病的 那些過程。本文中公開的多肽經(jīng)顯示具有細胞內(nèi)穿透的能力并且在細胞內(nèi)保持穩(wěn)定以及在 細胞中結(jié)合其靶。因此，它們代表了用于調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的獨特工具以及用 作可尋找到大量牽涉廣泛疾病的目前"無藥可及的"靶的治療劑。
[0025] 其它方面提供了本文中描述的多肽用作藥劑，更具體地在用于治療與其中牽涉細 胞內(nèi)靶分子的生物途徑或生物相互作用相關(guān)的疾病或障礙的方法中用作藥劑的用途。
[0026] 癌癥是例如其中對新型治療選擇的需求很高以及其中對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì) 相互作用的調(diào)節(jié)的時機特別迫切的一個疾病領(lǐng)域。許多良好確定的癌基因是細胞內(nèi)蛋白并 且通常是"無藥可及的"的靶，即不能被高效靶向以用于治療或診斷性應(yīng)用的蛋白質(zhì)。這些 靶的實例有屬于BCL-2家族（細胞凋亡的調(diào)節(jié)劑）的蛋白。本文中描述的多肽代表了在尋 找這樣的靶的能力上很獨特的新型藥物開發(fā)平臺。
[0027] 因此，在具體實施方案中，提供了包含至少一個Alphabody的多肽，所述 Alphabody能夠被細胞內(nèi)化，其中所述至少一種Alphabody特異性結(jié)合細胞凋亡或抗細 胞凋亡細胞內(nèi)蛋白，具體地BCL-2蛋白家族的抗細胞凋亡成員，例如選自MCL-1、BCL-2、 BCL-2a、BCL-XL、BCL-w 和 BFL-1/A1 的蛋白。
[0028] 在其它具體實施方案中，所述多肽的特征在于它們特異性結(jié)合MCL-1并且包含選 自SEQ ID N0 :1至16、26和27的序列。
[0029] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1的多肽，其中所 述多肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :4至16、26和27的序列。
[0030] 在具體實施方案中，在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié) 合MCL-1的多肽，其所述多肽的特征在于它們包含與SEQ ID N0:19中定義的多肽序列 (MSIEEITKQIAAIQLRIVGDQVQIYAMT)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更高 序列同一性的序列。
[0031] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1的多肽，其中所 述多肽的特征在于它們包含SEQ ID N0 :20中定義的序列（LRXVGDXV)。
[0032] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合BCL_2a的多肽，其中多 肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :26和27的序列。
[0033] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合BCL-XL的多肽，其中多 肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :26和27的序列。
[0034] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1、BCL_2a和/ 或BCL-XL的多肽，其中多肽的特征在于它們包含與SEQ ID N0:29中定義的多肽序列 (MSIEEIAAQIAAIQLRII⑶QFNIYYMT)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更高 序列同一性的序列。
[0035] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1、BCL_2a和/或 BCL-XL的多肽，其中多肽的特征在于它們包含SEQ ID N0 :30中定義的序列（LRII⑶QF)。
[0036] 在其它方面，提供了包含至少一種本文中描述的多肽和任選地一種或多種藥學上 可接受的載體的藥物組合物。
[0037] 在其它方面，還提供了用于產(chǎn)生本文中描述的一種或多種多肽的方法，其至少包 括以下步驟：
[0038] a)產(chǎn)生一種或多種包含至少一種Alphabody或基本上由至少一種Alphabody組成 的多肽，所述至少一種Alphabody經(jīng)修飾而允許多肽內(nèi)化入細胞，
[0039] b)測試多肽是否具有可檢測的對于細胞內(nèi)靶分子的結(jié)合親和力，和任選地
[0040] c)分離所述一種或多種多肽。
[0041] 如根據(jù)本文中公開的其它詳細說明和實施例將變得清楚的，本發(fā)明人已顯示可提 供包含至少一種Alphabody的多肽，所述多肽可高效地穿過細胞膜，在細胞內(nèi)環(huán)境中保持 穩(wěn)定，并且可有效地特異性地結(jié)合位于細胞內(nèi)的細胞內(nèi)靶并影響其功能。如本文中進一步 顯示的，本文中描述的多肽可用于治療各種疾病適應(yīng)征，例如癌癥，其通過特異性調(diào)節(jié)與這 樣的疾病適應(yīng)征相關(guān)的細胞內(nèi)靶的功能和/或通過影響其中細胞內(nèi)靶參與的生物（信號轉(zhuǎn) 導）途徑來進行。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] [定義]
[0044] 如本文中所用，除非明確地另有所指，否則單數(shù)形式"一個/ 一種（a) "、"一個/ 一 種（an)"和"所指物（the)"包括單數(shù)和復數(shù)所指物。
[0045] 如本文中所用，術(shù)語"包含"、"包括"和"由……組成"與"包括（including)"，包 含（includes)"或"含有（containing) "、"包含（contains)"同義，并且是包含在內(nèi)的或開 放式，并且不排除另外的未指明的成員、組件或方法步驟。
[0046] 通過端點表示的數(shù)值范圍包括包含在各自范圍內(nèi)的所有數(shù)字和部分以及所記載 的端點。
[0047] 如本文中所用，術(shù)語"約"當指可測量的值例如參數(shù)、量、時間長度等時，意欲包括 距離指定值的+/-10 %或更小，優(yōu)選+/_5 %或更小，更優(yōu)選+/-1 %或更小，更優(yōu)選+/_0. 1 % 或更小的變化，只要在這個范圍內(nèi)這樣的變化適合在本公開發(fā)明中進行。應(yīng)理解，修飾詞 "約"所指的值本身也被明確地和優(yōu)選地公開。
[0048] 如本文中所用，"Alphabody"或"Alphabody結(jié)構(gòu)"通?？啥x為自我折疊的單鏈 的三鏈體、主要地α-螺旋、卷曲螺旋氨基酸序列、多肽或蛋白質(zhì)。更具體地，如本文中所 用，Alphabody或Alphabody結(jié)構(gòu)可被定義為具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的氨基酸序 列、多肽或蛋白質(zhì)，其中HRS1、HRS2和HRS3的每一個獨立地是由2至7個連續(xù)七肽重復單 位組成的七肽重復序列（HRS)，至少50 %的所有七肽a-和d-位置處被異亮氨酸殘基占據(jù)， 每一個HRS始于和終于位于七肽a-或d-位置之一處的脂肪族或芳香族氨基酸殘基，并且 HRSUHRS2和HRS3 -起形成三鏈體α -螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；并且L1和L2的每一個獨立地 是接頭片段，如在下文中進一步定義的，其分別地將HRS1共價連接于HRS2和將HRS2共價 連接于HRS3。
[0049] 如本文中所用，"平行Alphabody "將具有其中三鏈體α -螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu) 的α-螺旋一起形成平行卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（即其中所有3個α-螺旋平行的卷曲螺旋）的 Alphabody (結(jié)構(gòu)）含義。
[0050] 如本文中所用，"反向平行Alphabody"將具有其中三鏈體α -螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu) 的螺旋一起形成反向平行卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（即其中兩個螺旋平行并且第三螺旋 相對于這兩個螺旋是反向平行的卷曲螺旋）的Alphabody (結(jié)構(gòu)）含義。
[0051] 如根據(jù)本文中的進一步說明將變得清楚的，本申請還設(shè)想了包含具有通式 HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的序列的多肽，但所述多肽在某些具體實施方案中包含其它 基團、部分和/或殘基，其共價連接于，更具體地N-和/或C-末端共價連接于具有式 HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的基本Alphabody結(jié)構(gòu)。因此在本文中通稱為包含Alphabody 的"(Alphabody)多肽"。針對本文中的Alphabody描述的結(jié)合性質(zhì)通常也可用于包所述 Alphabody的Alphabody多肽。本文中設(shè)想的Alphabody多肽的特征在于存在至少一個如 此形成卷曲螺旋的三螺旋結(jié)構(gòu)（由3個螺旋組成的）。
[0052] 術(shù)語"七肽"、"七肽單位"或"七肽重復單位"在本文中可互換使用，并且在本文中 將具有7個殘基的（多）肽片段的含義，所述肽片段在本文中設(shè)想的Alphabody、多肽或組 合物的每一個七肽重復序列內(nèi)重復2或更多次，并且表示為"abcdefg"或"defgabc"，其中 符號"a"至"g"表示常規(guī)七肽位置。例如，通過使用專門的軟件例如Lupas等人的COILS 法(Sciencel991, 252:1162-1164 ；http://www.russell. embl-heidelberg. de/cgi-bin/ coils-svr.pl)將常規(guī)七肽位置賦予存在于本文中設(shè)想的Alphabody、多肽或組合物中的 七肽、七肽單位或七肽重復單位內(nèi)的特定氨基酸殘基。然而，應(yīng)注意，存在于本文中設(shè)想的 Alphabody (或本文中設(shè)想的包含這些Alphabody的多肽和組合物）中的七肽或七肽單位并 不嚴格限定于上述代表（即"abcdefg"或"defgabc"），這根據(jù)本文中的進一步說明將變得 明了，并且在它們最廣的意義上本身構(gòu)成了 7個殘基的（多）肽片段，包括至少可分配的七 肽位置a和d。
[0053] 術(shù)語"七肽a-位置"、"七肽b-位置"、"七肽c-位置"、"七肽d-位置"、"七肽e-位 置"、"七肽位置"和"七肽g_位置"分別指本文中設(shè)想的Alphabody、多肽或組合物的七 肽、七肽重復或七肽重復單位中的常規(guī)"a"、"b"、"c"、"d"、"e"、"f"和"g"氨基酸位置。
[0054] 如本文中所用，七肽基序具有7個殘基的（多）肽模式的含義。類型"abcdefg" 的七肽基序通常可表示為"HPPHPPP"，而類型"defgabc"的七肽基序通?？杀硎緸?"HPPPHPP"，其中符號"H"表示非極性或疏水性氨基酸殘基，符號"P"表示極性或親水性氨 基酸殘基。然而，應(yīng)指出，存在于本文中設(shè)想的Alphabody (或包含這些Alphabody的多肽 或組合物）中的七肽基序并非嚴格限定于上述代表（即"abcdefg"、"HPPHPPP"、"d efgabc" 和"HPPPHPP "），這根據(jù)本文中的進一步說明將變得明了。
[0055] 如本文中所用，"七肽重復序列"（"HRS"）應(yīng)當具有由η個連續(xù)七肽組成的氨基酸 序列或序列片段的含義，其中η為等于或大于2的數(shù)。
[0056] 在Alphabody (如本文中定義的）的單鏈結(jié)構(gòu)的上下文中，術(shù)語"接頭"、"接頭片 段"或"接頭序列"在本文中可互換使用，意指作為單鏈Alphabody的連續(xù)氨基酸序列的部 分、并且與該Alphabody的HRS序列共價互連的氨基酸序列片段。
[0057] 在本說明書中，"卷曲螺旋"或"卷曲螺旋結(jié)構(gòu)"在本文中可互換使用，并且基 于共同的一般知識和說明以及本文中引用的其它參考資料對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 將是很清楚的。在這一點上特別地參考關(guān)于卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的綜述論文，例如Cohen和 Parry Proteinsl990, 7:1-15 ；Kohn and Hodges Trends Biotechnol1998, 16:379-389 ； Schneider 等人 Fold Desl998, 3:R29-R40 ;Harbury 等人 Sciencel998, 282:1462-1467 ; Mason 和 Arndt ChemBioChem2004,5:170-176 ;Lupas 和 Gruber Adv Protein Chem2005, 70:37-78 ;Woolfson Adv Protein Chem2005, 70:79-112 ;Parry 等人 J Struct Biol2008, 163:258-269 ;McFarlane 等人 Eur J Pharmacol2009:625:101-107。
[0058] "Alphabody的a -螺旋部分"在本文中將具有擁有a -螺旋二級結(jié)構(gòu)的Alphabody 的該部分的含義。此外，具有α-螺旋二級結(jié)構(gòu)的Alphabody完全部分的任何部分也 被當作是Alphabody的α-螺旋部分。更具體地，在結(jié)合位點的上下文中，在其中位于 Alphabody的α -螺旋部分中的一個或多個氨基酸促成該結(jié)合位點時該結(jié)合位點被認為是 由Alphabody的α -螺旋部分形成的。
[0059] Alphabody的α螺旋的"溶劑定向（solvent-oriented) "或"暴露于溶劑的 (solvent-exposed) "區(qū)域在本文中將具有被直接暴露或直接與其所存在于其中的溶劑、環(huán) 境、外圍環(huán)境或背景接觸的Alphabody的該部分的含義。此外，被直接暴露或與溶劑直接 接觸的Alphabody完全部分的任何部分也被視作Alphabody的溶劑定向或暴露于溶劑的區(qū) 域。更具體地，在結(jié)合位點的上下文中，在其中位于Alphabody的溶劑定向部分中的一個或 多個氨基酸促成結(jié)合位點時該結(jié)合位點被認為是由Alphabody的溶劑定向部分形成的。
[0060] 術(shù)語"Alphabody的溝"在本文中將具有Alphabody上的對應(yīng)于通過Alphabody內(nèi) 空間上相鄰α-螺旋的任何對所形成的凹陷的溝樣局部形狀的該部分的含義。
[0061] 如本文中所用，氨基酸殘基將以它們的全名或根據(jù)標準3字母或單字母氨基酸代 碼來顯示。
[0062] 如本文中所用，術(shù)語"同源性"表示來自相同或不同分類群的兩個大分子之間，具 體地兩個多肽或多核苷酸之間的至少二級結(jié)構(gòu)相似性，其中所述相似性歸因于共有的祖 先。因此，術(shù)語"同源物"表示具有所述二級和任選地三級結(jié)構(gòu)相似性的這樣相關(guān)的大分 子。為了比較兩個或更多個核苷酸序列，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過將 第一核苷酸序列中與第二核苷酸序列內(nèi)對應(yīng)位置上的核苷酸相同的核苷酸的數(shù)目除以第 一核苷酸序列中核苷酸的總數(shù)，然后乘以100%，或通過使用用于序列比對的已知計算機算 法例如NCBI Blast來計算第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間的"（百分比）序列同 一性"。在測定兩個Alphabody之間的序列同一性的程度中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可考慮所謂的 "保守"氨基酸置換，所述保守氨基酸置換通?？杀幻枋鰹槠渲邪被釟埢涣硪粋€具有相 似化學結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基替代并且對多肽的功能、活性或其它生物性質(zhì)幾乎沒有影響或基 本上無影響的氨基酸置換?？赡艿谋Ｊ匕被嶂脫Q對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是很明了 的。Alphabody和核酸序列如果在它們的整個長度上具有100%的序列同一性的話，它們被 認為是"完全相同的"。
[0063] 當（Alphabody)多肽或Alphabody具有對于特定祀（或?qū)τ谄渲辽俨糠只蚱危?的親和力，特異性和/或特異性抗所述靶時，該Alphabody或多肽被認為"特異性結(jié)合"該 靶。
[0064] 如本文中所用，Alphabody或多肽的結(jié)合的"特異性"可基于親和力和/或親合力 來測定。Alphabody或多肽的"親和力"通過Alphabody或多肽與其結(jié)合的目標祀蛋白解離 的平衡常數(shù)來表示。KD值越低，Alphabody或多肽與其結(jié)合的目標靶蛋白之間的結(jié)合強度 越強。或者，還可通過親和力常數(shù)（KA)來表達親和力，所述親和力常數(shù)對應(yīng)于1/KD。取決 于具體的目標靶蛋白，Alphabody或多肽的結(jié)合親和力可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式 來測定。在本領(lǐng)域通常已知KD可表達為復合物的解離速率常數(shù)（表示為kOff (以秒4或 s4表示））對其締合速率常數(shù)（表示為kOn (以molaf1秒η或Μ?表示））的比率。大于 約1毫摩爾濃度的KD值通常被認為表示不結(jié)合或非特異性結(jié)合。
[0065] Alphabody或多肽針對給定的靶的的"親合力"是Alphabody或多肽與給定的目標 靶蛋白之間的結(jié)合強度的量度。親合力與目標靶蛋白上的結(jié)合位點和Alphabody或多肽上 的結(jié)合位點之間的親和力以及存在于Alphabody或多肽上的相關(guān)結(jié)合位點的數(shù)目相關(guān)。
[0066] 當Alphabody或多肽以為該Alphabody或多肽用以結(jié)合第二目標祀蛋白的親和力 的至少5倍，例如至少10倍，例如至少100倍，優(yōu)選至少1000倍的親和力結(jié)合第一目標靶 蛋白時，所述Alphabody或多肽被認為是"相對于第二目標靶蛋白而言對于第一目標靶蛋 白是特異性的"。因此，在某些實施方案中，當Alphabody或多肽被認為是相對于第二目標 靶蛋白而言"特異于"第一目標靶蛋白時，其可特異性結(jié)合（如本文中定義的）第一目標靶 蛋白，但不特異性結(jié)合第二目標靶蛋白。
[0067] Alphabody或多肽的"半衰期"通?？杀欢x為Alphabody或多肽的體內(nèi)血清或 血漿濃度減小至50%所需的時間?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式，例如通過藥代 動力學分析來測定Alphabody或多肽的體內(nèi)半衰期。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將很明了 的，可使用參數(shù)如tl/2-α Ul/2-β和曲線下面積（AUC)來表達半衰期。通常地，增加的體 內(nèi)半衰期的特征在于參數(shù)tl/2-α Ul/2-β和曲線下面積AUC)中一個或多個、優(yōu)選地所有 3個參數(shù)的增加。
[0068] 如本文中所用，術(shù)語"抑制"、"減弱"和/或"阻止"可指本文中設(shè)想的多肽（的用 途），所述多肽特異性結(jié)合目標靶蛋白并且抑制、減弱和/或阻止目標靶蛋白與其天然結(jié)合 伴侶之間的相互作用。術(shù)語"抑制"、"減弱"和/或"阻止"還可指本文中設(shè)想的多肽（的 用途），所述多肽特異性結(jié)合目標靶蛋白并且抑制、減弱和/或阻止該目標靶蛋白的生物活 性，如使用適當?shù)捏w外、細胞或體內(nèi)測定測量的。因此，"抑制"、"減弱"和/或"阻止"還可 指多肽（的用途），所述多肽特異性結(jié)合目標靶蛋白并且抑制、減弱和/或阻止其中牽涉該 目標靶蛋白的一個或多個生物或生理機制、作用、反應(yīng)、功能途徑或活性。取決于目標靶蛋 白，多肽作為拮抗劑的這樣的作用可以以任何適當?shù)姆绞胶?或使用本領(lǐng)域已知的任何適 當（體外和通常地細胞或體內(nèi)）測定來測定。
[0069] 如本文中所用，術(shù)語"增強"、"增加"和/或"激活"可以指多肽（的用途），所述多 肽特異性結(jié)合目標靶蛋白并且增強、增加和/或激活該目標靶蛋白與其天然結(jié)合伴侶之間 的相互作用。術(shù)語"增強"、"增加"和/或"激活"可以指多肽（的用途），所述多肽特異性 結(jié)合目標靶蛋白并且增強、增加和/或激活該目標靶蛋白的生物活性，如使用適當?shù)捏w外、 細胞或體內(nèi)測定測量的。因此，"增強"、"增加"和/或"激活"還可指多肽（的用途），所述 多肽特異性結(jié)合目標靶蛋白并且增強、增加和/或激活其中牽涉該目標靶蛋白的一個或多 個生物或生理機制、作用、反應(yīng)、功能途徑或活性。取決于目標靶蛋白，本文中設(shè)想的多肽作 為激動劑的這樣的作用可以以任何適當?shù)姆绞胶?或使用本領(lǐng)域已知的任何適當（體外， 通常地細胞或體內(nèi)）測定來測定。
[0070] 抑制或拮抗本文中設(shè)想的多肽的活性或者增強或激動多肽的活性可以是可逆的 或不可逆的，但對于制藥和藥理應(yīng)用通?？赡娴匕l(fā)生。
[0071] 如本文中所用，但對于Alphabody或多肽或核酸序列已從其中產(chǎn)生其的宿主細胞 和/或培養(yǎng)基提取或純化出來時，所述Alphabody或多肽或核酸序列被認為是"（以）基本 上分離的（形式）存在"。
[0072] 在包含在本文中設(shè)想的多肽內(nèi)的Alphabody或Alphabody結(jié)構(gòu)的方面，術(shù)語存 在于Alphabody上的"結(jié)合區(qū)域"、"結(jié)合位點"或"相互作用位點"在本文中將具有存在于 Alphabody上的負責結(jié)合靶分子的氨基酸殘基特定位點、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段的含義。這樣 的結(jié)合區(qū)域基本上由來自Alphabody的與祀分子接觸的特定氨基酸殘基組成。
[0073] 如果Alphabody或多肽對于兩不同的目標靶蛋白是特異性的（如本文中定義的）， 則其被認為顯示對于這兩種不同的目標靶蛋白的"交叉反應(yīng)性"。
[0074] 如果Alphabody包含一個針對于或特異性結(jié)合目標靶的氨基酸殘基位點、決定 簇、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段的結(jié)合位點，則Alphabody或多肽被認為是"單價"的。在其中 Alphabody或多肽的兩個或更多個結(jié)合位點針對于或特異性結(jié)合目標靶的相同氨基酸殘基 位點、決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段的情況下，Alphabody或多肽被認為是"雙價的"（在兩 個結(jié)合位點存在于Alphabody或多肽上的情況下）或多價的（在超過兩個結(jié)合位點存在于 Alphabody或多肽上的情況下），例如三價的。
[0075] 術(shù)語"雙特異性"當指Alphabody或多肽時，意指a) Alphabody或多肽的兩個或更 多個結(jié)合位點針對于或特異性結(jié)合相同目標靶但不結(jié)合該靶的相同（即結(jié)合不同）氨基酸 殘基位點、決定簇、部分、結(jié)構(gòu)域或區(qū)段，Alphabody被認為是"雙特異性的"（在兩個結(jié)合位 點存在于Alphabody上的情況下）或多特異性的（在超過兩個結(jié)合位點存在于Alphabody 上的情況下），或b)Alphabody的兩個或更多個結(jié)合位點針對于或特異性結(jié)合不同的目標 靶分子。在超過兩個結(jié)合位點存在于Alphabody的情況下使用術(shù)語"多特異性的"。
[0076] 因此，如本文中所用，"雙特異性Alphabody (或多肽）"或"多特異性Alphabody (或 多肽）"將具有分別包含兩個或至少兩個結(jié)合位點的式（N-)HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3(-C)的 單鏈Alphabody結(jié)構(gòu)（包含所述結(jié)構(gòu)的多肽）的含義，其中這兩個或更多個結(jié)合位點具有 不同的結(jié)合特異性。因此，如果兩個或超過2個不同結(jié)合區(qū)域存在于相同的單體單結(jié)構(gòu)域 Alphabody中，則Alphabody (或多肽）在本文中被認為是"雙特異性的"或"多特異性的"。 [0077] 如本文中所用，術(shù)語"預(yù)防和/或治療"包括預(yù)防和/或治療特定疾病和/或障礙， 防止特定疾病和/或障礙的發(fā)作，減緩或逆轉(zhuǎn)特定疾病和/或障礙的進展，阻止或減緩與特 定疾病和/或障礙相關(guān)的一個或多個癥狀的發(fā)生，減輕和/或緩解與特定疾病和/或障礙 相關(guān)的一個或多個癥狀，減輕特定疾病和/或障礙的嚴重度和/或持續(xù)時間，以及通常地本 文中設(shè)想的對待治療的受試者或患者有益的多肽的任何預(yù)防或治療作用。
[0078] 如本文中所用，術(shù)語"生物膜"或"膜"是指將細胞或成群的細胞與細胞外空間分 隔的含脂質(zhì)屏障。生物膜包括但不限于質(zhì)膜、細胞壁、細胞內(nèi)細胞器膜，例如線粒體膜、核膜 等。
[0079] 將本說明書中引用的所有文獻通過引用整體并入本文。除非另外定義，否則本公 開內(nèi)容中使用的所有術(shù)語，包括技術(shù)和科學術(shù)語，具有如本教導所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常 理解的含義。借助于其它指導，術(shù)語定義被包括來更好地理解本文中提供的教導。
[0080] [本發(fā)明相關(guān)描述]
[0081] 已發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生Alphabody多肽，所述多肽能夠進入細胞，在細胞內(nèi)保持穩(wěn)定，并且 可特異性結(jié)合該細胞中的細胞內(nèi)靶以及調(diào)節(jié)其功能。更具體地，已獲得Alphabody多肽，所 述多肽相較于包含Alphabody或由其組成的現(xiàn)有技術(shù)多肽而言，已經(jīng)修飾而使它們能夠內(nèi) 化入細胞（即細胞內(nèi)攝入）和特異性結(jié)合細胞內(nèi)部的細胞內(nèi)靶分子或與所述靶分子相互作 用（與本領(lǐng)域已知的Alphabody序列相反）。此夕卜，已發(fā)現(xiàn)本文中設(shè)想的Alphabody多肽可 以以高于常規(guī)結(jié)合劑的親和力或至少與其相當?shù)挠H和力結(jié)合細胞內(nèi)靶。
[0082] 多肽進入細胞的能力可由本領(lǐng)域技術(shù)人員利用常規(guī)方法，例如利用本文中的實施 例（更具體的本文中的實施例3和9. 1.2)中描述的方法來進行測試。例如，在提供具有適 當?shù)臉撕灥亩嚯暮?，可用顯微鏡跟蹤至細胞內(nèi)的進入。通常地，為了客觀地評價增強的多肽 被細胞內(nèi)攝入的能力，可在這些測定中將本文中設(shè)想的多肽與現(xiàn)有技術(shù)多肽比較，所述現(xiàn) 有技術(shù)多肽是包含未修飾Alphabody序列或由其組成的多肽。
[0083] 因此對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很清楚的是，現(xiàn)有技術(shù)的Alphabody序列不包含本 文中提供的多肽的結(jié)構(gòu)性質(zhì)的特定組合。事實上，迄今為止，仍未設(shè)想Alphabody僅被設(shè)想 用于細胞外靶，從而未曾設(shè)想用于細胞內(nèi)靶向的特定修飾。因此，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 很清楚的是，本申請的權(quán)利要求中不包括現(xiàn)有技術(shù)中公開的Alphabody序列，所述序列包 括：
[0084] -Complix NV 名下的公開申請 TO2010/066740 中的 SEQ ID N0 :4 至 10，
[0085] -Complix NV 名下的公開申請 W02011/003935 中的 SEQ ID N0 :1 至 5、10、17、22、 24、27、32 和 36,
[0086] -Complix NV 名下的公開申請 TO2011/003936 中的 SEQ ID N0 :2 至 7，
[0087] -Complix NV 名下的公開申請 TO2012/092970 中的 SEQ ID N0 :1 至 85，
[0088] -Complix NV 名下的公開申請 W02012/092971 中的 SEQ ID N0 :1 至 4 和 8，
[0089] -Complix NV 名下的公開申請 W02012/093013 的 SEQ ID N0 :64 至 69、71 至 75 和 77至80,和
[0090] -Complix NV 名下的公開申請 TO2012/093172 中的 SEQ ID N0 :1 至 135。
[0091] 在第一方面，提供了包含至少一個Alphabody(如本文中定義的）或基本上由其組 成的多肽，所述多肽能夠被內(nèi)化入細胞并且特異性結(jié)合在細胞內(nèi)具有生物活性的細胞內(nèi)靶 分子。
[0092] 本文中描述的多肽能夠高效地穿過生物細胞膜。生物活性分子的細胞內(nèi)運輸通常 是一般藥物遞送中的至關(guān)重要的問題之一，因為生物膜的親脂性質(zhì)限制了這樣的化合物的 直接細胞內(nèi)遞送。除非存在有關(guān)的主動運輸機制，否則細胞膜阻止大分子例如肽、蛋白質(zhì)和 DNA自發(fā)進入細胞。
[0093] 本文中提供了獨特的和高效力的多肽，所述多肽不僅以高親和力與細胞內(nèi)目標靶 特異性相互作用，而且其還能夠通過穿過細胞膜自主地進入細胞，并且在細胞內(nèi)環(huán)境中保 持完全活性和功能性。
[0094] 雖然許多將化合物運輸入細胞的方法是已知的，但這些方法的大部分不導致高效 穿膜以獲得顯著的（治療性）作用（即通常僅小百分比的化合物分子到達細胞內(nèi)環(huán)境）。 此外，最終確實終止于細胞中的化合物通常被蛋白酶活性快速分解和/或當通過內(nèi)體攝取 途徑攝入時通過嚴苛（酸性）內(nèi)體pH條件變性。
[0095] 用于細胞內(nèi)遞送的已知方法包括侵入性和非侵入性方法。在細胞實驗中用 于遞送不可透過膜的分子的顯微注射或電穿孔在性質(zhì)上是侵入性的，其可損害細胞膜 (Chakrabarti, R.等人(1989)Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. J. Biol. Chem. 264, 15494 15500 ；Arnheiter, H.和 Haller, 0· (1988)Antiviral state against influenza virus neutralized by microinjection of antibodies to interferon-induced Mx proteins. ΕΜΒ0 J. 7, 1315 1320)〇
[0096] 非侵入性方法包括pH-敏感性載體（例如pH-敏感性脂質(zhì)體）的使用和允許細胞 穿透的載體的使用。
[0097] [用于將多肽轉(zhuǎn)運通過細胞膜的技術(shù)]
[0098] 1.與某閉、部分、蛋白質(zhì)或狀的融合或綴合
[0099] 在前些年被其它研究人員用于細胞內(nèi)遞送分子的策略是將這些分子偶聯(lián)于可將 它們運送或轉(zhuǎn)移通過細胞膜的"載體"。
[0100] 通常地，這樣的"載體"由具有從天然存在的細胞穿透蛋白（來自病毒、細菌或高 等生物）分離的特定序列的線性肽（稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導域（PTD)或細胞穿透肽（CPP))組成。 通常將這樣的載體融合于"貨物（cargo) "（所述貨物為假定作用于細胞內(nèi)靶的功能性治療 性蛋白），以有利于貨物至細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。這樣的構(gòu)建體對細胞的體外功能活性已詳盡地記 錄在文獻中。然而，由于CPP或PTD至目前為止主要用作研究工具，因此它們在動物模型中 的體內(nèi)活性的顯示很有限。
[0101] 一般而言，除了這些CPP/PTD融合構(gòu)建體已被當作相當復制的結(jié)構(gòu)（包含至少兩 個分子實體）的事實外，它們在現(xiàn)有技術(shù)中還被描述為遭受幾個缺點，即貨物保持被捕獲 在內(nèi)體中而不被有效地釋放入胞質(zhì)溶膠，CPP/PTD融合構(gòu)建體強烈地傾向于聚集-在生產(chǎn) 和純化中引發(fā)問題，更重要地，減小效率和導致潛在有害的副作用（例如眾所周知聚集體 激發(fā)免疫反應(yīng)）以及靶位置上的極小生物利用度和穩(wěn)定性問題，因為大多數(shù)CPP/PTD構(gòu)建 體被當作易受蛋白酶攻擊的柔性附加物（appendage)。
[0102] 令人驚訝地，如實施例中詳盡描述的，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過將至少一個 Alphabody多肽與細胞穿透肽融合，所得的多肽被高效地遞送進入細胞并且在細胞內(nèi)保持 穩(wěn)定，同時允許高親和力結(jié)合細胞內(nèi)部的靶。事實上，本發(fā)明人已顯示針對細胞內(nèi)抗細胞凋 亡靶MCL-1的多肽被細胞以劑量依賴性的方式（參見例如實施例1至8)高效地攝入并且， 更重要地，能夠誘導期望的作用，即通過與靶分子MCL-1相互作用而誘導這些細胞的細胞 凋亡。
[0103] 因此，在具體實施方案中，提供了多肽，所述多肽包含至少一個針對細胞內(nèi)靶分子 的Alphabody或基本上由其組成，所述多肽與基團、部分或肽融合或綴合，從而確保多肽的 高效細胞穿透，其中多肽的穩(wěn)定性在細胞內(nèi)得到維持，從而使得能夠高效結(jié)合細胞內(nèi)靶。
[0104] 在某些具體實施方案中，本文中提供的多肽包含至少一個針對細胞內(nèi)靶分子的 Alphabody,所述Alphabody直接或間接連接于即偶聯(lián)于、融合于或綴合于基團、（蛋白質(zhì)） 部分或肽，以允許或確保多肽的細胞穿透。
[0105] 在某些具體實施方案中，多肽包含可結(jié)合細胞內(nèi)祀的Alphabody,所述Alphabody 直接連接于基團、（蛋白質(zhì)）部分或肽，從而允許細胞穿透，即在Alphabody與允許細胞穿 透的所述基團、（蛋白質(zhì)）部分或肽之間無任何中間實體或序列。
[0106] 在可選擇的具體實施方案中，允許Alphabody多肽進入細胞的基團、（蛋白質(zhì)）部 分或肽還可連接于除針對細胞內(nèi)靶分子的Alphabody外的實體，只要該實體形成多肽的部 分即可。這樣的其它實體（可將允許細胞穿透的基團、部分或肽連接于其上）可以例如是 第二Alphabody (例如在包含串連在一起的Alphabody的二價或多價多肽的情況下）或可 以例如是具有特定功能的基團或蛋白，例如延長多肽的體內(nèi)半衰期的蛋白，或靶向肽，其將 多肽靶向或?qū)蚰承┨囟毎愋汀Ｍ瑯拥?，所述其它實體可以是接頭，例如偶聯(lián)蛋白質(zhì)的 適當肽接頭，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0107] 在其它具體實施方案中，提供了包含至少一個針對細胞內(nèi)祀分子的Alphabody 或由基本上由其組成的多肽，所述Alphabody被綴合于細胞穿透肽（CPP)，例如但 不限于 TAT、CPP5、Penetratin、Pen_Arg、pVEC、M918、TP10 (Madani 等人，Journal of Biophysics,Volume2011, Article ID414729)或 TAT-HA 融合膚（Wadia 等 人，2004, 10,310-315)。在具體實施方案中，提供了包含至少一個特異性結(jié)合細胞內(nèi)靶分 子的Alphabody的多肽，所述多肽的特征在于存在綴合于Alphabody結(jié)構(gòu)序列、確保多肽至 細胞內(nèi)的內(nèi)化的序列。在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽的特征在于序列例如但不限 于 KLPVM(SEQ ID N0:21)、VPTLK(SEQ ID N0:22)或 YGRKKRRQRRR(SEQ ID N0:23)的存在。 在具體實施方案中，所述序列為CPP5肽。
[0108] 因此，如本文中所顯示的，提供了能夠結(jié)合細胞內(nèi)靶的多肽，所述多肽包含序列 KLPVM(SEQ ID N0:21)、VPTLK(SEQ ID N0:22)或 YGRKKRRQRRR(SEQ ID N0:23)。
[0109] 2)通討設(shè)計講行的細朐穿誘：CPAB摶術(shù)
[0110] 雖然Alphabody的α-螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)本身不賦予膜穿透能力，但本文中描 述了將包含一個或多個Alphabody結(jié)構(gòu)的多肽帶入細胞的新型改進技術(shù)，所述技術(shù)包 括在Alphabody支架中設(shè)計特定氨基酸區(qū)域，任選地包括序列模式或基序。事實上，已 開發(fā)了新型高效的細胞穿透技術(shù)，所述技術(shù)在本文中稱為"CPAB技術(shù)"，其使得能夠?qū)?含Alphabody的多肽轉(zhuǎn)化成高效細胞穿透分子，即所謂的"細胞穿透Alphabody"（cell penetrating Alphabodies，CPAB)或"細胞穿透 Alphabody 多膚"。
[0111] 利用CPAB技術(shù)設(shè)計特定CPAB Alphabody多肽至少包括制備或修飾包含 Alphabody結(jié)構(gòu)序列的多肽，以獲得至少部分地包含于多肽的Alphabody結(jié)構(gòu)序列內(nèi)的氨 基酸區(qū)域的步驟，所述氨基酸區(qū)域確保多肽至細胞內(nèi)的內(nèi)化。因此，特定CPAB Alphabody 的設(shè)計包括將一個或多個內(nèi)化區(qū)域引入（例如通過序列設(shè)計或通過突變）Alphabody序列 或其部分。在具體實施方案中，這包括在Alphabody支架的序列中的特定位置上引入特定 氣基酸殘基。
[0112] 已發(fā)現(xiàn)，通過將這樣的內(nèi)化區(qū)域至少部分地引入Alphabody序列，可產(chǎn)生能夠自 主地穿透（即無需任何其它使得能夠穿入細胞的結(jié)構(gòu)）細胞的多肽。此外，如將在下文中 詳述的，已發(fā)現(xiàn)可任選地將這與在Alphabody結(jié)構(gòu)內(nèi)提供細胞內(nèi)靶的結(jié)合位點組合，以便 獲得高效細胞內(nèi)結(jié)合劑。
[0113] 本文中提供的CPAB多肽已被設(shè)計來在包含Alphabody結(jié)構(gòu)的多肽中的一個或多 個有限區(qū)域內(nèi)，更具體地至少部分地在Alphabody結(jié)構(gòu)內(nèi)包含某些類型的氨基酸殘基。更 具體地，已發(fā)現(xiàn)特定的帶正電荷（也稱為陽離子性）區(qū)域能夠非常好地確保多肽的內(nèi)化。因 此，在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含至少一個帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域，所述區(qū)域的 特征在于許多存在于Alphabody支架的特定位置上的帶正荷氨基酸殘基，通過所述氨基酸 殘基給多肽提供了進入細胞的能力。在某些實施方案中，所述至少一個帶正電荷的內(nèi)化區(qū) 域可被認為包含細胞穿透基序或"細胞穿透模式"（在本文中也稱為"CPAB基序"或"CPAB 模式"）。這樣的基序或模式可被認為特征在于給本文中設(shè)想的多肽提供細胞穿透活性。
[0114] 在第一方面，本文中提供了多肽，所述多肽包含至少一個Alphabody結(jié)構(gòu)序列和 至少一個帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域（確保所述多肽至細胞的內(nèi)化）或基本上由所述結(jié)構(gòu)序列和 內(nèi)化區(qū)域組成，其中所述內(nèi)化區(qū)域至少部分地包含于所述Alphabody結(jié)構(gòu)序列內(nèi)。
[0115] 如本文中所用，帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域被當作是這樣的序列，所述序列為Alphabody 結(jié)構(gòu)序列（如本文中定義的）的至少部分并且在本文中設(shè)想的多肽的兩個帶正電荷氨基酸 殘基之間延伸。
[0116] 在本說明書中，術(shù)語"帶正電荷的氨基酸"是指選自精氨酸和賴氨酸的氨基酸。
[0117] 因此，本文中提供的多肽包含帶正電荷的序列，其始于帶電荷的氨基酸殘基和終 于帶正電荷的氨基酸殘基并且確保多肽能夠進入細胞。
[0118] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將很明了的是，本文中設(shè)想的多肽可包含（但不一定包 含）位于本文中設(shè)想的內(nèi)化區(qū)域外部的另外的帶正電荷氨基酸殘基。因此，特定數(shù)目的帶 正電荷的氨基酸殘基可存在于本文中設(shè)想的多肽中，所述氨基酸殘基不形成本文中描述的 內(nèi)化區(qū)域的部分，從而被認為對多肽的細胞穿透能力沒有貢獻。此外，本文中設(shè)想的多肽可 以包含或可以不包含兩個或更多個本文中描述的內(nèi)化區(qū)域，所述內(nèi)化區(qū)域彼此分隔或彼此 重疊。
[0119] 本文中設(shè)想的多肽的至少一個帶正電荷內(nèi)化區(qū)域的進一步特征在于存在至少6 個帶正電荷的氨基酸殘基。所述至少6個氨基酸殘基可選自精氨酸和賴氨酸。事實上，本 發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)當6個或更多個帶正電荷的氨基酸殘基（例如精氨酸或賴氨酸或精氨酸與賴 氨酸的混合物）簇聚在本文中設(shè)想的多肽內(nèi)的特定位置上時，確保了多肽至細胞的高效進 入。
[0120] 此外，已觀察到當內(nèi)化區(qū)域中的所述至少6個帶正電荷殘基中的至少4個殘基是 精氨酸時或當內(nèi)化區(qū)域中的所述至少6個帶正電荷殘基中的至少5個殘基是賴氨酸時，觀 察到高效細胞穿透。
[0121] 包含于本文中設(shè)想的多肽中的內(nèi)化區(qū)域是這樣的氨基酸片段，所述氨基酸片段 (i)在兩個帶正電荷的氨基酸殘基之間延伸，（ii)特征在于存在至少6個帶正電荷的氨基 酸殘基，和以下情形之一
[0122] (iiia)由最多16個氨基酸組成，或
[0123] (iiib)至少35 %由帶正電荷氨基酸組成。
[0124] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將很明了的是，現(xiàn)有技術(shù)的Alphabody序列不包含本文 中提供的多肽的結(jié)構(gòu)特性的該特定組合。與之一致地，現(xiàn)有技術(shù)的Alphabody序列未被所 附權(quán)利要求包括。
[0125] 因此，本文中描述的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域可以是在兩個帶正電荷的氨基酸殘基之 間延伸的最多16個氨基酸的片段，其特征在于存在至少6個帶正電荷的氨基酸殘基。在某 些具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域是16個氨基酸的片段，其以兩個帶正電荷的氨基酸為界，并 且特征在于存在至少6個帶正電荷的氨基酸。在其它具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域為16個氨 基酸的片段，其包含6、7、8、9或10個或更多個（例如16個）帶正電荷的氨基酸，并且以2 個帶正電荷的氨基酸為界。
[0126] 在其它具體實施方案中，所述區(qū)域為以兩個帶正電荷的氨基酸為界并且特征在于 存在至少6個帶正電荷的氨基酸的16個氨基酸的片段，所述片段的至少4個殘基為精氨酸 或其至少5個殘基為賴氨酸。
[0127] 在其它具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域可包含7、8、9、10或更多個（例如16個）帶正 電荷的氨基酸，包含加在一起達到總共7、8、9、10或超過10個（例如16個帶正電荷的氨基 酸）的精氨酸與賴氨酸的組合。這樣的帶正電荷的氨基酸殘基的組合包括例如4個精氨酸 和3個賴氨酸、5個精氨酸和3個賴氨酸、6個精氨酸和4個賴氨酸、4個精氨酸和4個賴氨 酸、5個精氨酸和4個賴氨酸、5個精氨酸和5個賴氨酸、6個精氨酸和3個賴氨酸的組合，以 及加在一起達到最多總共16個帶正電荷氨基酸殘基的精氨酸與賴氨酸的任何適當?shù)钠渌?組合。
[0128] 在其它具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域可包含至少4個，例如5、6、7、8、9、10或超過10 個，例如最多16個精氨酸。在其它具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域可包含至少5個，例如6、7、9、 10或超過10個，例如最多16個賴氨酸。
[0129] 在某些實施方案中，包含在本文中設(shè)想的多肽中的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域內(nèi)的所述 至少6個帶正電荷氨基酸殘基完全由精氨酸組成或完全由賴氨酸組成?；蛘撸谀承┚唧w 實施方案中，包含在本文中設(shè)想的多肽中的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域內(nèi)的所述至少6個帶正電 荷氨基酸殘基由精氨酸和賴氨酸組成。
[0130] 已發(fā)現(xiàn)在包含Alphabody結(jié)構(gòu)序列的多肽序列中彼此集簇靠近的正電荷增強多 肽的細胞穿透。
[0131] 因此，所述至少一個本文中設(shè)想的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域可以是在兩個帶正電荷的 氨基酸殘基之間延伸的片段，其特征在于存在至少6個帶正電荷的氨基酸殘基并且至少 35 %由帶正電荷的氨基酸組成。在具體實施方案中，本文中設(shè)想的所述至少一個帶正電荷 的內(nèi)化區(qū)域的至少35 %由帶正電荷的氨基酸組成，例如至少40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或最多100%由帶正電荷的氨基酸殘基組成。所述帶正電 荷的氨基酸殘基可以是精氨酸或賴氨酸。在其它具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽中所 述至少一個帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域至少35%由帶正電荷的氨基酸組成并且特征在于存在至 少6個帶正電荷的氨基酸殘基，所述帶正電荷的氨基酸殘基中至少4個殘基為精氨酸。在 其它具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽中所述至少一個帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域至少35%由 帶正電荷的氨基酸組成并且特征在于存在至少6個帶正電荷的氨基酸殘基，所述帶正電荷 的氨基酸殘基中至少5個殘基為賴氨酸。
[0132] 事實上，本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當不同的和相對短的氨基酸殘基片段-至 少部分地（優(yōu)選完全地）位于Alphabody結(jié)構(gòu)內(nèi)-被飾以或提供以許多彼此靠近的帶正電 荷的氨基酸殘基時，可產(chǎn)生在細胞穿透以及細胞內(nèi)穩(wěn)定性和功能性方面具有高度有利性質(zhì) 的多肽。
[0133] 雖然在現(xiàn)有技術(shù)中已進行了許多努力來以隨機的方式使蛋白質(zhì)帶正電荷或陽離 子化（基本上使電荷散布在整個蛋白質(zhì)表面），以增強細胞穿透，但觀察到許多副作用并且 在細胞內(nèi)未顯示功能性。這些副作用例如包括對細胞器和膜的非特異性結(jié)合或粘滯性，不 穩(wěn)定性和因"帶電過多（overchargement) "而引起的靜電排斥，導致聚集的變性以及與例如 膜組分和酸性蛋白質(zhì)的假相互作用。
[0134] 然而本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在包含Alphabody結(jié)構(gòu)序列的多肽序列的狹窄窗口（即 對應(yīng)于約15至20個氨基酸殘基，優(yōu)選不超過16個氨基酸殘基的窗口）中彼此靠近的正電 荷可最佳地實現(xiàn)多肽的細胞穿透。
[0135] 在本文中設(shè)想的具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽的內(nèi)化區(qū)域中的正電荷在包 含于多肽的Alphabody序列內(nèi)的狹窄窗口中彼此靠近，所述狹窄窗口不超過總Alphabody 序列的約15-20%。
[0136] 在一些具體實施方案中，所述至少一個內(nèi)化區(qū)域完全包含于所述至少一個 Alphabody結(jié)構(gòu)序列的一個α -螺旋內(nèi)。
[0137] 該內(nèi)化區(qū)域內(nèi)的帶正電荷氨基酸不一定彼此相接，而是可相隔一個或多個非-帶 正電荷的氨基酸。事實上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將承認Alphabody基序帶來某些限制。通常地， 內(nèi)化區(qū)域被認為在于最多16個氨基酸殘基的片段內(nèi)彼此相距最遠的兩個帶正電荷的氨基 酸殘基之間延伸。
[0138] 在根據(jù)這些實施方案設(shè)想的多肽中，內(nèi)化區(qū)域被整合入Alphabody結(jié)構(gòu)內(nèi)，至少 80% (例如至少約13/16的氨基酸）位于多肽中的Alphabody結(jié)構(gòu)內(nèi)，從而有限數(shù)目的氨基 酸（例如至多約3/16的氨基酸）可在Alphabody結(jié)構(gòu)外部于多肽中延伸。在某些具體實 施方案中，本文中設(shè)想的內(nèi)化區(qū)域內(nèi)的至少50%例如至少60%、70%、80%、90%或100% (即全部）的帶正電荷氨基酸殘基包含于本文中提供的多肽的Alphabody結(jié)構(gòu)序列內(nèi)。
[0139] 然而在一些具體實施方案中，整個內(nèi)化區(qū)域位于Alphabody結(jié)構(gòu)序列內(nèi)。
[0140] 內(nèi)化區(qū)域中的帶正電荷氨基酸在Alphabody中的位置將影響內(nèi)化的效率。事實 上，在具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域的一個或多個帶正電荷的氨基酸殘基位于Alphabody的 外表面，具體地在Alphabody的溶劑定向外表面上，例如在Alphabody的至少一個α -螺旋 外部溶劑定向表面上。事實上，已發(fā)現(xiàn)如果內(nèi)化區(qū)域的帶正電荷氨基酸殘基位于Alphabody 結(jié)構(gòu)或支架外表面上，則內(nèi)化得到增強。因此，在具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域的帶正電荷氨 基酸位于多肽中的Alphabody結(jié)構(gòu)的α-螺旋外表面上，更具體地（完全地）在Alphabody 結(jié)構(gòu)的α-螺旋外表面上。
[0141] 鑒于以上所述，已確定如果在Alphabody結(jié)構(gòu)中的特定位置上提供帶正電荷的氨 基酸，則可獲得增強的內(nèi)化。因此，在具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域包含具有帶正電荷的氨基 酸的特殊基序。這樣的基序或模式從而在蛋白質(zhì)水平上是獨特的氨基酸序列（或在基因水 平上是獨特的核酸序列），其在特定位置上包含一個或多個特征性氨基酸殘基（或編碼所 述氨基酸殘基的核酸序列）。某些CPAB基序（如本文中使用的）內(nèi)的"特征性氨基酸殘基" 代表了該CPAB基序內(nèi)對于包含該CPAB基序的CPAB Alphabody的細胞穿透能力而言至關(guān) 重要的那些氨基酸殘基。因此，改變CPAB Alphabody中的CPAB基序的所謂的"特征性或至 關(guān)重要的殘基"的身份（例如通過突變或從頭序列設(shè)計）將影響該CPAB Alphabody的細胞 穿透能力。
[0142] 在某些具體實施方案中，當帶正電荷的氨基酸殘基的數(shù)目減少至少于4個時，本 文中設(shè)想的內(nèi)化區(qū)域的CPAB基序不再能夠介導多肽的細胞內(nèi)化。
[0143] 如上所述，如本文中所用的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域、CPAB基序或CPAB模式至少 部分地被這樣整合入Alphabody結(jié)構(gòu)序列（如本文中定義的），從而與綴合于或連接于 Alphabody序列的末端之一（以確保細胞穿透）的細胞穿透肽或蛋白質(zhì)序列或其它細胞穿 透基團不同。
[0144] 已發(fā)現(xiàn)內(nèi)化區(qū)域在多肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)中的位置不是至關(guān)重要的，即本文中設(shè)想 的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域可位于Alphabody結(jié)構(gòu)的螺旋Α、Β或C中。
[0145] 在具體實施方案中，本文中提供的多肽包含至少一個內(nèi)化區(qū)域，其位于Alphabody 結(jié)構(gòu)的螺旋A中。在其它具體實施方案中，本文中提供的多肽包含至少一個內(nèi)化區(qū)域，其位 于Alphabody結(jié)構(gòu)的螺旋C中。在其它具體實施方案中，本文中提供的多肽包含2個內(nèi)化 區(qū)域，其各自位于本文中描述的Alphabody結(jié)構(gòu)的螺旋A和螺旋C中。
[0146] 在某些具體實施方案中，已發(fā)現(xiàn)Alphabody結(jié)構(gòu)的兩個不同部分（例如A螺旋和 C螺旋）中2個內(nèi)化區(qū)域的組合也還可增加至細胞內(nèi)的穿透性。
[0147] 然而，在具體實施方案中，優(yōu)選地，內(nèi)化區(qū)域不包含于Alphabody結(jié)構(gòu)的環(huán)或接頭 區(qū)域內(nèi)。在其它具體實施方案中，預(yù)期Alphabody結(jié)構(gòu)的3個螺旋中至多2個包含內(nèi)化區(qū) 域。
[0148] 在其它特別優(yōu)選實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含至少一個內(nèi)化區(qū)域，其完全 位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個α -螺旋（例如A螺旋、B螺旋或C螺旋）內(nèi)，或大體上完全包 含于所述螺旋中。在其它具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含至少一個內(nèi)化區(qū)域，其完 全位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個α -螺旋（例如A螺旋或C螺旋）內(nèi)，或大體上完全包含于 所述螺旋中。
[0149] 在具體實施方案中，所述帶正電荷的氨基酸位于常規(guī)七肽b_、c-、e_、f_和g_位置 (即Alphabody支架的非核心位置（如本文中定義的））上，所述位置通常位于Alphabody 支架的外部（即暴露于溶劑的）α-螺旋表面。
[0150] 因此，在具體實施方案中，CPAB基序可以例如（不限于）存在于下列16個氨 基酸的片段中，所述片段包含于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列內(nèi)： XXHXXXHXXHXXXHXX,
[0151] 其中Η代表疏水性和/或非極性氨基酸殘基，
[0152] 其中X代表親水性和/或極性氨基酸殘基，并且
[0153] 其中至少6個X殘基為精氨酸或賴氨酸。
[0154] 在具體實施方案中，Η代表異亮氨酸。
[0155] 在其它具體實施方案中，基序為16個氨基酸片段XXHXXXHXXHXXXHXX的子片段，其 包含于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列內(nèi)，
[0156] 其中Η代表疏水性和/或非極性氨基酸殘基，
[0157] 其中X代表親水性和/或極性氨基酸殘基，條件是X殘基中的至少6個為精氨酸 或賴氨酸。在一些具體實施方案中，Η代表異亮氨酸。
[0158] 本發(fā)明人已鑒定了不同的有用的帶正電荷內(nèi)化基序。在具體實施方案中，CPAB基 序?qū)?yīng)于ΖΖΧΧΖΧΧΖΖΧΧΖ，其中Ζ代表帶正電荷的氨基酸并且X代表任意氨基酸殘基。更具 體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列內(nèi)。在具體實 施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的定位對應(yīng)于 HZZHPZPHZZHPZPHPPHPPPHPP，以便帶正電荷的氨基酸（Z)位于螺旋的外表面上。
[0159] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZXXZZXXZXXZ，其中Z代表帶正電荷 的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPZHPZPHZZHPZPHZPHPPPHPP。
[0160] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表帶正電荷的 氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHPZPHZZHPZPHZZHPPPHPP。
[0161] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZXXXZXXXZXXZZ，其中Z代表帶正電 荷的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序 列內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上 的定位對應(yīng)于 HZPHZPPHZPHPZPHZZHPPPHPP。
[0162] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXXZXXXZXXZZXXZ，其中Z代表帶正電 荷的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序 列內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上 的定位對應(yīng)于 HPPHZPPHZPHPZPHZZHPZPHPP。
[0163] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZXXXZXXXZXXZZXXZ，其中Z代表帶正 電荷的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復 序列內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu) 上的定位對應(yīng)于 HZPHZPPHZPHPZPHZZHPZPHPP。
[0164] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZZXXZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表帶正 電荷的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復 序列內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu) 上的定位對應(yīng)于 HZPHZZPHZPHZZPHZZHZZPHPP。
[0165] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表帶正電荷的 氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HZPHZZPHZPHZZPHPPHPPPHPP。
[0166] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZZXXZXXZZXXZ，其中Z代表帶正電荷的 氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHZZPHZPHZZPHZPHPPPHPP。
[0167] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZXXZZXXZXXZ，其中Z代表帶正電荷 的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHZPPHZPHZZPHZPHZPPHPP。
[0168] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZZXXZXXZZ，其中Z代表帶正電荷的 氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHPPPHZPHZZPHZPHZZPHPP。
[0169] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZZXXZXXXZXXZZXXZZXZZ，其中Z代表帶 正電荷的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重 復序列內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié) 構(gòu)上的定位對應(yīng)于 HPPHZZPHZPHPZPHZZHPZZHZZ。
[0170] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZZXXZXXXZXXZZ，其中Z代表帶正電荷 的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHZZPHZPHPZPHZZHPPPHPP。
[0171] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZXXXZXXZZXXZ，其中Z代表帶正電荷 的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHPZPHZPHPZPHZZHPZPHPP。
[0172] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXXZXXZZXXZZ，其中Z代表帶正電荷 的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列 內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的 定位對應(yīng)于 HPPHPPPHZPHPZPHZZHPZZHPP。
[0173] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZXXZZXXZZXZ，其中Z代表帶正電荷的氨 基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列內(nèi)。 在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的定 位對應(yīng)于 HPPHPPPHPPHPZPHZZHPZZHZP。
[0174] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZZXXZZXZZ，其中Z代表帶正電荷的氨基 酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序列內(nèi)。在 具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上的定位 對應(yīng)于 HPPHPPPHPPHPPPHZZHPZZHZZ。
[0175] 在其它具體實施方案中，CPAB基序?qū)?yīng)于ZZXXXXXZZXXXXXZZ，其中Z代表帶正電 荷的氨基酸。更具體地，該CPAB基序位于Alphabody結(jié)構(gòu)的一個或多個螺旋的七肽重復序 列內(nèi)。在具體實施方案中，該基序在特征為結(jié)構(gòu)HPPHPPPHPPHPPPHPPHPPPHPP的螺旋結(jié)構(gòu)上 的定位對應(yīng)于ZZHPPPHZZHPPPHZZ。
[0176] 還已發(fā)現(xiàn)其它基序適合用于確保多肽至細胞內(nèi)的內(nèi)化，例如 ZXXXZXXXXXXZZXXXZXZZ (其在被引入七肽重復基序時對應(yīng)于ZPPHZPHPPHZZHPZHZZ)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員也可設(shè)想本文中提供的CPAB基序的其它變化。
[0177] 如上所述，本文中設(shè)想的多肽可在Alphabody結(jié)構(gòu)中包含超過一個內(nèi)化區(qū)域。這 樣的基序可包含相同或不同的基序。
[0178] 本文中設(shè)想的多肽中的一個或多個內(nèi)化區(qū)域（即在每區(qū)域最多16個氨基酸的片 段上延伸）可被表征為具有凈電荷。本文中設(shè)想的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域的凈電荷通常對應(yīng) 于該內(nèi)化區(qū)域中的帶正電荷的氨基酸的總數(shù)。在具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域的凈電荷為至 少+6。還可設(shè)想可提供具有+7、+8、+9、+10,例如最大+16的凈電荷的帶正電荷內(nèi)化區(qū)域。
[0179] 已顯示（如實施例9至11中詳述的）CPAB基序可被整合進入Alphabody支架而 不破壞靶結(jié)合位點。
[0180] 在具體實施方案中，本文中提供的多肽包含至少一個Alphabody結(jié)構(gòu)序列或基本 上由其組成，所述Alphabody結(jié)構(gòu)序列：
[0181] (i)能夠通過至少一個本文中描述的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域的存在被內(nèi)化入細胞， 所述內(nèi)化區(qū)域至少部分地包含于所述Alphabody結(jié)構(gòu)序列內(nèi)，此外
[0182] (ii)主要通過存在于Alphabody結(jié)構(gòu)序列上的結(jié)合位點而特異性結(jié)合細胞內(nèi)革巴 分子。
[0183] 在這些具體實施方案中，本文中提供的多肽主要通過存在于Alphabody結(jié)構(gòu)序列 的B螺旋上的結(jié)合位點而特異性結(jié)合細胞內(nèi)靶分子。
[0184] 在某些具體實施方案中，提供了包含Alphabody結(jié)構(gòu)的多肽，所述多肽能夠結(jié)合 細胞內(nèi)靶，并且特征在于存在至少部分地位于所述多肽中存在的Alphabody結(jié)構(gòu)序列內(nèi)的 一個或多個帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域，其中所述內(nèi)化區(qū)域由不超過16個氨基酸殘基的片段組 成，其特征在于存在至少6個帶正電荷的氨基酸殘基。
[0185] 在某些具體實施方案中，提供了包含Alphabody結(jié)構(gòu)的多肽，所述多肽能夠結(jié)合 細胞內(nèi)祀，并且特征在于存在至少一個至少部分地位于所述多肽中存在的Alphabody結(jié)構(gòu) 序列內(nèi)的帶正電荷的內(nèi)化區(qū)域，其中所述內(nèi)化區(qū)域的特征在于存在至少6個帶正電荷的氨 基酸殘基，并且至少35%由帶正電荷的氨基酸組成。
[0186] 在其它具體實施方案中，提供了包含Alphabody結(jié)構(gòu)的多肽，所述多肽能夠結(jié)合 細胞內(nèi)靶，并且特征在于存在一個或多個至少部分地位于所述多肽中存在的Alphabody結(jié) 構(gòu)序列內(nèi)的內(nèi)化區(qū)域，其中內(nèi)化區(qū)域包含至少6個帶正電荷的氨基酸殘基，所述帶正電荷 的氨基酸殘基中（i)至少4個殘基為精氨酸，或（ii)至少5個殘基為賴氨酸。在某些其它 具體實施方案中，所述至少一個內(nèi)化區(qū)域由不超過16個氨基酸殘基的片段組成。在某些其 它具體實施方案中，所述至少一個內(nèi)化區(qū)域至少35%由帶正電荷的氨基酸組成。
[0187] 在本文中提供的多肽的其它具體實施方案中，包含于所述至少一個帶正電荷的內(nèi) 化區(qū)域中的氨基酸殘基中至少80%包含于所述至少一個Alphabody結(jié)構(gòu)序列中；在其它 具體實施方案中，所述至少一個內(nèi)化區(qū)域基本上完全包含于所述至少一個Alphabody結(jié)構(gòu) 序列中，例如（大體上完全地）包含于所述至少一個Alphabody結(jié)構(gòu)序列的一個α-螺旋 內(nèi)。在其它具體實施方案中，所述至少一個內(nèi)化區(qū)域（大體上完全地）包含于所述至少一 個Alphabody結(jié)構(gòu)序列的Α螺旋和/或C螺旋內(nèi)。
[0188] 在其它具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域是這樣的區(qū)域，其至少35%由帶正電荷的氨基 酸殘基組成，所述帶正電荷的氨基酸殘基當均被突變成非-帶正電荷的氨基酸時，包含該 內(nèi)化區(qū)域的多肽的細胞攝入減少至少50%，例如至少60%，至少70%，至少80 %或至少 90%或更多。在其它具體實施方案中，內(nèi)化區(qū)域是這樣的區(qū)域，其至少35%由帶正電荷的氨 基酸殘基組成，所述帶正電荷的氨基酸殘基當全部被突變成非-帶正電荷的氨基酸時，包 含該內(nèi)化區(qū)域的多肽的細胞攝入被大體上完全消除。
[0189] 由于本文中設(shè)想的多肽具有直接或間接影響細胞內(nèi)靶在細胞內(nèi)的生物功能，因此 它們對于在廣泛的疾病適應(yīng)征中的醫(yī)學（即治療或預(yù)防）應(yīng)用是特別有用的。
[0190] [細胞內(nèi)目標靶]
[0191] 預(yù)期本文中描述的多肽在Alphabody結(jié)構(gòu)內(nèi)包含針對細胞內(nèi)蛋白的結(jié)合位點。
[0192] 某些實施方案中設(shè)想的Alphabody和多肽可特異性結(jié)合的細胞內(nèi)靶分子的實例 包括例如但不限于參與細胞過程的蛋白，所述細胞過程選自細胞信號傳導、細胞信號轉(zhuǎn)導、 細胞和分子運輸（例如主動運輸或被動運輸）、滲透、吞噬作用、自噬、細胞衰老、細胞粘附、 細胞運動、細胞遷移、胞質(zhì)環(huán)流、DNA復制、蛋白質(zhì)合成、增殖（例如細胞周期、減數(shù)分裂、有 絲分裂、分裂間期、胞質(zhì)分裂）、細胞代謝（例如糖酵解和呼吸、能量供應(yīng)）、細胞通訊、DNA修 復、細胞凋亡和程序化細胞死亡。
[0193] 本文中設(shè)想的的多肽還能夠在細胞內(nèi)環(huán)境中維持它們的生物活性。事實上，本文 中已顯示，本文中提供的多肽不僅在細胞內(nèi)環(huán)境中是穩(wěn)定的，而且還能夠結(jié)合它們的細胞 內(nèi)革巴并抑制其功能。
[0194] 本文中描述的特定多肽能夠特異性結(jié)合BCL-2蛋白家族的抗細胞凋亡成員。 BCL-2蛋白家族的抗細胞凋亡成員的實例為MCL-UBCLUCLIajCL-X^BCL-w和BFL-1/ A1。應(yīng)當理解，一個Alphabody可結(jié)合數(shù)種（即一種或多種）細胞內(nèi)目標蛋白。在具體實 施方案中，Alphabody的結(jié)合由其α -螺旋之一驅(qū)動，所述α -螺旋在Alphabody卷曲螺旋 結(jié)構(gòu)中得到穩(wěn)定化。
[0195] 在其它具體實施方案中，多肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :1至16、26和 27的序列。在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1的多肽，其中所 述多肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :4至16、26和27的序列。在具體實施方案中， 提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1的多肽，其中所述多肽的特征在于它們包含與 SEQ ID N0 :19中定義的多肽序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大的 序列同一性的序列。
[0196] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1的多肽，其中所 述多肽的特征在于它們包含SEQ ID N0 :20中定義的序列（LRXVGDXV)。
[0197] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合BCL_2a的多肽，其中所 述多肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :26和27的序列。
[0198] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合BCL-XL的多肽，其中所 述多肽的特征在于它們包含選自SEQ ID N0 :26和27的序列。
[0199] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1和/或BCL_2a和 /或BCL-XL的多肽，其中所述多肽的特征在于它們包含與SEQ ID N0 :29中定義的多肽序 列（MSIEEIAAQIAAIQLRII⑶QFNIYYMT)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更 大序列同一性的序列。
[0200] 在具體實施方案中，提供了能夠被細胞內(nèi)化并且能夠結(jié)合MCL-1和/或BCL_2a 和/或BCL-XL的多肽，其中所述多肽的特征在于它們包含SEQ ID NO :30中定義的序列 (LRII⑶QF)。
[0201] 在具體實施方案中，某些實施方案中設(shè)想的Alphabody和多肽可特異性結(jié)合的細 胞內(nèi)靶分子包括細胞內(nèi)蛋白，所述細胞內(nèi)蛋白天然地參與在真核細胞例如動物細胞（具體 地哺乳動物細胞或人細胞）中發(fā)生的過程。
[0202] [ALPHABODY多肽的結(jié)合親和力]
[0203] 通常地，本文中設(shè)想的多肽可以以小于約1微摩爾濃度（1 μ M)，優(yōu)選小于約1納 摩爾濃度（ΙηΜ)的解離常數(shù)（KD)[即以約1，000,000/摩爾濃度（lOf，1Ε6/Μ)或更高、優(yōu) 選約1，000,000,000/摩爾濃度（10、^9/^)或更高的締合常數(shù)（以)]結(jié)合目標靶蛋白。 大于約1毫摩爾濃度的KD值通常被認為表示不結(jié)合或非特異性結(jié)合。本領(lǐng)域中通常已知 KD還可表達為復合物的解離速率常數(shù)（表示為kOff (以秒η或f表示的））對其締合速 率常數(shù)（表示為kOn (以摩爾濃度η秒η或Μ?表示的））的比率。具體地，本文中公開的 多肽可以以范圍在〇. 1與〇. 0001s4之間的kOff和/或范圍在1,000與Ι,ΟΟΟ,ΟΟΟΜ?之 間的kOn結(jié)合目標靶蛋白。結(jié)合親和力，kOff和kOn率可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 例如ELISA法、等溫滴定量熱法、表面等離子體共振術(shù)、熒光激活細胞分選分析等來測定。
[0204] [ALPHABODY 支架的結(jié)構(gòu)]
[0205] 本文中描述的靶結(jié)合多肽為包含具有通式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的一個或多 個Alphabody支架的氨基酸序列，所述氨基酸序列任選地包含另外的N-和C-末端連接基 團、殘基或部分、導致式N-HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3-C。所述任選的N和C延伸可以例如是 用于檢測或純化的標簽（例如His-標簽）或另一種蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，在該情況下 完整的構(gòu)建體表示融合蛋白。為清楚起見，任選的延伸N和C在本文中被認為不形成通 式" HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3 "定義的單鏈Alphabody結(jié)構(gòu)的部分。
[0206] 如上所示，Alphabody結(jié)構(gòu)的七肽重復通常表示為"abcdefg"或"defgabc"，其中 符號"a"至"g"表示常規(guī)七肽位置。本文中描述的Alphabody的每一個七肽單位中的"a-位 置"和"d-位置"是其中與溶劑隔離的（即，包埋的）核心殘基所位于的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)氨 基酸殘基位置。Alphabody結(jié)構(gòu)的每一個七肽單位中的"e-位置"和"g-位置"是其中部 分暴露于溶劑的氨基酸殘基所位于的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)氨基酸殘基位置。在三鏈體卷曲螺 旋中，這些"e_位置"和"g_位置"位于在兩個空間上相鄰的α-螺旋之間形成的溝中，并 且相應(yīng)的氨基酸殘基通稱為"溝殘基"。Alphabody結(jié)構(gòu)的每一個七肽單位中的"b-位置"、 "c-位置"和"f-位置"是卷曲螺旋結(jié)構(gòu)中暴露于溶液中最多的位置。
[0207] 應(yīng)指出，在現(xiàn)有技術(shù)中，七肽可稱為"七肽重復"，因為該7個殘基的片段通常在真 實卷曲螺旋氨基酸序列中重復許多次。
[0208] 類型"abcdefg"的七肽基序（如本文中定義的）通常表示為"HPPHPPP"，而類型 "defgabc"的"七肽基序"通常表示為"HPPPHPP"，其中符號" H"表示非極性或疏水性氨基酸 殘基，符號"P"表示極性或親水性氨基酸殘基。位于a-或d-位置的典型的疏水殘基包括脂 肪族（例如，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸）或芳香族（例如，苯丙氨酸）氨基酸殘 基。卷曲螺旋序列內(nèi)的七肽并不總是遵從疏水性和極性殘基的理想模式，因為極性殘基偶 爾位于" Η "位置以及疏水性殘基偶爾位于" P "位置。因此，模式" HPPHPPP "和" HPPPHPP "被當 作理想模式或特征性參照基序。偶爾地，特征性七肽基序表示為"HPPHCPC"或"HxxHCxC"， 其中"Η"和"P"具有與上述相同的含義，"C"表示帶電荷的殘基（賴氨酸、精氨酸、谷氨酸 或天冬氨酸），"x"表示任意（未指定的）天然氨基酸殘基。由于七肽可同樣地正好始于 d-位置，因此后面的基序也可寫為"HCPCHPP"或"HCxCHxx"。應(yīng)指出，單鏈Alphabody固有 地如此穩(wěn)定以至于它們不需要七肽e_和g_位置上帶電荷的（"C"）殘基之間的離子相互 作用的幫助。
[0209] 七肽重復序列（HRS)(如本文中定義的）通常用指示常規(guī)七肽位置的符號表示 為（abcdefg) n* (defgabc)n，或用指示七肽基序的符號表示為（HPPHPPP)n* (HPPPHPP) n，條件是并非HRS中的所有氨基酸殘基都應(yīng)當嚴格遵從疏水性和極性殘基的理想模 式。為了鑒定七肽重復序列和/或它們的邊界，這些七肽重復序列包含偏離共有基序的 氨基酸或氨基酸序列，并且，如果手上僅有氨基酸序列信息，則Lupas等人的COILS法 (Scien ce1991，252:1162-1164)是用于七肽重復序列及其邊界的測定或預(yù)測，以及用于七 肽位置的分配的適當方法。此外，可基于在比一級結(jié)構(gòu)（即，氨基酸序列）更高水平上的 知識解析七肽重復序列。事實上，可基于二級結(jié)構(gòu)信息（即，α-螺旋性）或基于三級結(jié)構(gòu) (即，蛋白質(zhì)折疊）信息來鑒定和描繪七肽重復序列。假定的HRS的典型特征是α -螺旋 結(jié)構(gòu)。另一個（強）標準是序列或片段在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)中的涉及。已知形成規(guī)則卷曲螺旋 結(jié)構(gòu)（即無 Brown等人Proteinsl996, 26:134-145中描述的斷續(xù)或間斷）的任何序列或片 段在本文中被當作HRS。同樣地和更具體地，HRS片段的鑒定可基于高分辨率3-D結(jié)構(gòu)信 息（X-射線或NMR結(jié)構(gòu)）。最后，但不限于此，除非存在相反的明確證據(jù)，或除非另有所指， 否則任何HRS片段的邊界可被定義為標準疏水性氨基酸殘基（選自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸）所位于的第一（分別地最后）a-或d-位置。
[0210] Alphabody結(jié)構(gòu)（如本文中定義的）的單鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)的接頭將Alphabody中的HRS 序列相互連接，更具體地將第一 HRS與第二HRS連接，以及將第二HRS與第三HRS連接。 Alphabody中的每一個接頭序列始于前一個HRS的最后一個七肽殘基之后的殘基并終止于 下一個HRS的第一個七肽殘基之前的殘基。通過二硫橋或化學交聯(lián)或一般地通過任何鏈間 連接（與鏈內(nèi)連接相反）的方法進行的HRS片段之間的連接被明確地排除在接頭片段的定 義內(nèi)（至少在Alphabody的上下文中），因為這將與單鏈Alphabody的定義矛盾。Alphabody 中的接頭片段優(yōu)選在構(gòu)象上是柔性的，以確保作為α-螺旋卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的3個七肽重復 序列的松弛（不受阻礙的）締合。此外，在Alphabody的上下文中，" L1"將表示接頭片段 1，即HRS1與HRS2之間的接頭，而" L2"表示接頭片段2,即HRS2與HRS3之間的接頭。用 于Alphabody結(jié)構(gòu)的適當接頭對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明了的，并且通?？梢允潜绢I(lǐng)域 中用于連接氨基酸序列的任何接頭，只要接頭在結(jié)構(gòu)上是柔性的即可，在這個意義上它們 不影響Alphabody的特征性三維卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。特定Alphabody結(jié)構(gòu)中的兩個接頭L1和 L2可以相同或可以不同。基于本文中的其它公開內(nèi)容，任選地在進行有限次數(shù)的常規(guī)實驗 后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定特定Alphabody結(jié)構(gòu)的最佳接頭。在具體實施方案中，接頭L1 和L2是由至少4個，特別地至少8個，更特別地至少12個氨基酸殘基組成的氨基酸序列， 因方便的原因選擇的非臨界上限為約30個氨基酸殘基。在一個具體的非限定性實施方案 中，優(yōu)選接頭序列中至少50%的氨基酸殘基選自脯氨酸、甘氨酸和絲氨酸。在其它非限定性 實施方案中，優(yōu)選至少60 %，例如至少70 %，例如80 %，更特別地90 %的接頭序列氨基酸殘 基選自脯氨酸、甘氨酸和絲氨酸。在其它具體實施方案中，接頭序列基本由極性氨基酸殘基 組成；在這樣的具體實施方案中，優(yōu)選至少50%，例如至少60%，例如70%或80%，更特別 地90%或達到100%的接頭序列氨基酸殘基選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、 組氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸。
[0211] 在某些具體實施方案中，Alphabody結(jié)構(gòu)中的接頭L1和L2的每一個獨立地是接 頭片段，所述片段分別共價地將HRS1連接于HRS2和將HRS2連接于HRS3,并且由至少4個 氨基酸殘基組成，優(yōu)選其中至少50%的所述氨基酸殘基選自脯氨酸、甘氨酸和絲氨酸。
[0212] Alphabody的"卷曲螺旋"結(jié)構(gòu)被認為是α -螺旋七肽重復序列的裝配體，其中螺 旋七肽重復序列是如上文中定義的；
[0213] ?所述α -螺旋七肽重復序列以左手超扭曲（超螺旋）纏繞（彼此環(huán)繞）；
[0214] · a-和d-位置上的核心殘基形成裝配體的核心，其中它們以Socket algorithm(Walshaw and Woolfson J Mol Biol2001, 307:1427-1450)中定義的以及Lupas 和Gruber Adv Protein Chem2005, 70:37-78 中反復提及的曰內(nèi)件（knobs-into-holes)方 式彼此堆疊；
[0215] ?核心殘基被包裝在規(guī)則的核心填充層中，其中所述層是如Schneider等人Fold Desl998, 3:R29-R40 中定義的。
[0216] 不要將Alphabody結(jié)構(gòu)的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)與普通三螺旋束混淆。區(qū)分真正的卷曲螺 旋與非-卷曲螺旋螺旋束的標準提供于Desmet等人W02010/066740A1和Schneider等人 Fold Desl998, 3:R29-R40中；這樣的標準實質(zhì)上分別與卷曲螺旋和螺旋束的核心殘基堆疊 中結(jié)構(gòu)對稱的存在或不存在相關(guān)。同樣地，卷曲螺旋和螺旋束的左手超螺旋的存在或不存 在分別地提供了區(qū)分兩種類型的折疊的有用標準。
[0217] 雖然上述標準原則上適用于2鏈體、3鏈體、4鏈體和甚至更多鏈體卷曲螺旋，但本 文中設(shè)想的Alphabody結(jié)構(gòu)限制于3鏈體卷曲螺旋。可將Alphabody的卷曲螺旋區(qū)域組 織成所有α -螺旋平行取向（對應(yīng)于屬于申請者Complix NV的EP2161278中描述的"平 行Alphabody"）或3個α-螺旋之一與另外兩個α-螺旋反向平行（對應(yīng)于屬于申請者 Complix NV 的 W02010/066740 中描述的"反向平行 Alphabody"）。
[0218] Alphabody結(jié)構(gòu)（如本文中定義的）的α -螺旋部分通常大致與七肽重復序列一 致，盡管在邊界附近存在差異。例如，具有明確的七肽基序的序列片段可以因一個或多個螺 旋扭曲殘基（例如，甘氨酸或脯氨酸）的存在而為非-螺旋的。相反地，接頭片段的部分可 以是α-螺旋，盡管其位于七肽重復區(qū)域外部。此外，一個或多個α-螺旋七肽重復序列的 任何部分也被視為單鏈Alphabody的α -螺旋部分。
[0219] Alphabody結(jié)構(gòu)（如本文中定義的）（的α-螺旋）的溶劑定向區(qū)域是重要的 Alphabody區(qū)域。鑒于Alphabody中的α-螺旋的構(gòu)型，其中七肽a-和d-位置上的殘基形 成核心，溶劑定向區(qū)域主要由b-、c_和f-殘基形成。每個單鏈Alphabody上存在3個這樣 的區(qū)域，即每一個α-螺旋中存在一個。這樣的溶劑定向區(qū)域的任何部分也被當作溶劑定 向區(qū)域。例如，由來自Alphabody α -螺旋中的3個連續(xù)七肽的b-、c-和f-殘基組成的亞 區(qū)域也形成溶劑定向表面區(qū)域。
[0220] 參與Alphabody中兩個相鄰α -螺旋之間的溝（的表面）形成的殘基通常位于七 肽e-和g-位置上，但一些更加暴露的b-和c-位置以及一些大部分被包埋的核心a-和 d-位置也可促成溝表面；這基本上取決于置于這些位置上的氨基酸側(cè)鏈的尺寸。如果空間 上相鄰的α -螺旋平行，則溝的一半由來自第一螺旋的b和e-殘基形成，溝的另一半由第 二螺旋由第二螺旋的c-和g-殘基形成。如果所述空間上相鄰的α-螺旋為反向平行，則存 在兩種可能性。在第一可能性中，溝的兩半都由b-和e-殘基形成。在第二種可能性中，溝 的兩半都由c-和g-殘基形成。3種類型的可能的溝在本文中由它們的主要溝形成（e-和 g_)殘基來表示：如果螺旋是平行的，則溝稱為e/g-溝；如果螺旋是反向平行的，則溝稱為 e/e-溝或g/g-溝。平均Alphabody具有3個e/g-溝，而反向平行Alphabody具有一個e/ g_溝、一個e/e-溝和一個g/g-溝。Alphabody溝的任何部分也被視為溝區(qū)域。
[0221] 在其它方面，提供了（Alphabody)多肽，所述多肽包含至少一個本文中定義的 Alphabody或基本上由其組成，以及任選地包含一個或多個其它基團、部分或殘基（任選地 通過一個或多個接頭連接）。
[0222] 因此，本文中設(shè)想的多肽可任選地包含一個或多個其它基團、部分或殘基以結(jié)合 其它目標靶或靶蛋白。應(yīng)當清楚，這樣的其它基團、殘基、部分和/或結(jié)合位點可以給或可 以不給本文中設(shè)想的Alphabody (和/或其所存在于的多肽或組合物）提供其它功能性，以 及可以修飾或可以不修飾本文中包括的Alphabody (Alphabodies)的性質(zhì)。這樣的基團、殘 基、部分或結(jié)合單位還可以例如是可具有生物和/或藥理活性的化學基團。
[0223] 在具體實施方案中，將這些基團、部分或殘基在N-或C-末端連接于Alphabody結(jié) 構(gòu)。然而，在一些具體實施方案中，將一個或多個基團、部分或殘基連接于Alphabody結(jié)構(gòu) 的體部，例如連接于α-螺旋中的游離半胱氨酸。
[0224] 在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含一個或多個已被化學修飾的 Alphabody。例如，這樣的修飾可包括引入或連接一個或多個官能團、殘基或部分至 Alphabody結(jié)構(gòu)。這些基團、殘基或部分可為多肽賦予一個或多個期望的性質(zhì)或功能性。這 樣的官能團的實例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明了的。
[0225] 例如，這樣的官能團至Alphabody結(jié)構(gòu)的引入或連接可導致多肽的半衰期、溶解 度和/或穩(wěn)定性的增加和/或多肽的毒性的減弱，或多肽的任何不期望副作用的消除或減 弱，和/或其它有利的性質(zhì)。
[0226] 在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含已被化學修飾來增加其生物或血漿半 衰期的Alphabody,所述化學修飾例如通過PEG化，通過添加其結(jié)合的基團或為血清蛋白的 基團（例如血清白蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白）或，一般地，通過將Alphabody連接至增加多肽半衰期 的部分進行。作為實例，可使用馬來酰亞胺mPEG40kD PEG(Jenkem Technology)或具有不 同分子量的其它PEG部分在暴露于溶劑的半胱氨酸處對Alphabody進行PEG化。
[0227] 在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含已被融合于蛋白結(jié)構(gòu)域或肽以增加其 生物或血漿半衰期的Alphabody，例如融合了其所結(jié)合的結(jié)構(gòu)域或為血清蛋白（例如血清 白蛋白或免疫球蛋白的Fc部分）的結(jié)構(gòu)域。所述蛋白結(jié)構(gòu)域可以是結(jié)合血清蛋白質(zhì)（例 如血清白蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白）的Alphabody。
[0228] 在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含Alphabody,所述Alphabody除它們的 靶結(jié)合（針對細胞內(nèi)靶，例如目標BCL-2蛋白家族的抗細胞凋亡成員）外，還結(jié)合血清蛋白 (例如血清白蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白或免疫球蛋白的Fc部分）以增加所述Alphabody的生物或血 漿半衰期。
[0229] 通常地，具有增加的半衰期的本文中設(shè)想的多肽的半衰期相較于缺乏用于半衰期 延長的上述裝備的對應(yīng)Alphabody的半衰期而言超過1周，同樣優(yōu)選地超過2周（在人中 或在用于PK評價的動物模型例如大鼠、狗、猴、小鼠、馬、豬、貓等中）。
[0230] 存在于本文中設(shè)想的多肽的Alphabody的特定修飾可包括一個或多個可檢測標 記或其它信號生成基團或部分的引入，這取決于標記多肽的期望用途。
[0231] 其它特定的修飾可包括螯合基的引入，例如用于螯合一個或多個金屬或金屬陽離 子。
[0232] 特定修飾可包括作為特定結(jié)合對（例如生物素_(鏈霉）抗生物素蛋白結(jié)合對） 中一個部分的官能團的引入。
[0233] 對于一些應(yīng)用，特別地對于其中期望殺死表達本文中設(shè)想的多肽特異性結(jié)合的靶 的細胞（例如，在癌癥的治療中），或期望減少或減緩這樣的細胞的生長和/或增殖的那些 應(yīng)用中，本文中設(shè)想的多肽可包含連接于毒素或毒性殘基或部分的Alphabody結(jié)構(gòu)。
[0234] 其它潛在化學和酶促修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明了的。
[0235] 在具體實施方案中，所述一個或多個基團、殘基、部分通過一個或多個適當?shù)慕宇^ 或間隔子連接于Alphabody結(jié)構(gòu)。
[0236] 在其它具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽包含兩個或更多個靶特異性 Alphabody。在這樣的具體實施方案中，所述兩個或更多個祀特異性Alphabody可以以直接 或間接的方式彼此連接（偶聯(lián)、串聯(lián)、互聯(lián)、融合）。在其中所述兩個或更多個Alphabody彼 此直接連接的實施方案中，可在無間隔子或接頭片段或部分幫助的情況下連接它們?；蛘撸?在其中所述兩個或更多個Alphabody彼此間接連接的實施方案中，可通過適當?shù)拈g隔子或 接頭片段或接頭部分連接它們。
[0237] 在其中兩個或更多Alphabody直接連接的實施方案中，它們可以單鏈融合蛋白 (即，為其中兩個或更多個Alphabody序列在單個連續(xù)氨基酸序列中彼此直接相接的單鏈 蛋白構(gòu)建體）形式生成?；蛘?，Alphabody的直接連接還可通過在兩個Alphabody之間形 成二硫鍵的半胱氨酸來實現(xiàn)（即，在適當?shù)臈l件，例如氧化條件下，兩個各自包含游離半胱 氨酸的Alphabody可彼此反應(yīng)而形成其中組成性單體通過二硫橋共價連接的二聚體）。
[0238] 或者,在其中兩個或更多個Alphabody間接連接的實施方案中，它們可通過適當 的間隔子或接頭片段或接頭部分彼此連接。在這樣的實施方案中，它們還可被產(chǎn)生為單 鏈融合構(gòu)建體（即，作為單鏈蛋白構(gòu)建體，其中兩個或更多個Alphabody序列在單個連續(xù) 氨基酸序列中彼此相隨，但其中Alphabody通過用作間隔子片段的適當選擇的氨基酸序 列片段的存在保持分隔）?；蛘?，Alphabody的間接連接還可通過氨基酸側(cè)鏈基團或通過 Alphabody N-或C-末端來實現(xiàn)。例如，在適當選擇的條件下，兩個各自包含游離半胱氨酸 的Alphabody可與同雙功能化合物反應(yīng)，產(chǎn)生其中組成性Alphabody通過所述同雙功能化 合物共價交聯(lián)的Alphabody二聚體。類似地，一個或多個Alphabody可通過反應(yīng)性側(cè)鏈基團 或末端與適當選擇的同或異雙功能化合物（用于蛋白質(zhì)的交聯(lián)）的任意組合來進行交聯(lián)。
[0239] 在包含連接的Alphabody的多肽的具體實施方案中，所述兩個或更多個連接的 Alphabody可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。所述兩個或更多個連接的 Alphabody還可具有相同的結(jié)合特異性或不同的結(jié)合特異性。所述兩個或更多個連接的 Alphabody還可具有相同的結(jié)合親和力或不同的結(jié)合親和力。
[0240] 用于在本文中設(shè)想的的多肽中偶聯(lián)不同Alphabody的適當間隔子或接頭對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明了的，其通?？梢允窃诒绢I(lǐng)域中用于連接肽和/或蛋白質(zhì)的任何接 頭或間隔子。具體地，這樣的接頭或間隔子適合用于構(gòu)建期望用于制藥用途的蛋白質(zhì)或多 肽。
[0241] 用于偶聯(lián)單鏈氨基酸序列中的Alphabody的一些特別適合的接頭或間隔子包括 例如但不限于多肽接頭，例如甘氨酸接頭、絲氨酸接頭、混合的甘氨酸/絲氨酸接頭、富 含甘氨酸和絲氨酸的接頭或主要由極性多肽片段組成的接頭。用于通過化學交聯(lián)偶聯(lián) Alphabody的一些特別適合的接頭或間隔子包括例如但不限于同雙功能化學交聯(lián)化合物， 例如戊二醛、酰亞胺酯類例如己二酸二甲酯（DMA)、辛二酸二甲酯（DMS)和庚二亞氨酸二甲 酯（DMP)或N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)酯例如二巰基雙（琥珀酰亞胺丙酸酯）（DSP)和二巰 基雙（磺酸琥珀酰亞胺丙酸酯）（DTSSP)。用于交聯(lián)的異雙功能試劑的實例包括但不限于具 有一個胺反應(yīng)性末端并且在另一端上具有巰基反應(yīng)性部分的交聯(lián)劑，或在一個末端上具有 NHS酯并且在另一個末端上具有SH反應(yīng)性基團（例如，馬來酰亞胺或吡啶基二硫化物）的 交聯(lián)劑。
[0242] 用于單鏈互聯(lián)的Alphabody構(gòu)建體的多肽接頭或間隔子可以是任何適當?shù)模ɡ?如，富含甘氨酸的）氨基酸序列，其具有1至50個氨基酸，例如1至30個，特別地1至10 個氨基酸殘基的長度。應(yīng)當清楚，間隔子的柔性程度和/或其它性質(zhì)可對本文中設(shè)想的最 終多肽的性質(zhì)（包括但不限于對于目標蛋白或?qū)τ谝环N或多種其它目標靶蛋白的親和力、 特異性或親合力）具有一定影響。應(yīng)當清楚，當兩個或更多個間隔子用于本文中設(shè)想的的 多肽時，這些間隔子可以相同或不同。在本說明書中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠確定用于偶聯(lián) 本文中設(shè)想的多肽中的Alphabody (而無需任何過度實驗負擔）的目的的最優(yōu)間隔子。
[0243] 本文中設(shè)想的連接的Alphabody多肽通?？赏ㄟ^如下方法來制備，所述方法包括 至少一個任選地通過一個或多個適當?shù)慕宇^，適當?shù)貙⒁粋€或多個Alphabody連接于所述 一個或多個其它基團、殘基、部分和/或其它Alphabody (以提供本文中設(shè)想的多肽）的步 驟。
[0244] 同樣地，本文中設(shè)想的多肽可通過如下方法來產(chǎn)生，所述方法至少包括以下步驟： (i)在適當?shù)乃拗骷毎虮磉_系統(tǒng)中表達本文中設(shè)想的多肽，和（ii)分離和/或純化本文 中設(shè)想的多肽。用于進行上述步驟的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。
[0245] [部分/片段/類似物/衍生物]
[0246] 本文中還提供了如本文中公開的多肽的部分、片段、類似物、突變體、變體和/或 衍生物，和/或包含Alphabody的一個或多個部分、片段、類似物、突變體、變體和/或衍生 物或基本上由其組成的多肽，只要這些部分、片段、類似物、突變體、變體和/或衍生物適合 用于本文中設(shè)想的預(yù)防、治療和/或診斷目的即可。
[0247] 本文中設(shè)想的這樣的部分、片段、類似物、突變體、變體和/或衍生物仍然能夠特 異性結(jié)合細胞內(nèi)靶，例如目標BCL-2蛋白家族的抗細胞凋亡成員。
[0248] [本文中設(shè)想的ALPHABODY、多肽和組合物的來源和形式]
[0249] 應(yīng)當指出，關(guān)于本文中設(shè)想的Alphabody、多肽或組合物（或用于表達它們的本文 中設(shè)想的核苷酸序列）的來源，本公開內(nèi)容不受限制。此外，關(guān)于產(chǎn)生或獲得本文中設(shè)想的 Alphabody、多肽或核苷酸序列的方式，本教導也不受限制。因此，本文中設(shè)想的Alphabody 可以是合成或半合成氨基酸序列、多肽或蛋白質(zhì)。
[0250] 本文中提供的Alphabody、多肽和組合物可以以基本上分離的形式（如本文中定 義的）存在，或可選擇地可形成本文中設(shè)想的多肽或組合物的部分，所述部分可包含至少 一個Alphabody或基本上由其組成，并且任選地還可包含一個或多個其它基團、部分或殘 基（全部任選地通過一個或多個適當?shù)慕宇^連接）。
[0251] [靶種類和交叉反應(yīng)性]
[0252] 基于本說明書，應(yīng)了解，對于預(yù)防性、治療性和/或診斷性應(yīng)用，本文中設(shè)想的多 肽和組合物原則上是針對人細胞內(nèi)靶或特異性結(jié)合人細胞內(nèi)靶。然而，當期望多肽和組合 物用于獸用目的時，它們可針對來自期望治療的物種的細胞內(nèi)靶或特異性結(jié)合所述細胞內(nèi) 靶，或它們至少與來自待治療的物種的細胞內(nèi)靶有交叉反應(yīng)。因此，特異性結(jié)合來自一個受 試物種的細胞內(nèi)靶的多肽和組合物可以顯示或可以不顯示與來自一個或多個其它受試物 種的細胞內(nèi)靶的交叉反應(yīng)性。當然，預(yù)期在用于人或動物的多肽的開發(fā)背景中，可開發(fā)結(jié)合 來自另一物種而非待治療物種的細胞內(nèi)靶的多肽來用于研究和實驗室測試。
[0253] 還預(yù)期本文中設(shè)想的多肽可結(jié)合細胞內(nèi)靶的許多天然存在的或合成的類似物、變 體、突變體、等位基因、部分和片段，例如細胞內(nèi)目標蛋白的天然存在的或合成的類似物、變 體、突變體、等位基因、部分和片段。更具體地，預(yù)期本文中設(shè)想的多肽至少可結(jié)合細胞內(nèi)靶 的如下類似物、變體、突變體、等位基因、部分和片段，所述類似物、變體、突變體、等位基因、 部分和片段（仍然）包含那些Alphabody和多肽所結(jié)合的（天然/野生型）細胞內(nèi)靶的結(jié) 合位點、部分或結(jié)構(gòu)域。
[0254] [核酸序列]
[0255] 在另一方面，提供了編碼包含一個或多個單鏈Alphabody結(jié)構(gòu)的Alphabody多肽 的核酸序列，所述核酸序列可通過本文中設(shè)想的方法獲得，以及包含這樣的核酸序列的載 體和宿主細胞。
[0256] 在其它方面，提供了編碼本文中設(shè)想的多肽（或其適當?shù)钠危┑暮怂嵝蛄?。這 些核酸序列在本文中也稱為本文中設(shè)想的核酸序列，其還可以是載體或基因構(gòu)建體或多核 苷酸的形式。核酸序列可以是合成或半合成序列、已從文庫（具體地，表達文庫）分離的核 苷酸序列、已通過PCR、使用重疊引物制備的核苷酸序列，或已使用本身已知的用于DNA合 成的技術(shù)制備的核苷酸序列。
[0257] 基因構(gòu)建體可以是DNA或RNA，優(yōu)選為雙鏈DNA。本文中設(shè)想的基因構(gòu)建體還可以 以適合于期望宿主細胞或宿主生物體的轉(zhuǎn)化（以適合用于整合進入期望宿主細胞的基因 組DNA的形式或于在期望宿主生物體中獨立復制、維持和/或遺傳的形式）的形式存在。例 如，基因構(gòu)建體可以以載體例如質(zhì)粒、粘粒、YAC、病毒載體或轉(zhuǎn)座子的形成存在。具體地，載 體可以是表達載體，即可在體外和/或體內(nèi)（例如在適當?shù)乃拗骷毎⑺拗魃矬w和/或表 達系統(tǒng)中）提供表達的載體。本文中設(shè)想的基因構(gòu)建體可包含將表達的Alphabody導向期 望的細胞內(nèi)或細胞外區(qū)室的適當?shù)那皩蛄?。例如，可將本文中設(shè)想的基因構(gòu)建體在pelB 前導序列位點插入適當載體以將表達的Alphabody導向細菌周質(zhì)空間。同樣地，可使載體 配備適當?shù)膯幼酉到y(tǒng)以例如最優(yōu)化Alphabody的產(chǎn)率。
[0258] 在其它方面，提供了包含編碼單鏈Alphabody或包含所述單鏈Alphabody的多肽 的核酸的載體，所述載體可通過本文中設(shè)想的方法獲得。
[0259] 在其它方面，提供了包含編碼包含可通過本文中設(shè)想的方法獲得的所述單鏈 Alphabody的多肽的核酸或包含這些核酸的載體的宿主細胞。因此，在具體實施方案中，利 用編碼包含可通過本文中描述的方法獲得的Alphabody的核酸序列并且能夠表達包含一 個或多個Alphabody結(jié)構(gòu)的多肽的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細胞。用于表達本文中設(shè)想的多肽 的宿主或宿主細胞的適當實例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明了的，包括任何適當?shù)恼婧嘶?原核細胞（例如，細菌細胞例如大腸桿菌（E.coli)、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、兩 棲動物細胞、植物細胞、魚細胞和昆蟲細胞），無論位于體外還是體內(nèi)。
[0260] [抑制性ALPHABODY、多肽和組合物]
[0261] 在具體實施方案中，本文中設(shè)想的特異性結(jié)合細胞內(nèi)目標靶分子的多肽能夠特異 性抑制、阻止或減弱細胞內(nèi)目標靶分子的活性和/或抑制、阻止或減弱這些細胞內(nèi)靶分子 在其中起作用的信號轉(zhuǎn)導和生物學機制及途徑。
[0262] 通過結(jié)合一個或多個特定的細胞內(nèi)靶，本文中設(shè)想的多肽和藥物組合物可用于阻 止或抑制一個或多個細胞內(nèi)靶之間的相互作用，從而阻止、抑制或減弱由那些細胞內(nèi)靶介 導的信號轉(zhuǎn)導途徑和/或調(diào)節(jié)其中牽涉那些細胞內(nèi)靶的生物途徑和機制。在具體實施方案 中，本文中設(shè)想的多肽和藥物組合物可用于影響、改變或調(diào)節(jié)受試者的免疫系統(tǒng)和/或一 個或多個特異性免疫反應(yīng)，所述免疫系統(tǒng)和/或所述免疫反應(yīng)牽涉本文中設(shè)想的多肽和組 合物的一種或多種所結(jié)合的細胞內(nèi)目標靶分子。
[0263] 因此，在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽和組合物特異性結(jié)合BCL-2蛋白家 族的抗細胞凋亡成員并抑制其。
[0264] 更具體地，使用本文中設(shè)想的多肽或組合物進行的"抑制"、"減弱"和/或"防止" 可表示相較于在相同條件下但不使用本文中設(shè)想的多肽或組合物時在相同測定中目標靶 蛋白的活性而言，抑制、減弱和/或阻止目標靶蛋白與其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用，或 抑制、減弱和/或阻止目標靶蛋白的活性，或抑制、減弱和/或阻止其中牽涉目標靶蛋白的 一個或多個生物或生理機制、作用、反應(yīng)、功能途徑或活性，水平達到例如至少10%，但優(yōu)選 地至少20 %，例如至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %或更多， 如使用適當?shù)捏w外、細胞或體內(nèi)測定測量的。此外，"抑制"、"減弱"和/或"阻止"還可指， 相較于相同的條件但無本文中設(shè)想的多肽或組合物存在時的情況而言，誘導目標靶蛋白對 于其一個或多個天然結(jié)合伴侶的親和力、親合力、特異性和/或選擇性的減弱，和/或誘導 目標靶蛋白對于其中存在目標靶蛋白的培養(yǎng)基或環(huán)境中一個或多個條件（例如pH、離子強 度、輔因子的存在等）的敏感性的減弱。在本說明書中，"抑制"、"減弱"和/或"阻止"還可 包括目標靶蛋白的活性的變構(gòu)性抑制、減弱和/或阻止。
[0265] 本文中設(shè)想的多肽對細胞內(nèi)目標靶分子的結(jié)合的結(jié)果可以是，在結(jié)合該靶后，相 較于在本文中設(shè)想的這樣的多肽或藥物組合物不存在的情況下靶對其天然存在的結(jié)合伴 侶的結(jié)合而言，其阻止、減弱或抑制該靶對其天然存在的結(jié)合伴侶或?qū)ζ渲辽僖粋€亞基的 結(jié)合達到至少20%，例如至少50%，如至少70%，至少80%，至少90%，至少95 %或更多， 如通過本領(lǐng)域已知的適當測定法測定的。或者，多肽對細胞內(nèi)靶分子的結(jié)合使得其仍然允 許靶分子結(jié)合其天然存在的結(jié)合伴侶，但相較于在本文中設(shè)想的這樣的多肽或藥物組合物 不存在的情況下細胞內(nèi)靶對其天然結(jié)合伴侶結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導而言，阻止、減弱或抑制可 通過細胞內(nèi)目標靶分子對其結(jié)合伴侶或至少其亞基的結(jié)合觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導達到至少20%， 例如至少50 %，例如至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %或更多，如通過本領(lǐng)域已知 的適當測定法測定的。
[0266] 如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將明了的，上述多肽和包含本文中設(shè)想的多肽的組合 物通常用作細胞內(nèi)靶介導的信號轉(zhuǎn)導（即通過細胞內(nèi)目標靶分子對其天然結(jié)合伴侶的結(jié) 合引起的信號轉(zhuǎn)導）以及由這樣的信號轉(zhuǎn)導誘導的生物學機制和作用的拮抗劑。
[0267] [激動性ALPHAB0DY、多肽和組合物]
[0268] 在某些非限定性實施方案中，本文中設(shè)想的多肽或組合物可特異性結(jié)合細胞內(nèi)目 標靶分子，從而增強、加強和/或激活該細胞內(nèi)靶和/或其天然結(jié)合伴侶之間的相互作用。 本文中設(shè)想的這樣的激動性多肽或組合物可特異性結(jié)合細胞內(nèi)目標靶分子，從而增強、力口 強和/或激活該細胞內(nèi)靶和/或其天然結(jié)合伴侶的生物活性和/或一個或多個生物學或生 理學機制、作用、反應(yīng)、功能或途徑，如使用適當?shù)捏w外、細胞或體內(nèi)測定測量的。如對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員來說將會很明了的，根據(jù)該具體實施方案的多肽和組合物通常用作細胞內(nèi)靶 介導的信號轉(zhuǎn)導（即通過細胞內(nèi)目標靶分子對其天然結(jié)合伴侶的結(jié)合引起的信號轉(zhuǎn)導）以 及由這樣的信號轉(zhuǎn)導誘導的生物學機制和作用的激動劑。
[0269] 因此，在這些具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽和藥物組合物可用于增強受試 者的一個或多個特異性免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)牽涉本文中公開的一種或多種多肽和組合 物所結(jié)合的細胞內(nèi)目標靶分子。結(jié)合某些細胞內(nèi)靶分子的本文中設(shè)想的激動性多肽或藥物 組合物可用于刺激或增強受試者的一個或多個免疫反應(yīng)，例如用以預(yù)防和/或治療特征在 于減弱的免疫反應(yīng)或可因具有減弱的免疫反應(yīng)而發(fā)生的疾病。
[0270] 另一個方面涉及用于產(chǎn)生多肽的方法，所述多肽包含對于一種或多種細胞內(nèi)靶蛋 白具有可檢測的親和力或具有抑制活性的至少一個Alphabody?；诒疚闹械倪M一步描述， 這樣的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是很明了的。
[0271] 因此在本文中還提供了本文中描述的多肽的不同應(yīng)用。具體地，本文中提供的多 肽可用于體外調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白的生物功能，例如用以影響（具體地抑制）細胞內(nèi)蛋白與天 然結(jié)合伴侶之間的相互作用。
[0272] [用于產(chǎn)生多肽的方法]
[0273] 本文中設(shè)想的多肽將對于細胞內(nèi)靶的結(jié)合親和力和進入細胞的能力結(jié)合起來。對 于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很清楚的是，可以設(shè)想不同的方法用于產(chǎn)生本文中描述的多肽，所 述方法始于靶特異性或多肽的內(nèi)化性質(zhì)。
[0274] 因此，在具體實施方案中，提供了如下方法，所述方法包括鑒定靶結(jié)合Alphabody 序列和隨后修飾所述結(jié)構(gòu)（通過添加氨基酸或Alphabody序列的實際修飾），以確保所得 Alphabody多肽的內(nèi)化。用于獲得對于給定祀有結(jié)合親和力的適當Alphabody的方法對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且在本文的下文中進行進一步描述。更具體地，本文中提 供了用于獲得能夠結(jié)合細胞內(nèi)BCL-2蛋白家族的MCL-1的Alphabody的方法。本申請還描 述了用于從其獲得能夠內(nèi)化進入細胞的多肽的不同方法。
[0275] 在可選擇的實施方案中，可預(yù)期所述實施方案始于多肽支架，所述多肽支架能夠 被內(nèi)化進入細胞，隨后對其進行修飾或篩選其靶結(jié)合性質(zhì)。在這些方法的具體實施方案 中，提供多肽文庫，其特征在于至少一個Alphabody結(jié)構(gòu)的存在，以及進一步地一個或多個 內(nèi)化區(qū)域的存在，或細胞穿透部分的存在，其中Alphabody的靶結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸變化 多樣。在這些實施方案中，可就對細胞內(nèi)目標靶的結(jié)合篩選文庫以獲得能夠結(jié)合所述細胞 內(nèi)靶的多肽。在其它實施方案中，可預(yù)期修飾具有細胞穿透能力的適當?shù)亩嚯闹Ъ芤砸?(例如基于模擬）適當?shù)慕Y(jié)合基序。
[0276] 最適當?shù)墨@得本文中設(shè)想的多肽的方法將取決于靶和內(nèi)化的方法。事實上，在給 定靶的結(jié)合基序已知的情況下，可將靶結(jié)合和細胞穿透性質(zhì)同時引入多肽。然而，對于其中 結(jié)合基序仍然未知的靶，必需包括對于在適合用于結(jié)合靶的那些位置上具有變化多樣的氨 基酸的Alphabody或多肽的文庫的篩選步驟。
[0277] [用于產(chǎn)生靶結(jié)合ALPHABODY的方法]
[0278] [利用文庫產(chǎn)生ALPHABODY的方法]
[0279] 在本文中設(shè)想的具體實施方案中，祀特異性Alphabody或Alphabody多肽可通過 如下方法獲得，所述方法包括產(chǎn)生Alphabody的隨機文庫和篩選文庫以獲得能夠特異性結(jié) 合目標靶（具體地細胞內(nèi)目標靶）的Alphabody多肽。這些方法詳細地描述于在Complix NV名下的公開國際專利申請No. W02012/092970。
[0280] 應(yīng)理解，W02012/092970中描述的方法的選擇步驟可通過通常稱為選擇法的方法 或通過通常稱為篩選法的方法來進行。兩種方法包括從包含期望和非期望組分的原始總集 (original ensemble)(即Alphabody文庫）鑒定期望的組分（即Alphabody文庫成員）和 隨后分離所述期望的組分。在選擇法的情況下，文庫成員通常通過其中應(yīng)用期望的性質(zhì)來 實現(xiàn)期望目的的步驟來分離；在這樣的情況下，期望的性質(zhì)通常限于對于給定的細胞內(nèi)目 標靶分子的高親和力性質(zhì)，并且期望的目的通常限于將這樣的高親和力文庫成員與其它成 員分離。這樣的方法通常稱為親和力選擇法，在本說明書，這樣的親和力選擇法將被用于單 鏈Alphabody文庫，以選擇對于細胞內(nèi)目標祀分子或其亞結(jié)構(gòu)域或亞區(qū)域具有高親和力的 Alphabody。同樣地可能的是通過調(diào)整適當?shù)倪x擇條件（例如短的溫育時間或長洗滌周期， 或如文庫選擇【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)的技術(shù)人員已知的其它條件）來選擇動力學性質(zhì)，例如對給定的 細胞內(nèi)目標靶分子的結(jié)合的高締合速率（on-rate)，或結(jié)合于所述靶的文庫成員的低離解 速率（off-rate)?；蛘撸诤Y選法的情況下，文庫成員通常通過這樣的步驟來分離，其中在 所述步驟中，單個地檢查所有文庫成員或至少一大批庫成員的給定的期望性質(zhì)，并且其中 保留具有這樣的期望性質(zhì)的成員，而棄除不具有這樣的期望性質(zhì)的成員；在這樣的情況下， 和在本說明書中，期望的性質(zhì)可涉及對于細胞內(nèi)目標靶分子或其亞結(jié)構(gòu)域或亞區(qū)域的高親 和力，或功能活性例如抗-細胞內(nèi)靶分子活性，包括細胞內(nèi)目標靶分子的活性的抑制、減弱 和/或阻止。用于產(chǎn)生本文中設(shè)想的多肽的方法的選擇步驟從而可通過（親和力）選擇技 術(shù)或通過基于親和力或基于活性的功能篩選技術(shù)來實現(xiàn)，兩個技術(shù)均導致選擇到包含相較 于文庫的非選擇多肽而言具有有益的（有利的、期望的、優(yōu)良的）親和力或活性性質(zhì)的至少 一個單鏈Alphabody的一種或多種多肽。
[0281 ] Alphabody對目標祀分子或蛋白的特異性結(jié)合可以以本身已知的任何適當方式來 測定，所述方式包括例如生物淘選、Scatchard分析和/或競爭性結(jié)合測定，例如放射免疫 測定（RIA)、酶免疫測定（EIA)和夾心競爭性測定，以及本領(lǐng)域已知的其不同變型。
[0282] 因此，在具體實施方案中，本說明書中使用的Alphabody文庫以噬菌體文庫的形 式提供，通過將噬菌體與被標記的靶分子接觸，隨后通過檢測或選擇性收集標記的結(jié)合靶 來收回結(jié)合性噬菌體，由此鑒定結(jié)合性Alphabod。通常地，可使用生物素化靶，其中產(chǎn)生結(jié) 合靶的Alphabody的噬菌體利用鏈霉抗生物素蛋白涂覆的支持物（例如磁珠）來捕獲。
[0283] 在具體實施方案中，用于產(chǎn)生一種或多種單鏈Alphabody或?qū)τ谀繕说鞍拙哂锌?檢測的結(jié)合親和力（如本文中定義的）的多肽的方法的選擇步驟可包括，通過反復執(zhí)行將 目標蛋白與單鏈Alphabody文庫或與本文中描述的單鏈Alphabody文庫的混合物接觸，隨 后從與所述蛋白接觸的單鏈Alphabody文庫或單鏈Alphabody文庫的混合物鑒定一種或 多種對于目標蛋白具有可檢測的結(jié)合親和力的單鏈Alphabody的步驟，來（進一步）對 Alphabody文庫或Alphabody文庫的混合物富集對于目標蛋白具有可檢測的結(jié)合親和力的 單鏈 Alphabody。
[0284] 通過與目標靶蛋白相互作用來選擇具有可檢測的體外活性的單鏈Alphabody (或 多肽）的步驟通常包括：
[0285] a)將單鏈Alphabody (或包含所述Alphabody的多肽）的文庫或單鏈Alphabody 文庫的混合物與細胞內(nèi)目標靶分子或其片段接觸，和
[0286] b)從文庫或文庫的混合物鑒定對細胞內(nèi)目標靶分子具有可檢測的體外活性的一 種或多種單鏈Alphabody或多肽。
[0287] 更具體地，細胞內(nèi)靶分子可以是膜錨定受體、可溶性受體或包含所述細胞內(nèi)靶分 子的一個或多個胞外結(jié)構(gòu)域的分子。
[0288] 更具體地，在本說明書中，對細胞內(nèi)靶分子的活性或?qū)毎麅?nèi)靶分子的活性的作 用可通過本領(lǐng)域已知的方式來測量。更具體地，這包括體外測定Alphabody或多肽對已知 的細胞內(nèi)靶介導的作用的效果。
[0289] 應(yīng)理解，本文中描述的選擇法還可以以篩選法的方式來進行。因此，如本說明書中 所用，術(shù)語"選擇"可包括選擇、篩選或選擇和/或篩選技術(shù)的任意適當組合。
[0290] [分離]
[0291] 在一些情況下，用于產(chǎn)生本文中設(shè)想的特異性結(jié)合細胞內(nèi)目標靶蛋白的 Alphabody多肽的方法還可包括以下步驟：從單鏈Alphabody或多肽文庫分離對于細胞內(nèi) 目標靶分子具有可檢測的結(jié)合親和力或?qū)λ霭蟹肿泳哂锌蓹z測的體外活性的至少一種 單鏈Alphabody或多肽。
[0292] 這些方法還可包括擴增對于細胞內(nèi)目標靶分子具有可檢測的結(jié)合親和力或可檢 測的體外活性的至少一種單鏈Alphabody (多肽）的步驟。例如，可通過再感染宿主細菌 和在生長培養(yǎng)基中進行溫育來擴增從本文中描述的方法的選擇步驟獲得的展示特定單鏈 Alphabody或多肽的噬菌體克隆。
[0293] 在具體實施方案中，這些方法可包括測定所述一種或多種能夠結(jié)合細胞內(nèi)靶分子 的Alphabody或多肽的序列。
[0294] 當在適當?shù)募毎蚴删w或顆粒上展示包含在Alphabody多肽序列的組、集 合或文庫中的Alphabody多肽序列時，有可能從所述細胞或噬菌體或顆粒分離編碼該 Alphabody多肽序列的核苷酸序列。這樣，選擇的Alphabody文庫成員的核苷酸序列可利用 常規(guī)測序法來測定。
[0295] 在其它具體實施方案中，用于產(chǎn)生本文中設(shè)想的Alphabody多肽的方法包括在適 當?shù)臈l件下在宿主生物體中表達所述核苷酸序列以獲得真實的期望的Alphabody多肽序 列的步驟?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行該步驟。
[0296] 此外，對于細胞內(nèi)目標靶分子具有可檢測的結(jié)合親和力或可檢測的體外活性的所 獲得的Alphabody或多肽序列，可以任選地它們的序列已被鑒定后，以可溶性蛋白構(gòu)建體 形成合成。
[0297] 例如，通過上述方法獲得的，可通過上述方法獲得的或通過上述方法選擇的 Alphabody或多肽可使用本領(lǐng)域已知的重組或化學合成法來合成。同樣地，通過上述方法獲 得的，可通過上述方法獲得的或通過上述方法選擇的Alphabody或多肽可通過基因工程技 術(shù)來產(chǎn)生。因此，用于合成通過上述方法獲得的，可通過上述方法獲得的或通過上述方法選 擇的Alphabody或多肽的方法可包括用編碼Alphabody或多肽序列（所述Alphabody或多 肽序列對于細胞內(nèi)目標靶分子具有可檢測的結(jié)合親和力或可檢測的體外活性）的核酸或 載體轉(zhuǎn)化或感染宿主細胞。因此，對于細胞內(nèi)目標靶分子具有可檢測的結(jié)合親和力或可檢 測的體外活性的Alphabody或多肽序列可通過重組DNA法來產(chǎn)生。編碼Alphabody或多肽 的DNA可使用常規(guī)方法來容易地合成。制備后，可將DNA引入表達載體，隨后可將所述表達 載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進入宿主細胞例如大腸桿菌或任何適當?shù)谋磉_系統(tǒng)，以在重組宿主細胞中 和/或這些重組宿主細胞所存在的培養(yǎng)基中獲得Alphabody或多肽的表達。
[0298] 應(yīng)理解，如蛋白質(zhì)表達和純化領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的，可用例如His-標簽或用 于容易純化的其它序列標簽標記（通常地在Alphabody的N端或C端末端）使用適當?shù)谋?達系統(tǒng)從表達載體產(chǎn)生的Alphabody或多肽。
[0299] 核酸或載體至宿主細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染可通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法 來實現(xiàn)，所述方法包括磷酸興-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、聚凝胺（polybrene) 介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和基 因槍法（biolistics)。
[0300] 用于表達期望的Alphabody或多肽的適當宿主細胞可以是任何真核或原核細胞 (例如，細菌細胞例如大腸桿菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、兩棲動物細胞、植物細 胞、魚細胞和昆蟲細胞），無論位于體外還是體內(nèi)。例如，宿主細胞可位于轉(zhuǎn)基因動物中。
[0301] 因此，本申請還提供了用于產(chǎn)生對于細胞內(nèi)目標靶分子具有可檢測的結(jié)合親和力 或可檢測的體外活性的Alphabody或多肽的方法，包括用編碼這樣的Alphabody的核酸序 列或載體轉(zhuǎn)染或感染宿主細胞，并在適當?shù)臈l件下表達所述Alphabody。
[0302] [序列合理化和專用文庫篩選]
[0303] 用于產(chǎn)生一種或多種靶特異性多肽的方法可任選地包括用于增強或最優(yōu)化靶特 異性多肽的結(jié)合特異性和/或功效的其它步驟或方法。
[0304] 在具體實施方案中，還可在進行用于產(chǎn)生一種或多種靶結(jié)合多肽的方法之后進行 涉及對獲得的或產(chǎn)生的Alphabody多肽序列進行合理化的步驟或方法。這樣的序列合理 化過程可包括鑒定或測定在已使用本文中描述的方法產(chǎn)生的針對特定目標靶分子的不同 Alphabody或多肽之間或之中保守的特定氨基酸殘基、氨基酸殘基位置、區(qū)段、基序或模式。 因此，該合理化過程可通過比較產(chǎn)生的特異于某一目標靶分子或蛋白的不同Alphabody或 多肽序列和鑒定這些序列之間的序列一致性來進行。這樣的過程可任選地通過使用用于分 子建模、交互式配體對接（interactive ligand docking)或生物統(tǒng)計數(shù)據(jù)挖掘的技術(shù)來支 持或進行。
[0305] 被鑒定為在針對特定目標靶分子的不同Alphabody結(jié)構(gòu)之間或之中保守的特定 氨基酸殘基、氨基酸殘基位置、區(qū)段、基序或模式可被視為促成靶特異性Alphabody的結(jié)合 或活性。
[0306] 在具體實施方案中，還可在上述序列合理化的過程之后，從已被鑒定為對于目 標靶分子是特異性的并已使用本文中描述的方法產(chǎn)生的不同Alphabody序列的組開始 Alphabody序列的新文庫。在這樣的所謂的"專用文庫"（已被鑒定為對于某一目標靶分子 是特異性的不同Alphabody序列的組）中，所述不同的Alphabody序列在確定的一組變化 多樣的氨基酸殘基位置中產(chǎn)生變化。該確定組的變化多樣的氨基酸殘基位置對應(yīng)于在不同 的靶結(jié)合Alphabody之間或之中保守的氨基酸殘基、區(qū)段、基序或模式所定位的位置外部 的那些位置。所獲得的Alphabody文庫被稱為Alphabody的"專用文庫"。隨后再次篩選這 些專用文庫以鑒定最佳祀結(jié)合Alphabody。
[0307] 因此，在這樣的專用Alphabody序列文庫的產(chǎn)生中，在不同Alphabody之間或之中 保守的氨基酸殘基、區(qū)段、基序或模式在文庫產(chǎn)生過程中保持恒定?？蓮倪@樣的專用文庫 鑒定和任選地分離對于目標靶分子具有增強的或最優(yōu)化的結(jié)合特異性和/或體外活性的 Alphabody 序列。
[0308] 在具體實施方案中，在上述序列合理化的過程后，還可從已被鑒定為對于目標 靶分子是特異性的并已使用本文中設(shè)想的方法產(chǎn)生的不同Alphabody序列的組生成 Alphabody序列的新文庫。在這樣的所謂的"增敏（spiked)文庫"（已被鑒定為對于某一 目標祀分子是特異性的不同Alphabody序列的組）中，所述不同的Alphabody序列通過在 有限數(shù)目的隨機選擇的位置上引入隨機氨基酸置換來產(chǎn)生變化。如文庫產(chǎn)生領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù) 人員已知的，易錯PCR是產(chǎn)生"增敏文庫"的方便方法。這還可使用DNA合成領(lǐng)域中的技術(shù) 人員已知的增敏寡核苷酸通過直接DNA合成法來方便地實現(xiàn)。
[0309] 因此，用于產(chǎn)生一種或多種靶結(jié)合多肽的方法還可在從隨機文庫中鑒定兩種或更 多種祀結(jié)合Alphabody后包括如下步驟：
[0310] -比較產(chǎn)生的結(jié)合目標祀蛋白的Alphabody序列，
[0311] -鑒定在這些不同Alphabody序列之間或之中保守的氨基酸殘基、氨基酸殘基位 置、區(qū)段、基序或模式，和：
[0312] -從所比較的兩個或更多個Alphabody序列的至少一個開始，產(chǎn)生spiked文庫， 其中文庫包含不同的在有限數(shù)目的隨機選擇的位置上變化多樣的Alphabody或多肽序列， 或產(chǎn)生專用文庫，其中文庫包含在一組氨基酸位置中變化多樣的不同Alphabody或多肽序 列，所述氨基酸位置不是在所述不同的靶結(jié)合Alphabody序列之間或之中保守的氨基酸殘 基、氨基酸殘基位置、區(qū)段、基序或模式，
[0313] -從隨機文庫選擇和/或鑒定那些對于目標靶分子具有增強的或最優(yōu)化的結(jié)合特 異性和/或體外活性的Alphabody或多肽序列，和任選地
[0314] -分離這些對于目標靶分子具有增強的或最優(yōu)化的結(jié)合特異性和/或體外活性的 Alphabody或多肽序列。
[0315] 應(yīng)理解，用于產(chǎn)生專用或spiked文庫以及選擇、鑒定和分離對于目標靶分子具有 增強的或最優(yōu)化的結(jié)合特異性和/或體外活性的Alphabody或多肽序列的方法中包括的步 驟，如上所述，可以以與針對用于產(chǎn)生靶結(jié)合性Alphabody或多肽的方法的對應(yīng)步驟所描 述的方式相似地進行。
[0316] 如本文中進一步描述的，存在于本文中設(shè)想的多肽內(nèi)的Alphabody結(jié)構(gòu)中的氨基 酸殘基總數(shù)可在約50至約210個的范圍內(nèi)，這主要取決于每個七肽重復序列中的七肽的數(shù) 目和互聯(lián)七肽重復序列的柔性接頭的長度。關(guān)于本文中提供的多肽或組合物的部分、片段、 類似物或衍生物在它們的長度和/或尺寸上不受特別限制，只要這樣的部分、片段、類似物 或衍生物仍然具有它們所源自的多肽或組合物的生物功能并且仍然可用于設(shè)想的（藥理 學）目的即可。
[0317] 應(yīng)當注意，定向進化法（例如DNA改組法）還可用于從已被鑒定為對于目標靶分 子是特異性的一個或多個不同Alphabody序列開始構(gòu)建Alphabody文庫。還可將這樣的 "定向進化"文庫選擇和/或鑒定那些對于目標靶分子具有增強的或最優(yōu)化的結(jié)合特異性和 /或體外活性的Alphabody序列。
[0318] [基于模擬生產(chǎn)ALPHABODY的方法]
[0319] 在可選擇的實施方案中，提供了基于模擬生產(chǎn)對于細胞內(nèi)靶分子具有可檢測的結(jié) 合親和力或抑制活性的多肽的方法。應(yīng)理解，Alphabody結(jié)構(gòu)的特異性靶結(jié)合位點的移植 可在引入細胞穿透性質(zhì)之前或之后進行。因此，應(yīng)理解，可對Alphabody結(jié)構(gòu)本身或?qū)Π?這樣的Alphabody結(jié)構(gòu)或由其組成的多肽進行下文中針對本文中的方法所描述的步驟。具 體地，用于產(chǎn)生祀特異性Alphabody結(jié)構(gòu)的這樣的方法至少包括如下步驟：
[0320] (a) Alphabody螺旋的鑒定，所述螺旋被選擇用于模擬結(jié)合該目標靶分子的配體的 結(jié)合位點的至少部分，和
[0321] (b)該特定Alphabody α -螺旋中的區(qū)段的確定，所述區(qū)段用于模擬結(jié)合該目標靶 分子的所述配體的所述結(jié)合位點。
[0322] 該方法詳細地公開于在Complix NV名下的公開國際專利申請W02012/093013中。
[0323] [藥物組合物]
[0324] 在進一步的方面，提供了包含一種或多種本文中設(shè)想的多肽和/或核酸序列和任 選地至少一種藥學上可接受的載體的藥物組合物（在本文中也稱為本文中設(shè)想的藥物組 合物）。根據(jù)某些具體實施方案，本文中設(shè)想的藥物組合物還可任選地包含至少一種其它藥 物活性化合物。
[0325] 本文中設(shè)想的藥物組合物可用于診斷、預(yù)防和/或治療與細胞內(nèi)目標靶分子相關(guān) 的疾病和障礙。具體地，本申請?zhí)峁┝税环N或多種本文中設(shè)想的多肽的藥物組合物，其 適合在溫血動物中，具體地在哺乳動物中，更具體地在人類中進行預(yù)防性、治療性和/或診 斷性使用。
[0326] 還提供了包含一種或多種本文中設(shè)想的多肽的藥物組合物，所述藥物組合物可在 與細胞內(nèi)目標靶分子（例如BCL-2蛋白家族的抗細胞凋亡成員）相關(guān)和/或由所述細胞內(nèi) 目標靶分子介導的一種或多種疾病、障礙或病況的預(yù)防和/治療中用于獸用目的。
[0327] -般而言，對于制藥用途，可將本文中設(shè)想的多肽配制為藥物制劑或組合物，所述 制劑或組合物包含至少一種本文中設(shè)想的Alphabody或多肽和至少一種藥學上可接受的 載體、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，和任選地一種或多種其它藥物活性多肽和/或化合物。 這樣的制劑可適合于口服、胃腸外、局部施用或適合于通過吸入施用。因此，同樣取決于待 使用的具體藥物制劑或組合物，本文中設(shè)想的Alphabody或多肽和/或包含所述Alphabody 或多肽的組合物可以例如通過口服、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、經(jīng)皮膚、局部途徑，通過栓 齊U，通過吸入來施用。臨床醫(yī)生將能夠選擇適當?shù)氖┯猛緩胶痛谶@樣的施用中使用的適 當?shù)乃幬镏苿┗蚪M合物。
[0328] 藥物組合物還可包含適當?shù)恼澈蟿?、崩解劑、甜味劑或調(diào)味劑。可以例如用明膠、 錯或糖等涂覆片劑、丸劑或膠囊。此外，可將本文中設(shè)想的Alphabody和多肽摻入持續(xù)釋放 制劑和裝置。
[0329] 適合用于注射或輸注的藥物劑型可包括包含活性成分的無菌水溶液或分散體或 無菌粉劑，所述無菌粉劑適合用于臨時制備無菌可注射或可輸注溶液或分散體（任選地封 裝在脂質(zhì)體中）。在所有情況下，最終的劑型必須在制造和貯藏條件下是無菌的、流體的和 穩(wěn)定的。液體載體或媒介物可以是溶劑或液體分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇（例如， 甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、植物油、無毒甘油酯及其適當?shù)幕旌衔??？扇芜x地添加抗 細菌劑和抗真菌劑等。
[0330] 本文中設(shè)想的多肽的有用劑量可通過測定它們的體外活性和/或在動物模型中 的體內(nèi)活性來進行測定。用于將小鼠和其它動物中的有效劑量外推至人的方法對于本領(lǐng)域 技術(shù)來說是已知的。
[0331] 用于預(yù)防和/或治療所需的本文中設(shè)想的多肽的量不僅可隨選擇的具體 Alphabody或多肽而變化而且還可隨施用途徑、待治療的病況的性質(zhì)以及患者的年齡和病 況而變化，并且最終憑巡診醫(yī)生或臨床醫(yī)生自行處理。同樣地，取決于靶細胞、腫瘤、組織、 移植物或器官，本文中設(shè)想的Alphabody和多肽的劑量可變化。
[0332] 按照適合用于預(yù)防和/或治療待預(yù)防或治療的疾病或障礙的治療方案，施用本文 中設(shè)想的多肽和/或包含所述多肽的組合物。臨床醫(yī)生通常能夠確定適當?shù)闹委煼桨?。?般而言，治療方案會包括以一個或多個藥物有效量或劑量施用一種或多種多肽，或一種或 多種包含所述多肽的組合物。
[0333] 可以以單次劑量或以適當間隔施用的分份劑量（可再次地以亞劑量提供其）方便 地提供期望的劑量。施用方案可包括長期（即，至少兩周，例如數(shù)月或數(shù)年）或每日治療。
[0334] 以由執(zhí)業(yè)醫(yī)生基于病況的嚴重度和待治療的患者以及其它因素決定的量施用本 文中設(shè)想的多肽。通常地，對于每一種疾病適應(yīng)征，將測定最佳劑量，從而指定每日每kg體 重待施用（以單份日劑量的形式連續(xù)地進行的（例如通過輸注），或在一天的過程中以多個 分份劑量的形式進行的）的量。取決于本文中提及的因素，臨床醫(yī)生通常能夠確定適當?shù)?日劑量。也清楚的是，在特定情況下，臨床醫(yī)生可以例如基于上述因素和他的專業(yè)判斷而選 擇偏離這些量。
[0335] 具體地，可將本文中設(shè)想的多肽與其它藥物活性化合物或成分組合使用，所述其 它藥物活性化合物或成分用于或可用于預(yù)防和/或治療本文中所述的疾病和障礙，作為所 述組合使用的結(jié)果可以獲得或不獲得協(xié)同作用。這樣的化合物和成分以及施用它們的途 徑、方法和藥物制劑或組合物的實例對于臨床醫(yī)生來說是明了的。
[0336] [預(yù)防性、治療性和/或診斷性應(yīng)用]
[0337] 根據(jù)其它方面，特異性結(jié)合細胞內(nèi)目標靶的本文中設(shè)想的多肽可用于制備藥劑， 所述藥劑用于預(yù)防和/或治療其中牽涉所述細胞內(nèi)靶分子的至少一種細胞內(nèi)靶介導的疾 病和/或障礙。因此，本申請?zhí)峁┝颂禺愋越Y(jié)合細胞內(nèi)靶的多肽和藥物組合物，例如但不限 于BCL-2蛋白家族的抗-細胞凋亡成員，以用于預(yù)防和/或治療其中牽涉所述細胞內(nèi)靶分 子的至少一種細胞內(nèi)靶介導的疾病和/或障礙。在具體實施方案中，還提供了用于預(yù)防和 /或治療至少一種細胞內(nèi)靶介導的疾病和/或障礙的方法，其包括給有此需要的受試者施 用藥物活性量的一種或多種本文中設(shè)想的多肽和/或藥物組合物。具體地，藥物活性量可 以是這樣的量，該量足以（在循環(huán)中產(chǎn)生一定水平的多肽）抑制、阻止或減少（或在本文中 設(shè)想的激動性Alphabody和多肽的情況下：增強、促進或增加）細胞內(nèi)靶（例如但不限于 BCL-2蛋白家族的抗-細胞凋亡成員），或它們的生物或藥理學活性和/或其中牽涉它們的 生物途徑或信號轉(zhuǎn)導。
[0338] 待用本文中描述的多肽治療的受試者或患者可以任何溫血動物，但具體地是哺乳 動物，更具體地是人，所述動物或人患有或有風險患有其中牽涉本文中描述的多肽所特異 性結(jié)合的細胞內(nèi)靶分子的疾病和障礙。
[0339] 取決于牽涉的具體疾病或障礙，本文中描述的多肽和包含所述多肽的組合物的功 效可使用任何適當?shù)捏w外測定、基于細胞的測定、體內(nèi)測定和/或本身已知的動物模型或 其任意組合來測定。適當?shù)臏y定和動物模型對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明了的。
[0340] 取決于牽涉的細胞內(nèi)靶，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常能夠選擇適當?shù)捏w外測定、細胞測 定或動物模型來測試本文中描述的多肽對細胞內(nèi)靶分子的結(jié)合或它們影響這些細胞內(nèi)靶 分子活性和/或其中牽涉這些細胞靶分子的生物學機制的能力；以及它們在一種或多種與 細胞內(nèi)靶分子相關(guān)的疾病和障礙方面的治療和/或預(yù)防作用。
[0341] 因此，提供了用作藥劑，更具體地用于治療選自下述的疾病或障礙的方法中的包 含至少一個Alphabody或基本上由其組成的多肽，所述至少一個Alphabody能夠被內(nèi)化入 細胞并且特異性結(jié)合在細胞內(nèi)具有生物活性的細胞內(nèi)靶分子，所述疾病或障礙選自癌癥、 感染性疾病、造血系統(tǒng)疾病、代謝疾病、免疫疾病、神經(jīng)性障礙、增殖性障礙、心血管疾病和 炎性疾病。在具體實施方案中，本文中設(shè)想的多肽被用于治療、預(yù)防和/或診斷癌癥和腫瘤 病況。癌癥或腫瘤病況的實例包括但不限于纖維肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉 瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、Ewing瘤、 平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、胃癌、食管癌、直腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、頭頸部 腫瘤、皮膚癌、腦癌、鱗狀細胞癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管 原癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、Wilms瘤（、宮頸癌、 睪丸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞 瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑 色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。
[0342] 本文中設(shè)想的多肽還可用于治療多種增殖性障礙。增殖性障礙的實例包括造血 腫瘤性障礙和細胞增殖和/或分化障礙，例如但不限于上皮細胞增生、硬化性腺病和小導 管乳頭狀瘤；腫瘤，例如，間質(zhì)瘤例如纖維腺瘤、葉狀瘤和肉瘤以及上皮腫瘤例如巨大導管 乳頭狀瘤；乳腺的癌包括原位（非侵襲性）癌，包括原位導管癌（包括佩吉特?。┖驮?小葉癌，和侵襲性（浸潤性）癌，包括但不限于浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、髓樣癌、膠質(zhì) (粘蛋白狀的）癌、小管癌和侵襲性乳頭狀癌（invasive papillary carcinoma)、混合性惡 性腫瘤（miscellaneous malignant neoplasms)、男子乳腺發(fā)育、支氣管原癌、包括類腫瘤 綜合征、細支氣管肺泡癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、例如支氣管類癌、各種腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤；胸膜的 病狀，包括炎性胸腔積液、非炎性胸腔積液、氣胸和胸膜腫瘤，包括孤立性纖維瘤（胸膜纖 維瘤）、惡性間皮細胞瘤、非腫瘤性息肉、腺瘤、家族性綜合征（familial syndromes)、結(jié)直 腸致癌發(fā)生、結(jié)直腸癌、類癌瘤、結(jié)節(jié)性增生、腺瘤和惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性腫 瘤、體腔上皮的腫瘤、漿液性腫瘤（serous tumors)、粘液性瘤、卵巢子宮內(nèi)膜樣瘤、透明細 胞腺癌、囊腺纖維瘤、Brenner瘤、表面上皮腫瘤（surface epithelial tumors);生殖細胞 腫瘤例如成熟（良性）畸胎瘤、單胚層畸胎瘤、未成熟畸胎瘤、無性細胞瘤、內(nèi)胚層竇瘤、絨 毛膜癌；性索間質(zhì)腫瘤例如顆粒-卵泡膜細胞、泡膜細胞瘤、男性母細胞瘤、hill細胞瘤和 性腺母細胞瘤；和轉(zhuǎn)移性腫瘤例如Krukenberg瘤。
[0343] 本文中設(shè)想的多肽還可用于治療多種免疫障礙，例如但不限于炎性疾病或障礙， 或自身免疫疾病或障礙。
[0344] 本文中設(shè)想的多肽還可用于治療造血障礙或疾病，包括但不限于自身免疫疾病 (包括，例如，糖尿病、關(guān)節(jié)炎（包括類風濕關(guān)節(jié)炎、幼年型類風濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬 關(guān)節(jié)炎）、多發(fā)性硬化、腦脊髓炎、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、 皮炎（包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎）、銀屑病、干燥綜合征、克羅恩氏病、口瘡性潰瘍、虹 膜炎、結(jié)膜炎、角結(jié)膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、 直腸炎、藥疹、麻風病、麻風結(jié)節(jié)性紅斑、自身免疫性葡萄膜炎、變應(yīng)性腦脊髓炎、急性壞死 性腦病、特發(fā)性雙向進行性感覺神經(jīng)性聽力喪失（idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)、再生障礙性貧血、單純紅細胞性貧血、特發(fā)性血小板減少、 多軟骨炎、Wegener" s氏肉芽腫、慢性活動型肝炎、斯-約二氏綜合征、特發(fā)性脂肪瀉、扁平 苔癬、格雷夫斯病、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、葡萄膜炎和間質(zhì)肺纖維化（interstitial lung fibrosis))、移植物抗宿主病、移植的病例（cases of transplantation)和過敏癥。
[0345] 本文中設(shè)想的多肽還可用于治療心血管障礙（例如，炎癥性障礙），包括但不限 于動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風、血栓癥、動脈瘤、心力衰竭、缺血性心臟病、心絞痛、心臟 粹死、高血壓心臟?。环枪跔顒用}血管?。╪on-coronary vessel disease)、例如小動脈硬 化、小血管病、腎病、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥、高脂血癥、黃瘤病、哮喘、高血壓、肺氣 腫和慢性肺?。换蚺c干預(yù)過程（"程序性血管損傷（procedural vascular trauma)"）相 關(guān)的心血管病況，例如血管成形術(shù)、放置分流器、支架、合成或天然切除移植物（excision graft)、留置導尿管、瓣膜或其它可植入裝置后的再狹窄。
[0346] 本文中描述的多肽還可用于治療處于發(fā)生神經(jīng)性疾病或障礙的風險中或患有所 述疾病的人，所述疾病或障礙包括但不限于阿爾茨海默病或帕金森病、亨廷頓病、齒狀核紅 核蒼白球丘腦下部核萎縮或脊髓小腦性共濟失調(diào)，例如，SCA1、SCA2、SCA3 (Machado-Jos印h 病）、SCA7或SCA8、ALS、多發(fā)性硬化、癲癇、唐氏綜合征、荷蘭型遺傳性腦出血伴淀粉樣病 (Dutch Type Hereditary Cerebral Hemorrhage Amyloidosis)、應(yīng)激性淀粉樣疾病、家族 性淀粉樣腎病伴蕁麻疹和耳聾、穆-韋二氏綜合征、原發(fā)性骨髓瘤（Idiopathic Myeloma); 巨球蛋白血癥相關(guān)骨髓瘤（Macroglobulinemia-Associated Myeloma)、家族性淀粉樣多神 經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病、心臟淀粉樣變性（Isolated Cardiac Amyloid)、全身性老年性 淀粉樣變性、成年型糖尿病、胰島素瘤、孤立性心房淀粉樣變性、甲狀腺管道樣癌、家族性淀 粉樣變、遺傳性腦出血伴淀粉樣變、家族性淀粉多發(fā)性神經(jīng)病變（Familial Amyloidotic Polyneuropathy)、羊瘙癢癥、克-亞綜合征（Creutzfeldt-Jacob Disease)、格斯特曼-施 特勞斯納綜合癥（Gerstmann Straussler-Scheinker Syndrome)和牛海綿狀腦炎，|元病毒 介導的疾病。
[0347] 現(xiàn)通過下列非限定性實施例和附圖進一步描述上述公開內(nèi)容，其中附圖顯示：
[0348] 附圖圖例
[0349] 圖 1 :MCL_1 結(jié)合性 Alphabodies 的序列。
[0350] 顯示了通過本文中描述的方法產(chǎn)生的scAB-013 (SEQ ID NO :24)、參照Alphabody 以及設(shè)計的 Alphabody MCL1-AB1(SEQ ID N0:1)、MCL-AB2(SEQ ID N0:2)和 MCL-AB3(SEQ ID NO :3)的比對序列。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank) (PDB)條目3MK8移植的殘 基在黑色背景中以白色顯示。加框殘基表示Alphabody的螺旋中促進或接納對MCL-1的結(jié) 合的置換。序列顯示為對齊的片段，每一組片段分別對應(yīng)于Alphabody的"螺旋A"、"環(huán)1"、 "螺旋B"、"環(huán)2"和"螺旋C"。全序列是由這些片段按所示順序組成的單一多肽序列。
[0351] 圖2 :MCL_1結(jié)合性Alphabody的序列ID和相關(guān)序列。
[0352] SEQ ID N0 :1、SEQ ID N0 :2 和 SEQ ID N0 :3 分別對應(yīng)于 MCL-AB1、MCL1-AB2 和 MCL1-AB3的Alphabody氛基酸序列。
[0353] 圖 3 :Alphabody 多肽 KLPVM-MCL1-AB1 (SEQ ID NO :4)、VPTLK-MCL1-AB1 (SEQ ID NO :7)和tat-013 (SEQ ID NO :25)對點印的MCL-1細胞裂解物的結(jié)合。使用綴合有HRP的 抗-His 抗體檢測 Alphabody 的結(jié)合。KLPVM-MCL1-AB1、VPTLK-MCL1-AB1 為 CPP5-標記的 MCLl-ABlAlphabody 和 tat-標記的對照 Alphabody scAB013。
[0354] 圖 4 :0· 5microM tat-013 (SEQ ID NO :25)(圖框 A)、KLPVM-MCL1-AB1 (SEQ ID NO : 4)(圖框B)和VPTLK-MCL1-AB1 (SEQ ID NO :7)(圖框C)在與人T細胞白血病細胞（MT4) 一起溫育2h后的細胞內(nèi)攝入。使用兔抗-血清和綴合有Alexa488的第二抗體（山羊 抗-兔Ab)顯現(xiàn)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。在每一個圖框中，第一圖像顯 示細胞核染色（藍色通道），第二圖像顯示分析的細胞的形態(tài)學（可見光），第三圖像顯示 Alphabody染色（綠色通道），最后一個圖像是前3個圖像（細胞核染色、細胞形態(tài)學和細 胞內(nèi)Alphabody)的合并圖像。
[0355] 圖 5 :0· 5microM tat-013(SEQ ID NO :25)(圖框 A)、KLPVM-MCL1_AB1 (SEQ ID N0 : 4)(圖框B)和VPTLK-MCL1-AB1 (SEQ ID NO :7)(圖框C)在與人膠質(zhì)母細胞瘤細胞（U87. MG) -起溫育2h后的細胞內(nèi)攝入。使用兔抗-血清和綴合有Alexa488的第二抗體（山羊 抗-兔Ab)顯現(xiàn)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。在每一個圖框中，第一圖像顯 示細胞核染色（藍色通道），第二圖像顯示分析的細胞的形態(tài)學（可見光），第三圖像顯示 Alphabody染色（綠色通道），最后一個圖像是前3個圖像（細胞核染色、細胞形態(tài)學和細 胞內(nèi)Alphabody)的合并圖像。
[0356] 圖 6 :10、20 和 50microM KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO :4)在與人膠質(zhì)母細胞瘤 (U87.MG) -起溫育12小時后的細胞內(nèi)攝入。使用兔抗-血清和綴合有Alexa488的第二抗 體（山羊抗-兔Ab)顯現(xiàn)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。在每一個圖框中，第 一圖像顯示細胞核染色（藍色通道），第二圖像顯示分析的細胞的形態(tài)學（可見光），第三 圖像顯示Alphabody染色（綠色通道），最后一個圖像是前3個圖像（細胞核染色、細胞形 態(tài)學和細胞內(nèi)Alphabody)的合并圖像。
[0357] 圖 7 :10、20 和 50microM VPTLK-MCL1_AB1 (SEQ ID NO :7)在與人膠質(zhì)母細胞瘤細 胞（U87.MG) -起溫育12h后的細胞內(nèi)攝入。使用兔抗-血清和綴合有Alexa488的第二抗 體（山羊抗-兔Ab)顯現(xiàn)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。在每一個圖框中，第 一圖像顯示細胞核染色（藍色通道），第二圖像顯示分析的細胞的形態(tài)學（可見光），第三 圖像顯示Alphabody染色（綠色通道），最后一個圖像是前3個圖像（細胞核染色、細胞形 態(tài)學和細胞內(nèi)Alphabody)的合并圖像。
[0358] 圖 8:在 12h 的 50microM KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO :4)(圖框 A)和 VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO :7)(圖框B)溫育后觀察到的人膠質(zhì)母細胞瘤（U87.MG)的細胞 凋亡。使用兔抗-血清和綴合有Alexa488的第二抗體（山羊抗-兔Ab)顯現(xiàn)Alphabody。 利用DAPI對細胞核進行染色。在圖框A和B中，第一圖像顯示細胞核染色（藍色信道），第 二圖像顯示分析的細胞的形態(tài)學（可見光），第三圖像顯示Alphabody染色（綠色信道）， 最后一個圖像是前3個圖像（細胞核染色、細胞形態(tài)學和細胞內(nèi)Alphabody)的合并圖像。 50microM CPP5Alphabody對U87. MG細胞形態(tài)學的作用示于圖框C中。
[0359] 圖9 :在400ng/ml TRAIL不存在（圖9A)和存在（圖9B)的情況下，利用不同濃 度的Alphabody(5、10、20和40microM)溫育16h后，通過KLPVM-MCLl_ABl(KLPVM)(SEQID N0 :4)和VPTLK-MCLl_ABl(VPTLK)(SEQIDN0:7)Alphabody誘導的人膠質(zhì)母細胞瘤細胞系 U87.MG的細胞凋亡。細胞凋亡被定義為對應(yīng)于早期細胞凋亡事件（淺色條塊）的膜聯(lián)蛋白 V陽性細胞的百分比和對應(yīng)于晚期細胞凋亡事件（具有邊框的黑色條塊）的膜聯(lián)蛋白V和 PI陽性細胞的百分比。未處理的細胞（圖9A)和僅用TRAIL處理的細胞（TRAIL)(圖9B) 對應(yīng)于陰性對照。圖9A代表2個實驗的平均值和標準差。
[0360] 圖10 :在400ng/ml TRAIL不存在（圖10A)和存在（圖10B)的情況下，利用不同濃 度的 Alphabody (5、10、20、40 和 50microM)溫育 17h 后，通過 KLPVM-MCL1_AB1 (KLPVM) (SEQ ID NO :4)和 VPTLK-MCL1_AB1 (VPTLK) (SEQ ID NO :7)Alphabody 誘導的人 T 細胞系 MT4 的 細胞凋亡。細胞凋亡被定義為對應(yīng)于早期細胞凋亡事件（淺色條塊）的膜聯(lián)蛋白V陽性細 胞的百分比和對應(yīng)于晚期細胞凋亡事件（具有邊框的黑色條塊）的膜聯(lián)蛋白V和PI陽性 細胞的百分比。未處理的細胞（圖10A)和僅用TRAIL處理的細胞（TRAIL)(圖10B)對應(yīng) 于陰性對照。數(shù)據(jù)代表2個實驗的平均值和標準差。
[0361] 圖11 :PI (PerCP-Cy5-5_A)相對于膜聯(lián)蛋白V(APC-A)的雙變量散點圖，以及未處 理的人膠質(zhì)母細胞瘤U87. MG的P1陰性細胞群體（圖框A)、在TRAIL不存在的情況下利用 50microM KPLVM-MCL1_AB1處理的細胞（圖框B)和在400ng/ml TRAIL存在的情況下利用 20microM KLPVM-MCL1_AB1(SEQ ID NO :4)處理的細胞（圖框C)的膜聯(lián)蛋白V分布直方圖。
[0362] 圖12 :PI (PerCP-Cy5-5_A)相對于膜聯(lián)蛋白V(APC-A)的雙變量散點圖，以及未處 理的人膠質(zhì)母細胞瘤U87. MG的P1陰性細胞群體（圖框A)、在TRAIL不存在的情況下利用 50microM VPTLK-MCL1_AB1(SEQ ID N0:7)處理的細胞（圖框 B)和在 400ng/ml TRAIL 存 在的情況下利用20microM VPTLK-MCL1_AB1處理的細胞（圖框C)的膜聯(lián)蛋白V分布直方 圖。
[0363] 圖13 :Alphabody MB23_hiR_V5的序列。精氨酸修飾以粗體顯示，C末端V5標簽 加以下劃線顯示。序列顯示為分別標記以"螺旋A"、"環(huán)1"、"螺旋B"、"環(huán)2"、"螺旋C"、 "His-標簽"和"V5-標簽"的片段，以區(qū)分不同的結(jié)構(gòu)元件。全MB23_hiR-V5序列是由這些 片段按所示順序組成的單一多肽序列。
[0364] 圖14 :從312nM至1. 2nM的陽離子化MB23_hiR-V5的2倍稀釋物在人膠質(zhì)母細胞 瘤（U87.MG)中的細胞內(nèi)攝入。將Alphabody于37°C在10%血清存在的情況下與細胞一起 溫育2h。在PBS洗滌，固定并透化細胞后，利用第一抗-V5抗體和標記有Alexa488的第二 山羊抗-小鼠抗體顯現(xiàn)細胞內(nèi)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。對照圖像（Ctrl) 對應(yīng)于無 Alphabody的相同實驗條件。圖像對應(yīng)于記錄的Z-stack的1 μ m切片的重疊圖 像。
[0365] 圖15 :625nM非陽離子化MB23-V5和陽離子化MB23_hiR-V5在人膠質(zhì)母細胞瘤 (U87. MG)中的細胞內(nèi)攝入。將Alphabody于37°C在10 %血清存在的情況下與細胞一起溫 育2h。在PBS洗滌，固定并透化細胞后，利用第一抗-V5抗體和標記有Alexa488的第二山 羊抗-小鼠抗體顯現(xiàn)細胞內(nèi)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。圖像對應(yīng)于記錄的 Z-stack的1 μ m切片的圖像。
[0366] 圖 16 :78nM 陽離子化Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO :18)在4個不同細胞系 (A :人膠質(zhì)母細胞瘤-(U87. MG)、B :胰腺癌-(BxPC3)、C :非小細胞肺癌-(H1437)和D :人脂 肉瘤（SW872)細胞）中的細胞內(nèi)攝入。將Alphabody于37°C在10%血清存在的情況下與細 胞一起溫育2h。在PBS洗滌，固定并透化細胞后，利用第一抗-V5抗體和標記有Alexa488 的第二山羊抗-小鼠抗體顯現(xiàn)細胞內(nèi)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。圖像對應(yīng) 于記錄的Z-stack的1 μ m切片的圖像。
[0367] 圖 17 :500nM 陽離子化 Alphabody MB23_hiR-V5(SEQ ID NO :18)在人膠質(zhì)母細胞 瘤（U87.MG)中的細胞內(nèi)攝入。將Alphabody于37°C在10%血清存在的情況下與細胞一起 溫育不同的時期。在肝素（100個單位/ml)洗滌，固定并透化細胞后，利用第一抗-V5抗體 和標記有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗體顯現(xiàn)細胞內(nèi)Alphabody。利用DAPI對細胞核 進行染色。圖像對應(yīng)于記錄的Z-stack的1 μ m切片的單個細胞圖像。
[0368] 圖 18 :Alphabody ABl_hiKRl-V5(SEQ ID NO :14)和 ABl_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO :16)的序列。Arg/Lys修飾以粗體顯示，并且C末端V5標簽加以下劃線顯示。
[0369] 圖 19 :人膠質(zhì)母細胞瘤（U87. MG)中不同濃度（10nM, 20nM, 40nM, 78nM, 156nM 和 312nM)的 ABl_hiKRl-V5(SEQ ID N0:14)和 ABl_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID N0:16)的細胞內(nèi) 攝入。將Alphabody于37°C在10%血清存在的情況下與細胞一起溫育2h。在PBS洗滌，固 定并透化細胞后，利用第一抗-V5抗體和標記有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗體顯現(xiàn)細 胞內(nèi)Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。圖像對應(yīng)于記錄的Z-stack的1 μ m切片 的圖像。
[0370] 圖 20 :500nM ABl_A2aF_hiKR3-V5(SEQ ID NO :16)在人膠質(zhì)母細胞瘤（U87.MG) 中的細胞內(nèi)攝入的動力學。將Alphabody于37?在10%血清存在的情況下溫育180min、 12〇111；[11、60111；[11、30111；[11、15111；[11、7.5111；[11和3.5111；[11。在肝素（100個單位/1111)洗漆，固定并透 化細胞后，利用第一抗-V5抗體和標記有Alexa488的第二山羊抗-小鼠抗體顯現(xiàn)細胞內(nèi) Alphabody。利用DAPI對細胞核進行染色。圖像對應(yīng)于記錄的Z-stack的一個1 μ m的切 片。
[0371] 圖21 :在Alphabody的系列稀釋物存在的情況下人T細胞白血病細胞（MT4)的細 胞活力。在利用Alphabody處理48h后測量細胞存活力。數(shù)據(jù)對應(yīng)于一式三份重復的平均 值土SD。細胞存活力表達為相對于未處理對照細胞的百分比。
[0372] 圖22 :在Alphabody的系列稀釋物存在的情況下人T細胞白血病細胞（Jurkat)的 細胞存活力。在利用Alphabody處理48h后測量細胞存活力。數(shù)據(jù)對應(yīng)于一式三份重復的 平均值土SD。細胞存活力表達為相對于未處理對照細胞的百分比。
[0373] 圖23 :在Alphabody的系列稀釋物存在的情況下PBMC的細胞存活。在利用 Alphabody處理48h后測量細胞存活。數(shù)據(jù)對應(yīng)于一式三份重復的平均值土 SD。細胞存活 力表達為相對于未處理對照細胞的百分比。
[0374] 圖24 :具有C末端His-標簽和V5標簽的陽離子化Alphabody ABl_pan_hiKR3-V5 的序列（SEQ ID NO :10)。精氨酸/賴氨酸修飾以粗體顯示，N末端V5標簽加以下劃線顯 示。序列顯示為分別標記以"螺旋A"、"環(huán)1"、"螺旋B"、"環(huán)2"、"螺旋C"、"His-標簽"和 "V5-標簽"的片段，以區(qū)分不同的結(jié)構(gòu)元件。全ABl_pan_hiKR3-V5序列是由這些片段按所 示順序組成的單一多肽序列。
[0375] 圖 25 :重組 BCL-2 家族蛋白對 Alphabody ABl_pan_hiKR3_V5 的結(jié)合。 Alphabody(500nM)被固定的抗-V5抗體（5microg/ml)捕獲于微量滴定板。使用綴合于辣 根過氧化物酶的抗-GST抗體檢測谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)-標記的重組BCL-2家族蛋白 MCL-1、BCL-XL和BCL-2a的5倍稀釋物的結(jié)合。在492nm和630nm處讀取板。
[0376] 圖 26 :重組BCL-2家族蛋白對Alphabody ABl_pan_hiKR3-V5、ABl_A2aF_hiKR3-V5 和MB23_hiR_V5的結(jié)合。Alphabody(500nM)被固定的抗-V5抗體（5microg/ml)捕獲于微 量滴定板。使用綴合于辣根過氧化物酶的抗-GST抗體檢測谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)-標 記的重組BCL-2家族蛋白MCL-1 (圖26A)、BCL-XL (圖26B)和BCL-2a (圖26C)的5倍稀釋 物的結(jié)合。在492nm和630nm處讀取板。
[0377] 圖 27 :在 Alphabody ABl_pan_hiKR3-V5 和MB23_hiR-V5 的系列稀釋物存在的情況 下人T細胞白血病細胞（MT4)的細胞存活。在利用Alphabody處理48h后測量細胞存活。 數(shù)據(jù)對應(yīng)于一式三份重復的平均值土SD。細胞存活表達為相對于未處理對照細胞的百分 比。 實施例
[0378] I.導言
[0379] 許多細胞內(nèi)作用的分子已被鑒定為治療應(yīng)用的潛在吸引人的靶。在這些 分子當中，參與細胞凋亡過程的蛋白質(zhì)形成重要的一類細胞內(nèi)靶分子。如最近所描 述的（Quinn 等人，Expert Opinion, 2011，20 :1397-1411 ;Akgul，Cell. Mol. Life. Sci. 2009, 66:1326-1336和本文中引用的參考資料），眾所周知細胞凋亡是生物體中細 胞動態(tài)平衡維持的至關(guān)重要的過程。細胞凋亡可通過兩個相關(guān)途徑發(fā)生：細胞凋亡的外 在和內(nèi)在途徑。外在途徑包括利用細胞外配體例如FasL或TNF激活細胞表面死亡受體 (Fas，TNFR)。內(nèi)在途徑可通過多種應(yīng)激信號啟動，其中涉及線粒體外膜的透化，這導致細胞 色素 c釋放，從而導致細胞凋亡過程中的其它步驟，包括胱天蛋白酶-9的切割和激活以及 最終細胞死亡。
[0380] 此外眾所周知的是，BCL-2蛋白家族（也表示為Bcl-2蛋白家族）的成員是參與 細胞凋亡過程的調(diào)節(jié)和控制的主要蛋白。BCL-2蛋白家族包括促細胞凋亡成員以及抗-細 胞凋亡成員。該蛋白質(zhì)家族以BCL-2(在關(guān)于B細胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)的該蛋白質(zhì)家族 的創(chuàng)建成員）命名。
[0381] 基于結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，BCL-2蛋白家族通常分成3個亞組：兩個促細胞凋亡BCL-2 成員亞組和一個抗-細胞凋亡BCL-2成員亞組。
[0382] 抗-細胞凋亡亞組包括成員 BCLjjCLIaJCL-UBCL-wjCL-Xt 和 BFL-1/A1 (這 些蛋白質(zhì)有時以小寫符號Bcl-2、Mcl-1、Bcl-w、Bcl-Xp Bfl-1/Al表示）。這些蛋白質(zhì)通 過結(jié)合或捕獲促-細胞凋亡BCL-2家族成員的至關(guān)重要的細胞凋亡誘導結(jié)構(gòu)域來充當存活 因子（Stewart 等人，Nature Chemical Biology, 2010, 6, 595-601)。該結(jié)構(gòu)域稱為 BCL-2 同源結(jié)構(gòu)域3 (BH3)。抗-細胞凋亡蛋白沿著其表面具有銜接BH3 α -螺旋的疏水性結(jié)合區(qū) (Sattler 等人，Science, 1997,275 :983-986)。BCL-2、BCL-XL 和 BCL-W 包含 4 個 BH(BCL-2 同源性）結(jié)構(gòu)域（表示為BH1、BH2、BH3和BH4)，而MCL-1和BFL-1/A1不存在明確確定的 BH4結(jié)構(gòu)域。
[0383] 兩個促-細胞凋亡亞組之一包含Bax和Bak (也以大寫表示為ΒΑΧ和BAK)，其具有 多個BH(BCL-2同源性）結(jié)構(gòu)域（ΒΗ1、ΒΗ2和ΒΗ3)。另一促-細胞凋亡亞組的成員（包括 BAD、BID、ΒΜ、Ν0ΧΑ、PUMA)僅包含BH3結(jié)構(gòu)域，因而被稱為僅含BH3的蛋白。
[0384] BCL-2家族的抗-細胞凋亡成員在腫瘤細胞存活中起著重要作用，并且可被當 作有價值的靶用于癌癥治療。事實上，這些存活蛋白在范圍廣泛的人癌癥中表達。例如， MCL-1據(jù)報導在許多癌癥類型（乳腺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝細胞 癌、頭頸癌、多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)腸癌、肺癌、白血病和淋巴瘤）中過表達（Quinn等人，Expert Opinion, 2011，20 :1397-141)。
[0385] 因此，對于與阻斷抗-細胞凋亡蛋白的BH3模擬物的開發(fā)相關(guān)的藥物發(fā)現(xiàn)存在相 當?shù)奈Α?br> [0386] 例如，ABT-737 為結(jié)合 BCL-2、BCL-XL 和 BCL-w 但不結(jié)合 MCL-1 或 BFL-1/A1 的 BH3-模擬物（Lee 等人，Cell Death and Differentiation (2007) ,14, 1711-1719)。該識 別上的差異可通過結(jié)合溝的差異來解釋，已知其中MCL-1結(jié)合溝比其它抗-細胞凋亡蛋白 帶有更多的正電荷。
[0387] 同樣地，已產(chǎn)生了模擬BH3CI-螺旋的烴裝訂肽，從而目標在于最優(yōu)化親和 力和保持結(jié)合選擇性。這樣的方法最近由Stewart等人研究出（Nature Chemical Biology, 2010, 6, 595-601)，其從抗-細胞凋亡性MCL-1BH3螺旋衍生出排他性MCL-1抑制 劑。
[0388] 然而，這些裝訂肽通常受困于如下事實：僅觀察到中等水平的α-螺 旋性（例如對于雙裝訂SAH-gp4 1 626_662肽顯示36 %的α -螺旋性（Bird等 人，PNAS，. 2010, 107, 14093-14098));和螺旋轉(zhuǎn)角之間所需的裝訂是人工制品，其本身可 能對生物活性具有不可預(yù)測的效應(yīng)。
[0389] 在下列實施例中，描述了模擬MCL-1的BH3結(jié)構(gòu)域并且結(jié)合MCL_1(目的在于阻斷 MCL-1與促-細胞凋亡蛋白之間的相互作用以將癌癥/腫瘤細胞驅(qū)向程序化細胞死亡）的 Alphabody是如何設(shè)計的。
[0390] II.綴合于細朐穿誘狀的MCL-1靶向ALPHABODY
[0391] 實施例1. MCL-1結(jié)合性Alphabody的設(shè)計
[0392] 設(shè)計工作使用MCL-1 (殘基172-327)與裝訂肽的復合物的晶體結(jié)構(gòu)，代表 BH3 α -螺旋?；谠摼w結(jié)構(gòu)（PDB代碼3MK8)，將Alphabody設(shè)計成在很大程度上以與 MCL-1SAHB相同的方式結(jié)合MCL-1。
[0393] Alphabody B-螺旋被選擇來模擬MCL-1BH3 α -螺旋，初步擬合操作表明在該結(jié)合 模式中，完整的Alphabody與MCL-1結(jié)合溝最相容。
[0394] BH3 α -螺旋中的α -螺旋區(qū)段為具有序列LRRVGDGV(SEQ ID NO :28)的長度為8 的區(qū)段，其包含由Stewart等人（Nat. Chem. Biol.，2010, 6:595-601)描述的介導對抗-細 胞凋亡蛋白MCL-1的結(jié)合的高度保守的BH3元件。pdb3MK8結(jié)構(gòu)的B-鏈中的對應(yīng)區(qū)段用 于所有疊加（superimposition)或擬合操作，其中周圍的MCL-1蛋白也被考慮來判斷擬合 的相容性?？煽吹阶罴褦M合通過在參照Alphabody scAB013中的殘基B2f-B3f上疊加區(qū)段 B9-B16可以實現(xiàn)，其中我們?yōu)榱朔奖阋咽褂肁lphabody的七肽編號方案。更精確地，區(qū)段 B2f-B3f 包含下列位置 B2f、B2g、B3a、B3b、B3c、B3d、B3e、B3f (注意 B 代表 Alphabody 的第 二α -螺旋，編號2或3表示七肽編號，小寫字母表示7個七肽位置的每一個位置）。
[0395] 3個Alphabody被設(shè)計來結(jié)合MCL-1和模擬具有序列LRRVGDGV(SEQ ID NO :28) 的BH3 α -螺旋區(qū)段。這些Alphabody示于下文中。這些Alphabody的序列與用于設(shè)計這 些Alphabody的參照Alphabody scAB-〇13的序列一起不于圖1中。
[0396] MCL1-AB1
[0397] 根據(jù)3MK8結(jié)構(gòu)，選擇Alphabody B螺旋中的6個位置來用于接枝： B2fL, B2gR, B3bV, B3cG, B3dD和B3fV。對應(yīng)位置和序列突出顯示于圖1中。
[0398] 引入許多另外的置換以最優(yōu)化與MCL-1的相互作用或容納Alphabody殘基對 MCL-1的結(jié)合，如圖1中加框顯示的。
[0399] 更具體地，引入A3eE和BleT以有利于與MCL-1上的Lys234的相互作用。注意， A3eE應(yīng)當讀為Alphabody第一螺旋的第3七肽中e-七肽位置上的谷氨酸（以一字母符號 表示為E)。類似地，BleT表示第二螺旋中第1七肽的e-七肽位置上的蘇氨酸（以一字母 符號表不為T)。
[0400] 在C-螺旋中，N末端甲硫氨酸至甘氨酸的突變和ClgS突變被選擇來防止與MCL-1 的空間位阻。C2gE被選擇來容納接枝的B2gR突變。
[0401] MCL1-AB2
[0402] ClgA被選擇作為安全突變，因為即使MCL1-AB1的該位置上的絲氨酸能參與局部 Η鍵網(wǎng)絡(luò)，由0H-基團產(chǎn)生的位阻可能是個潛在問題。由于相似的原因，L2的位置14和15 上的GS序列被反轉(zhuǎn)成SG。
[0403] MCL1-AB3
[0404] 鑒于接枝的B3dD突變（在核心位置上）的風險，B3dT突變被選擇作為MCL1-AB1 的安全性支持。
[0405] 這3個Alphabody的序列和SEQ-ID不于圖2中。
[0406] 在本實施例中，我們意欲主要通過基于細胞的功能性測定測試MCL-1結(jié)合性 Alphabody,所述測定需要細胞內(nèi)遞送Alphabody以結(jié)合細胞凋亡祀,從而誘導細胞凋亡或 使得對細胞凋亡敏感。在這方面，將細胞穿透肽添加至Alphabody的N末端。使用3個不 同的細胞穿透肽：⑴來源于HIV-1的tat蛋白的tat肽（YGRKKRRQRRR) (SEQ ID NO :23)， ⑵細胞穿透五肽（CPP5) :KLPVM(SEQ ID NO :21)和（3)第二 CPP5 肽：VPTLK(SEQ ID NO : 22) (Frankel 和 Pabo, 1988 ;Cell, 1988,55(6) :1189-1193 ;Green 等人，Cell, 1988,55(6): 1179-1188 ;Gomez 等人，Pharmaceutical, 2010, 3(12) :3594-3613)。CPP5 肽來源于蛋白 Ku70(參與非同源性末端連接的DNA修復和細胞死亡調(diào)控的多功能蛋白）。肽VPTLK具有 抗-細胞凋亡活性，因為其抑制促-細胞凋亡蛋白Bax的激活和從胞質(zhì)溶膠至線粒體的轉(zhuǎn) 運（Gomez 等人，Pharmaceutical, 2010, 3 (12) :3594-3613)。
[0407] 將tat和CPP5序列添加在Alphabody的N末端，間隔以Gly-Gly-Ser-Gly接頭。 為了克隆目的，將另外的Met-Gly引入tat和CPP5序列的N末端。為了純化和檢測目的， 分別地在 Alphabody 的 C 末端引入 His-標簽（6xHis)和 V5 表位（Gly-Lys-Pr〇-Ile-Pr〇-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)〇
[0408] 對于MCL1-AB1，僅產(chǎn)生CPP5-標記的Alphabody。本實施例的其余部分將聚焦在 CPP5-標記的 MCL1-AB1。
[0409] 實施例2. Alphabody的產(chǎn)生和純化
[0410] 將實施例1和3至8中描述的對應(yīng)于不同Alphabody的基因克隆進入細菌表達載 體pET16b，并用于化學地轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)pLysS細菌。從用6. 7ml的過夜預(yù)培養(yǎng)物接 種的11培養(yǎng)物產(chǎn)生Alphabody。在0D600nm0. 5時用ImM IPTG誘導Alphabody產(chǎn)生，并在 30°C生長4小時。
[0411] 使用下列方案從包涵體純化CPP5-MCL1-AB1 :在細菌培養(yǎng)物離心（以4000rpm進 行40分鐘）后，將細胞沉淀重懸浮于10ml的50mM Tris，500mM NaCl pH7. 8 (含有20mM AEBSF)中，于-20°C貯存直至純化。隨后對細胞沉淀進行超聲處理（以40%幅度進行10x10 秒），隨后以17000xg離心20分鐘。將沉淀重懸浮于Tris50mM, NaCllOOmM, EDTA20mM, Trito η X-1002%，pH7. 8,在振蕩的條件下于4°C溫育10分鐘。將樣品在4°C以17000xg離心15 分鐘，用Tris50mM，Triton X-1001%，pH7. 8洗滌沉淀，隨后重懸浮于10ml H20。在于4°C 以 17000xg 離心 15 分鐘后，將沉淀重懸浮于 Tris50mM, NaC1500mM, GuHC16M, ρΗ7· 8 中。
[0412] 將溶解化的包涵體通過0.45 μ m濾器過濾，添加至500微升Ni-NTA樹脂（GE Healthcare)，在室溫溫育1小時。用10ml的50mM Tris, 500mM NaCl和20mM咪唑洗滌樹 月旨，隨后用 10ml50mM Tris, 500mM NaCl 和 50mM 咪唑洗滌 5 次。用 lml 的 50mM Tris, 500mM NaCl以及1M咪唑和6M GuHCl洗脫Alphabody，進行10次。
[0413] 將洗脫的Alphabody(lOml)濃縮，使用PBS在3K Amicon過濾器上替代緩沖液至 500 μ 1的體積。濃縮的Alphabody呈現(xiàn)一些沉淀，將其離心以沉淀出聚集體。將沉淀溶解 在400微升的150mM醋酸中。再次地，觀察到沉淀，離心后將沉淀溶解于20mM醋酸鈉，150mM NaCl, pH6中。將3種不同的Alphabody制劑在SDS-PAGE(10% Bis/Tris)上進行分析，測 定其濃度。
[0414] 實施例3.細胞內(nèi)攝入的分析
[0415] 使用2個不同的癌細胞系：MT4細胞（人T細胞白血?。┖蚒87.MG細胞（人膠 質(zhì)母細胞瘤細胞）通過共聚焦顯微鏡研究所述不同的CPP5標記的MCLl-ABlAlphabody的 細胞內(nèi)攝入。U87. MG細胞具有Mcl-1的高度表達，并且對索拉非尼（多激酶抑制劑）和 TRAIL (死亡受體配體）敏感（Yang 等人，Mol. Cancer Ther.，2010, 9 (4) :953-962)。
[0416] 用不同濃度的Alphabody(0. 5μΜ至50μΜ)溫育細胞2小時或12小時。利用 Alphabody處理ΜΤ4懸浮細胞（400. 000個細胞/載片），隨后將其通過多聚-Lys附著于 LabTek小室的載玻片。相反地，將貼壁U87. MG細胞（10. 000個細胞/載片）粘附于載玻片 (無多聚Lys涂層），隨后用Alphabody溫育。
[0417] 在用Alphabody溫育結(jié)束時，用含鈣和鎂的PBS洗滌細胞3次，隨后用4%甲 醛在4°C固定10分鐘。用0.1 % Triton X-100在室溫（RT)透化細胞15分鐘，隨后用 甘氨酸（〇. 75g/100ml PBS)進行2個10分鐘的洗滌步驟，以中和甲醛。在RT添加封閉 緩沖液（PBS中的1 % BSA)，進行10分鐘，隨后用兔49血清（針對Alphabody的血清） (1/1000,于封閉緩沖液中）在RT溫育1小時。用封閉緩沖液洗滌細胞3次，每次5分鐘， 隨后添加綴合于Alexa488的山羊抗兔（1/300,于封閉緩沖液中）（Invitrogen)，在RT用 0八?1(516嫩^1(11^(*)進行細胞核染色（1/100)30分鐘。最后，用封閉緩沖液洗滌細胞3 次，每次5分鐘，用PBS洗滌一次，隨后在共聚焦顯微鏡（ZEISS Axiovert200M LSM510Meta) 上讀出結(jié)果。
[0418] 實施例4.通過流式細胞術(shù)分析細胞凋亡
[0419] 通過使用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠（PI)作為細胞凋亡標志物來測量細胞凋亡。膜 聯(lián)蛋白V是位于健康非凋亡細胞的細胞膜內(nèi)葉（inner leaflet)上的小分子結(jié)合性磷脂酰 絲氨酸。在細胞凋亡后，發(fā)生磷脂酰絲氨酸向外葉（outer leaflet)的翻轉(zhuǎn)，從而允許膜聯(lián) 蛋白V的結(jié)合。膜聯(lián)蛋白V陽性細胞被視為早期細胞凋亡的細胞。在細胞進一步崩解后， 細胞膜變得完全滲漏，從而PI可進入細胞以嵌入DNA。膜聯(lián)蛋白V和PI陽性細胞被視為晚 期凋亡的細胞。僅為PI陽性的細胞是壞死細胞。
[0420] 在MT4細胞（200. 000個細胞/300微升，于48孔板中）和U87. MG細胞（50. 000 個細胞/400微升，于24孔板中）中研究由不同濃度MCLl-ABlAlphabody誘導的細胞凋亡。 在TRAIL(R&D Systems)(死亡受體的配體）不存在的情況下或在1小時后添加至細胞/ Alphabody混合物的400ng/ml TRAIL存在的情況下研究細胞凋亡。在用Alphabody溫育 14小時后，用膜聯(lián)蛋白V(BD Biosciences)和Pl(Invitrogen)對細胞進行染色。
[0421] 用300微升胰蛋白酶解離U87.MG細胞。在完全解離后，通過添加400微升U87. MG細胞培養(yǎng)基中和胰蛋白酶活性，將細胞懸浮物以300xg離心10分鐘。直接離心懸浮物 MT4細胞而無需任何其它處理。用800微升結(jié)合緩沖液（0. 01M HEPES，pH7. 4 ;0. 14M NaCl ; 2. 5mM CaC12)洗滌細胞，隨后以300xg離心10分鐘。通過添加100微升含有2. 5微升膜 聯(lián)蛋白V/樣品的結(jié)合緩沖液來進行膜聯(lián)蛋白V染色，將樣品在4°C于黑暗處溫育15分鐘。 用lml結(jié)合緩沖液洗滌樣品，以300xg離心10分鐘。最后，在于FACS Canto測量細胞之前 5分鐘，用80微升PI溶液（0. 1 μ g/ml PI，于結(jié)合緩沖液中）對細胞進行染色。
[0422] 凋亡細胞的百分比測定為膜聯(lián)蛋白V陽性細胞的百分比或者膜聯(lián)蛋白V和PI陽 性細胞的百分比。
[0423] 實施例 5. CPP5Alphabody 的純化
[0424] 從11細菌培養(yǎng)物純化2種CPP5-MCLl_ABlAlphabody，獲得3個不同緩沖液中的制 齊U。對于所有制劑，通過SDS凝膠電泳在適當?shù)拈L度（約15kDa)上觀察到清晰的蛋白質(zhì)條 帶。在PBS可溶性制劑（對于VPTLK-MCL1-AB1和KLPVM-MCL1-AB1分別為1. 4和1. 8mM) 中測量到Alphabody的最高濃度。
[0425] 實施例6. CPP5Alphabody對MCL-1細胞裂解物的結(jié)合
[0426] CPP5Alphabody對MCL-1的結(jié)合在使用商購可得的MCL-1轉(zhuǎn)染HEK細胞裂解物 (Santa Cruz)的斑點印跡分析中得到確認。將MCL細胞裂解物點印在硝酸纖維素濾膜（2.5 微升）上，用含2%脫脂乳的？85封閉1小時，用14厘、5 4厘和1(^厘0--541?1^〇(^和陰 性對照 tat-013Alphabody(SEQ ID NO :25)在室溫溫育 2 小時。在用 PBS/0. 05% Tween20 洗滌膜后，添加綴合于辣根過氧化物酶（HRP)的抗-His抗體（1/2000,于含有5%脫脂乳的 PBS中），進行1小時。添加 HRP顯色劑底物（Biorad)以檢測Alphabody的結(jié)合。
[0427] CPP5Alphabody(VPTLK-MCLl-ABl(SEQ ID NO :7)和 KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID N0 : 4))都顯示明確的對Mcl-1細胞裂解物的結(jié)合。對照Alphabody tat-013在相同的濃度上 未顯示對MCL-1細胞裂解物的結(jié)合（如圖3中顯示的）。
[0428] 實施例7. CPP5Alphabody在癌細胞系MT4和U87. MG中的細胞內(nèi)攝入
[0429] 首先在人T細胞白血病細胞系MT4中研究CPP5Alphabody的細胞內(nèi)攝入。將 tat-013Alphabody(SEQ ID N0:25)用作細胞內(nèi)攝入的陽性對照。該對照還允許比較tat與 CPP5肽的貨物內(nèi)化模式。
[0430] 在Alphabody與MT4細胞溫育2小時后，觀察到CPP5Alphabody的微弱細胞內(nèi) 攝入。觀察到Alphabody tat-013 (SEQ ID NO :25)的細胞內(nèi)攝入，如通過胞質(zhì)溶膠中該 Alphabody以相對高濃度存在所顯示的（圖4圖框A)。
[0431] 也對貼壁人膠質(zhì)母細胞瘤癌細胞系U87. MG測試CPP5Alphabody和對照Alphabody 的細胞內(nèi)攝入。在于U87.MG細胞上溫育0. 5μΜ Alphabody2小時后，研究細胞內(nèi)攝入。2 小時后觀察到2種CPP5Alphabody和對照tat-013的清晰細胞內(nèi)攝入（圖5)。
[0432] 在U87.MG細胞中通過在12小時的溫育期中分析10μΜ、20μΜ和50μΜ的攝入 來研究CPP5Alphabody的劑量依賴性細胞內(nèi)攝入?？梢灶A(yù)期，在高劑量Alphabody上和在 延長的溫育時間后能觀察到細胞凋亡事件。文獻中已知U87. MG細胞具有MCL-1的高度表 達，并且對下調(diào)MCL-1表達的索拉非尼敏感（Yang等人，Mol. Cancer Ther.，2010,9(4): 953-962)。如果CPP5Alphabody與細胞內(nèi)MCL-1相互作用并且阻止其對Bak或Bax的結(jié)合， 則細胞凋亡可被誘導。
[0433] 觀察至lj KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO :4)和 VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO :7) Alphabody的濃度依賴性細胞內(nèi)攝入（圖6和7)。該作用對于KLPVM-MCL1-AB1細胞內(nèi)攝 入更加明顯（圖7)。
[0434] 在CPP5Alphabody的最高濃度上，U87. MG細胞的形態(tài)學從細長形改變成圓形細 胞。大部分細胞從載玻片解離。這些形態(tài)學變化表明細胞處于非最佳形狀，以及高濃度的 Alphabody影響細胞的存活（圖8)。
[0435] 在0--541?11&13〇(^(5(^1)的這些高濃度下，觀察到細胞凋亡事件。約50%的保 持附著于載玻片的細胞顯示被觀察為細胞凋亡小體的核崩解（圖8)。特別要指出的的是， 在對TRAIL處理不敏感的細胞中觀察到細胞凋亡事件。這些結(jié)果表明CPP5Alphabody的 MCL-1抑制性活性強至足以誘導其自身的細胞凋亡。
[0436] 實施例8. CPP5Alphabody的細胞凋亡活性
[0437] 為了獲得關(guān)于CPP5Alphabody對細胞凋亡的誘導的定量數(shù)據(jù)，使用膜聯(lián)蛋白V和 PI作為細胞凋亡標志物進行流式細胞術(shù)。與通過共聚焦顯微鏡進行的細胞凋亡定量分析相 反，流式細胞術(shù)允許分析更大量的細胞。在死亡受體配體TRAIL不存在和存在的情況下進 行實驗。許多論文報導了當用TRAIL敏化癌細胞時抗癌藥物的細胞凋亡。選擇導致20%細 胞凋亡的TRAIL濃度。在添加細胞凋亡誘導藥物后，細胞凋亡的百分比升高超過20%。
[0438] 我們使用2個定義來定義正在經(jīng)歷細胞凋亡的細胞。早期細胞凋亡中的細胞被定 義為膜聯(lián)蛋白V陽性細胞，而晚期細胞凋亡中的細胞被定義為膜聯(lián)蛋白V和PI陽性細胞。 使用這2個定義分析流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)。對MT4和U87.MG細胞進行實驗。當在TRAIL不存 在的情況下用40 μ M KLPVM-MCL1-AB1 (SEQ ID NO :4)溫育U87. MG細胞14小時時，相較于 未處理細胞，觀察到細胞凋亡百分比的急劇升高。在該body濃度上觀察到超過60 %的凋亡 細胞。當用相同濃度的VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID N0:7)Alphabody處理細胞時，觀察到不太 顯著的凋亡增加（圖9)。該Alphabody誘導20%的細胞凋亡。該差異可通過如下方面來 解釋：⑴肽VPTLK相較于KLPVM的更低效的攝入，如文獻中記載的（相較于KLPVM，60%的 細胞內(nèi)攝入）和（2) VPTLK的固有抗-細胞凋亡特征。事實上，VPTLK是Bax抑制性肽并且 保護細胞免受細胞凋亡。
[0439] 在TRAIL存在的情況下，CPP5Alphabody誘導細胞凋亡的濃度下降至20 μ M。該濃 度的Alphabody在TRAIL不存在的情況下不誘導顯著的細胞凋亡，而在TRAIL存在的情況 下，對于KLPVM-MCL1-AB1和VPTLK-MCL1-AB1分別觀察到40%和30%的細胞凋亡（圖9)。
[0440] 確定細胞凋亡百分比的兩個定義在U87. MG細胞中給出了相同的細胞凋亡百分 比。這最可能是因為大部分細胞在這些Alphabody的濃度（40 μ M)上和在12小時的溫育 時間后處于早期細胞凋亡?？梢灶A(yù)期，如文獻中描述的更長溫育時間（48小時）將導致更 大群體的細胞處于晚期細胞凋亡。
[0441] 在 400ng/ml TRAIL 存在和不存在的情況下，利用 10、20、4(^P50y]\^^Alphabody 對人T細胞白血病細胞MT4進行相同實驗。一般而言，當與U87. MG細胞相比較時，在該細胞 系中觀察到更低百分比的細胞凋亡。在TRAIL不存在的情況下，早期和早期細胞凋亡的百 分比不同，更多細胞處于晚期細胞凋亡階段（膜聯(lián)蛋白V和PI陽性細胞）。與關(guān)于U87.MG 細胞的結(jié)果相反，VPTLK誘導超過40%的細胞凋亡，而KLPVM誘導30%的細胞凋亡。TRAIL 的存在導致更不顯著的細胞凋亡效應(yīng)，如在U87. MG細胞中觀察到的（圖10)。
[0442] 細胞凋亡結(jié)果也展示為顯示雙重陰性細胞（Q3)、膜聯(lián)蛋白V陽性細胞（Q1)、膜聯(lián) 蛋白V以及PI陽性細胞（Q2)和PI陽性（Q4)細胞的點陣圖（dot plot)。直方圖對應(yīng)于PI 陰性細胞群體的膜聯(lián)蛋白V分布。當細胞凋亡發(fā)生時，膜聯(lián)蛋白V陽性群體出現(xiàn)（P4門） (圖 11 和 12)。
[0443] 結(jié)論
[0444] CPP5 標記的 Alphabody KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO :4)和 VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID N0:7)的溶解度最高，并且在PBS中可溶的獲得高度濃縮的Alphabody，所述Alphabody 在高于ImM的濃度上保持溶解。兩種Alphabody都與MCL-1細胞裂解物相互作用，然而，對 照Alphabody tat-013(SEQ ID N0:25)未顯示與Mcl-1細胞裂解物的相互作用。
[0445] 這些結(jié)果顯示Alphabody的B螺旋中的結(jié)合基序LRXVGDXV(SEQ ID NO :20)介導 Alphabody 對 MCL-1 的結(jié)合。
[0446] 細胞穿透肽 5(KLPVM(SEQ ID NO :21)和 VPTLK(SEQ ID NO :22)的存在允許人 T細胞白血?。∕T4)和人膠質(zhì)母細胞瘤細胞（U87)對Alphabody的細胞內(nèi)攝入。取決 于細胞類型，觀察到細胞內(nèi)攝入效率的差異。T細胞中的攝入效率不太高。我們還顯示 CPP5-MCLlAlphabody的細胞內(nèi)攝入是濃度依賴性的。在更高的濃度（50μΜ)上和更長的溫 育時間下，更明確地觀察到細胞凋亡。
[0447] 由 KLPVM-MCL1-AB1(SEQ ID NO :4)和 VPTLK-MCL1-AB1(SEQ ID NO :7)誘導的細 胞凋亡在流式細胞術(shù)中通過2個細胞凋亡標志物膜聯(lián)蛋白V和PI得到確認。重要地，這些 Alphabody在死亡受體配體（TRAIL)進行的細胞敏化不存在的情況下誘導達到60%的細胞 凋亡。TRAIL的敏化使得能夠使用更低劑量的Alphabody獲得細胞凋亡。
[0448] 當與KLPVM-MCL1-AB1相比較時，VPTLK-MCL1-AB1誘導更低程度的細胞凋亡。這 可通過該Alphabody的效率不太高的細胞內(nèi)攝入和通過該肽的固有抗-細胞凋亡性質(zhì)來解 釋。
[0449] 上述數(shù)據(jù)顯示Alphabody在細胞內(nèi)環(huán)境中是穩(wěn)定的，這在先前從未被證明過。此 夕卜，數(shù)據(jù)顯示設(shè)計特異性針對MCL-1的抑制性Alphabody (模擬BH3 α -螺旋）的方法是成 功的。事實上，明確地觀察到對MCL-1的特異性結(jié)合以及功能活性，即敏化和細胞凋亡的誘 導。
[0450] III.何含CPAB某序的ALPHABODY的細朐內(nèi)攝入
[0451] 實施例9.陽離子化CPAB Alphabody MB23_hiR_V5的細胞內(nèi)攝入
[0452] 本實施例針對時間和Alphabody濃度描述了陽離子化Alphabody在不同細胞類型 (包括癌細胞和非癌細胞）中的細胞內(nèi)攝入。為了研究陽離子化Alphabody的細胞內(nèi)攝入 能力，我們最初選擇針對IL-23的Alphabody (命名為MB23)。為了保留位于A和C螺旋上 的IL-23結(jié)合位點，在B螺旋中添加8個Arg，從而產(chǎn)生稱為MB23_hiR-V5 (SEQ ID NO :18) (+9的電荷）的帶正電荷的Alphabody (圖13)。
[0453] 此外，通過研究攝入的溫度依賴性、對葡糖氨基聚糖存在的依賴性和細胞培養(yǎng)基 中血清的存在對細胞穿透的影響來探究Alphabody細胞攝入機制。
[0454] 利用共聚焦顯微鏡研究攝入，使用識別與His-標簽一起融合于Alphabody C末端 的V5標簽的抗V5抗體顯現(xiàn)細胞內(nèi)Alphabody。在固定的透化的細胞上進行所有實驗。包 括利用非透化的實驗的對照實驗（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0455] 9. 1 #用的方法
[0456] 利用參照陽離子化Alphabody MB23_hiR_V5(SEQ ID NO :18)在8個不同的細胞系 (包括6個癌細胞系和2個非癌細胞系）中針對濃度和時間研究細胞穿透。為了理解細胞 內(nèi)Alphabody攝入的機制，研究細胞穿透的溫度依賴性、硫酸肝素依賴性和血清依賴性。
[0457] 9. 1. 1MB23 hiR_V5 的表汰和鈍化
[0458] 陽離子化Alphabody MB23_hiR_V5(SEQ ID NO :18)表達在大腸桿菌的可溶性級分 中。通過Ni-NTA層析，隨后通過脫鹽和緩沖液交換法純化蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)于20mM檸檬 酸 pH3.0(5.3mg/ml)中吧存。
[0459] 9. 1. 2陽離子化Alphabody MB23 hiR_V5的細胞內(nèi)攝入
[0460] 在 6 個不同的癌細胞系（U87. MG、BxPC-3、H1437、SW872、MT-4 和 Jurkat)和 3 個 非癌細胞系（HEK、CH0-K1和CH0. pgSA)(表1)中研究細胞內(nèi)攝入。
[0461] 將貼壁細胞系（U87· MG, BxPC-3, H1437, SW872, HEK, CH0-K1 和 CH0. pgSA)培養(yǎng) 在DMEM+10%胎牛血清（FBS)中，并以10. 000個細胞/小室接種在LabTek小室中，在 37°C和5% C02下溫育過夜。第二天，用接種的細胞在37°C和5% 0)2下溫育陽離子化 Alphabody (系列稀釋或單個濃度），進行2小時或從3. 5分鐘變化至48小時的不同時間。 在利用Alphabody溫育后，用PBS (包含Mg和Ca (DPBS))洗滌細胞4次（5分鐘/洗滌）。
[0462] 表1 :用于細胞內(nèi)攝入研究的細胞系
[0463]
【權(quán)利要求】
1. 一種包含至少一個Alphabody或基本上由其組成的多肽，其中所述多肽能夠被內(nèi)化 入細胞并且其中所述Alphabody特異性結(jié)合所述細胞內(nèi)的細胞內(nèi)革巴分子。
2. 權(quán)利要求1的多肽，其中所述Alphabody與允許至細胞內(nèi)的內(nèi)化的至少一個基團、部 分、蛋白質(zhì)或肽融合或用其綴合。
3. 權(quán)利要求2的多肽，其中所述至少一個Alphabody綴合于細胞穿透肽（CPP)，優(yōu)選地 TAT 或 CPP5。
4. 權(quán)利要求1的多肽，其中所述至少一個Alphabody包含一個或多個內(nèi)化區(qū)域，所述內(nèi) 化區(qū)域含有所述至少一個Alphabody內(nèi)的氨基酸殘基基序或氨基酸殘基模式。
5. 權(quán)利要求4的多肽，其中所述內(nèi)化區(qū)域是包含至少6個帶正電荷的氨基酸殘基的16 個氨基酸的序列。
6. 權(quán)利要求1至5中任一項的多肽，其中所述至少一個Alphabody主要通過存在于所 述Alphabody的至少一個α -螺旋內(nèi)的結(jié)合位點特異性結(jié)合所述細胞內(nèi)革巴分子。
7. 權(quán)利要求1至6中任一項的多肽，其中所述細胞內(nèi)靶分子是細胞凋亡或抗-細胞凋 亡蛋白。
8. 權(quán)利要求1至7中任一項的多肽，其中所述細胞內(nèi)靶分子是BCL-2蛋白家族的抗-細 胞凋亡成員。
9. 權(quán)利要求8的多肽，其中所述BCL-2蛋白家族的抗-細胞凋亡成員選自MCL-1、 BCL-2、BCL-2a、BCL-XL、BCL-w 和 BFL-1/A1。
10. 權(quán)利要求1至9中任一項的多肽，其用作藥劑。
11. 權(quán)利要求1至10中任一項的多肽，其用于治療疾病或障礙的方法中，所述疾病或障 礙與其中牽涉所述細胞內(nèi)靶分子的生物學途徑或生物學相互作用相關(guān)。
12. -種藥物組合物，其包含至少一種如權(quán)利要求1至11中任一項中定義的多肽和任 選地一種或多種藥學上可接受的載體。
13. -種生產(chǎn)權(quán)利要求1至12中任一項中定義的一種或多種多肽的方法，所述方法至 少包括如下步驟： a) 產(chǎn)生包含至少一個Alphabody或基本上由其組成的一種或多種多肽，所述多肽經(jīng)修 飾而允許所述多肽內(nèi)化入所述細胞， b) 測試所述多肽對于所述細胞內(nèi)靶分子是否具有可檢測的結(jié)合親和力，和任選地 c) 分離所述一種或多種多肽。
【文檔編號】C07K14/00GK104159913SQ201380009041
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月6日
【發(fā)明者】I·拉斯特斯, M·萬克, J·戴斯邁特, J·德巴韋耶, S·德羅, S·洛貝里克斯 申請人:康普里斯有限公司