用于免疫抑制劑藥物的夾心測定的制作方法
【專利摘要】公開了用于測定懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品中的免疫抑制劑藥物的方法。所述方法包括在介質(zhì)中組合提供樣品、針對免疫抑制劑藥物的第一單克隆抗體和針對免疫抑制劑藥物的第二單克隆抗體。第二單克隆抗體結(jié)合除了第一單克隆抗體結(jié)合免疫抑制劑藥物的部分以外的免疫抑制劑藥物的部分。在用于第一單克隆抗體和第二單克隆抗體結(jié)合免疫抑制劑藥物的條件下孵育介質(zhì)。檢查該介質(zhì)中包含免疫抑制劑藥物、第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的免疫復(fù)合體的存在。免疫復(fù)合體的存在和/或量表明樣品中免疫抑制劑藥物的存在和/或量。
【專利說明】用于免疫抑制劑藥物的夾心測定
[0001] 背景 本發(fā)明涉及用于測定已知或懷疑含有一種或多種免疫抑制劑藥物的樣品（諸如患者 樣品）中的此類免疫抑制劑藥物的化合物、方法和試劑盒。
[0002] 機(jī)體依賴于復(fù)雜的免疫應(yīng)答系統(tǒng)來區(qū)分自身與非自身。有時，機(jī)體的免疫系統(tǒng)必 須按順序進(jìn)行控制，以便增強(qiáng)缺陷應(yīng)答或抑制過度應(yīng)答。例如，當(dāng)在人中移植器官諸如腎、 心臟、心-肺、骨髓和肝臟，機(jī)體經(jīng)常通過被稱為同種異體移植排斥的過程排斥移植的組 織。
[0003] 在治療同種異體移植排斥中，頻繁用藥物治療以受控的方式抑制免疫系統(tǒng)。免疫 抑制劑藥物是被小心地施用于移植受體以幫助防止非自身組織的同種異體移植排斥的治 療藥物。免疫抑制劑藥物可以如下分類：糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞抑制劑、抗體、作用于抑免蛋白 (immunophilin)的藥物、和其他藥物，諸如干擾素、阿片劑INF結(jié)合蛋白、麥考酚酯、FTY720 等。免疫抑制劑藥物的具體類別包含作用于抑免蛋白的那些藥物。抑免蛋白是具有生理意 義的高親和力的特異性結(jié)合蛋白的實(shí)例。目前已知抑免蛋白的兩個不同的家族：親環(huán)蛋白 和巨菲蛋白（macrophilins)，其中后者特異性結(jié)合，例如，他克莫司或西羅莫司。
[0004] 防止移植患者中的器官排斥的兩種最常施用的免疫抑制劑藥物是環(huán)孢菌素（CSA) 和FK-506 (FK或他克莫司）。在美國和其他國家中發(fā)現(xiàn)用作免疫抑制劑的另一種藥物是 西羅莫司，也稱為雷帕霉素。雷帕霉素的衍生物也可用作免疫抑制劑。此類衍生物包括，例 如，依維莫司等。
[0005] 可以部分通過小心控制患者中存在的藥物水平來控制與一些免疫抑制劑藥物相 關(guān)的副作用。需要治療性監(jiān)測血液中免疫抑制劑藥物和相關(guān)藥物的濃度，以優(yōu)化給藥方案， 以確保具有最小毒性的最大免疫抑制。盡管免疫抑制劑藥物是非常有效的免疫抑制劑，但 必須小心管理其使用，因?yàn)橛行┝糠秶ǔＪ钦那疫^度劑量可以導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。 另一方面，太少劑量的免疫抑制劑可以導(dǎo)致組織排斥。因?yàn)槊庖咭种苿┧幬锏姆植己痛x 在患者之間變化很大，且由于不良反應(yīng)的大范圍和嚴(yán)重度，所以準(zhǔn)確監(jiān)測藥物水平是必要 的。
[0006] 因此，存在對于開發(fā)快速且準(zhǔn)確的診斷方法來測量患者中免疫抑制劑藥物或其衍 生物的水平的持續(xù)需求。該方法應(yīng)當(dāng)能夠完全自動化，且應(yīng)當(dāng)選擇性地檢測母體藥物，同時 盡可能減小由其代謝物的交叉反應(yīng)性，或由懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品中的成分導(dǎo)致 的不精確性。
[0007] 概述 根據(jù)本文描述的原理的一些實(shí)例涉及用于測定懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品中的 免疫抑制劑藥物的方法。所述方法包括在介質(zhì)中組合提供樣品、針對免疫抑制劑藥物的第 一單克隆抗體和針對免疫抑制劑藥物的第二單克隆抗體。第二單克隆抗體結(jié)合除了第一單 克隆抗體結(jié)合免疫抑制劑藥物的部分以外的免疫抑制劑藥物的部分。在用于第一單克隆抗 體和第二單克隆抗體結(jié)合免疫抑制劑藥物的條件下孵育介質(zhì)。檢查該介質(zhì)中包含免疫抑制 劑藥物、第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的免疫復(fù)合體的存在。免疫復(fù)合體的存在和/ 或量表明樣品中免疫抑制劑藥物的存在和/或量。
[0008] 根據(jù)本文描述的原理的一些實(shí)例涉及用于測定懷疑含有他克莫司的樣品中的他 克莫司的方法。所述方法包括在介質(zhì)中組合提供樣品、針對他克莫司的第一單克隆抗體和 針對他克莫司的第二單克隆抗體。第二單克隆抗體結(jié)合除了第一單克隆抗體結(jié)合他克莫司 的部分以外的他克莫司的部分。在用于第一抗體和第二抗體結(jié)合樣品中的他克莫司的條件 下孵育介質(zhì)，并且檢查該介質(zhì)中包含他克莫司、第一單克隆抗體和第二單克隆抗體的免疫 復(fù)合體的存在。免疫復(fù)合體的存在和/或量表明樣品中他克莫司的存在和/或量。
[0009] 根據(jù)本文描述的原理的一些實(shí)例涉及用于測定懷疑含有他克莫司的樣品中的他 克莫司的方法。所述方法包括在介質(zhì)中組合提供樣品、締合磁性顆粒的針對他克莫司的第 一單克隆抗體和與酶締合的針對他克莫司的第二單克隆抗體。第二單克隆抗體結(jié)合除了第 一單克隆抗體結(jié)合他克莫司的部分以外的他克莫司的部分。在用于第一抗體和第二抗體結(jié) 合樣品中的他克莫司的條件下孵育介質(zhì)，并且檢查該介質(zhì)中包含他克莫司、第一單克隆抗 體和第二單克隆抗體的免疫復(fù)合體的存在。免疫復(fù)合體的存在和/或量表明樣品中他克莫 司的存在和/或量。
[0010] 附圖簡述 圖1是具有編號的他克莫司的化學(xué)式。
[0011] 圖2是圖1的化學(xué)式，其描繪根據(jù)本文所述的原理單克隆抗體結(jié)合的分子部分。
[0012] 圖3是描繪根據(jù)本文所述的原理他克莫司夾心免疫測定的信號劑量響應(yīng)曲線的 圖。
[0013] 圖4是描繪根據(jù)本文所述的原理他克莫司ELISA夾心免疫測定的信號劑量響應(yīng)曲 線的圖。
[0014] 具體實(shí)施方案的詳述 總體討論 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以制備特異性結(jié)合免疫抑制劑藥物分子的分開部分的單克隆抗 體。這個發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的，因?yàn)槊庖咭种苿┧幬锸前肟乖?，其是相對小的分子（分子量?于約2500,或小于約2000,或小于約1500,或小于約1000)，并且不被認(rèn)為具有多于一個抗 體可以結(jié)合的位點(diǎn)。根據(jù)本文所述的原理，可以制備至少兩種不同的抗體，其同時結(jié)合免疫 抑制劑藥物分子的分開部分。短語"針對免疫抑制劑藥物的抗體"意指特異性結(jié)合免疫抑 制劑藥物且不在任何顯著程度結(jié)合可以扭曲免疫抑制劑藥物的分析的其他物質(zhì)的抗體。特 異性結(jié)合涉及相比于對其他分子實(shí)質(zhì)上較差的識別，對于兩種不同分子中的一種相對于另 一種的特異性識別。另一方面，非特異性結(jié)合涉及相對獨(dú)立于特定表面結(jié)構(gòu)的分子之間的 非共價結(jié)合。非特異性結(jié)合可以由幾種因素導(dǎo)致，包括分子之間的疏水性相互作用。
[0015] 半抗原是能夠特異性結(jié)合相應(yīng)抗體，但本身不充當(dāng)用于制備抗體的免疫原（或抗 原）的化合物。因此，半抗原與用來產(chǎn)生抗體的免疫原性載體連接。
[0016] 同時結(jié)合免疫抑制劑藥物上的兩個不同位點(diǎn)的單克隆抗體的制備使得能夠在夾 心測定中使用此類抗體，其中所述免疫抑制劑藥物被兩種不同抗體同時結(jié)合以形成免疫復(fù) 合體。對免疫抑制劑藥物進(jìn)行夾心測定的能力增強(qiáng)了測定對免疫抑制劑藥物的靈敏度。此 夕卜，在涉及結(jié)合至支持物的一種單克隆抗體的夾心測定的情況下，該測定可以在雜質(zhì)和樣 品的干擾物質(zhì)存在的情況下進(jìn)行，因?yàn)榭梢栽谝呀?jīng)使免疫抑制劑藥物結(jié)合至支持物的單克 隆抗體之后、但在引入第二單克隆抗體之前，將支持物與樣品分離和并洗滌。
[0017] 術(shù)語"免疫抑制劑藥物"包括作用于抑免蛋白的那些，諸如，但不限于，例如，環(huán)孢 菌素（包括環(huán)孢菌素 A、環(huán)孢菌素 B、環(huán)孢菌素 C、環(huán)孢菌素 D、環(huán)孢菌素 E、環(huán)孢菌素 F、環(huán)孢 菌素 G、環(huán)孢菌素 H、環(huán)孢菌素 I)、他克莫司（FR-900506、FK506、PR0GRAF?)、西羅莫司（雷帕 霉素、RAPAMUNE?)和依維莫司（RAD、CERTICAN?)。
[0018] 抗體可以包括完整的免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括各種類型和同種 型，諸如 IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b 和 IgG3、IgM 等。其片段可以包括 Fab、Fv 和 F(ab'）2、Fab'等。此外，適當(dāng)時可以使用免疫球蛋白的聚集體、聚合物和綴合物或其片段， 只要維持了對特定分子的結(jié)合親和力。
[0019] 單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)（諸如制備連續(xù)雜交細(xì)胞系和收 集分泌的蛋白（體細(xì)胞雜交技術(shù)））來制備。單克隆抗體可以根據(jù)K5hler和Milstein, Nature 265:495-497,1975的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來產(chǎn)牛.。單克隆抗體技術(shù)的綜述可見Lymphocyte Hybridomas，編輯 Melchers，等人 Springer-Verlag (New York 1978)，Nature 266 : 495 (1977)，Science 208:692 (1980)，和 Methods of Enzymology 73 (Part B) :3-46 (1981)。
[0020] 在用于制備抗體的另一種方法中，可以將編碼抗體結(jié)合位點(diǎn)的序列從染色體DNA 切下并插入到克隆載體中，其可以在細(xì)菌中表達(dá)，以產(chǎn)生具有相應(yīng)抗體結(jié)合位點(diǎn)的重組蛋 白。該方法涉及克隆和表達(dá)編碼至少對于天然抗體的特異性結(jié)合所需的氨基酸序列的核苷 酸序列或其誘變版本。
[0021] 在用于產(chǎn)生單克隆抗體的一種方法中，第一個步驟包括用抗原，例如，用免疫原 免疫產(chǎn)生抗體的動物，諸如小鼠、大鼠、山羊、綿羊或母牛。可以使用或不使用佐劑諸如弗 氏完全佐劑或其他佐劑諸如單磷酰脂質(zhì)A和合成海藻糖二桿菌分枝菌酸酯（trehalose dicorynomycolate)佐劑進(jìn)行免疫。下一個步驟包括從產(chǎn)生抗體的動物中分離脾細(xì)胞，并將 產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞與適當(dāng)?shù)娜诤习閭H，典型地骨髓瘤細(xì)胞，諸如通過使用聚乙二醇或其他 技術(shù)進(jìn)行融合。通常，使用的骨髓瘤細(xì)胞是通常在次黃嘌呤-胸苷（HT)培養(yǎng)基中生長，但 無法在次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷（HAT)培養(yǎng)基中生長的用于選擇融合的細(xì)胞的那些。下 一個步驟包括選擇融合的細(xì)胞，通常是通過在HAT培養(yǎng)基中選擇。下一個步驟包括使用免 疫測定諸如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)或適當(dāng)用于篩選的其他免疫測定篩選用于適當(dāng)抗 體產(chǎn)生的克隆雜合體。
[0022] 術(shù)語"免疫原性載體"意指這樣的基團(tuán)或部分，當(dāng)綴合至半抗原并注射到哺乳動物 或以其他方式用作免疫原時，其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并引發(fā)產(chǎn)生結(jié)合半抗原的抗體。免疫原性載 體有時也被稱為抗原載體。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，合成包含免疫原性載體 (包括在特定位置連接至免疫抑制劑化合物的聚（氨基酸）和非聚（氨基酸）免疫原性載 體）的免疫原，并用于制備抗體。
[0023] 作為免疫原性載體的聚（氨基酸）的分子量范圍（以道爾頓計(jì)）為例如約 5, 000 至約 10, 000, 000,或約 20, 000 至約 600, 000,或約 25, 000 至約 250, 000 分子 量。聚（氨基酸）免疫原性載體包括蛋白諸如，例如，白蛋白、血清蛋白，例如球蛋白、 眼晶狀體蛋白和脂蛋白。說明性蛋白包括，但不限于，例如，牛血清白蛋白（BSA)、鑰孔 細(xì)|血藍(lán)蛋白（KLH)、蛋卵清蛋白和牛丙種球蛋白（BGG)。非聚（氨基酸）免疫原性載體包 括多糖、核酸和顆粒（生物材料和合成材料）。各種各樣的免疫原性載體公開于，Davalian 等人，美國專利號5, 089, 390,第4欄第57行至第5欄，第5行，其通過引用并入本文。
[0024] 如上面所提到，免疫原性載體可以是多糖，其是可以天然或合成制備的單糖的高 分子量聚合物，且通常涉及單糖的重復(fù)縮合物。多糖的實(shí)例是淀粉、糖原、纖維素、碳水化合 物樹膠，諸如阿拉伯膠、瓊脂等等。多糖也可以含有聚（氨基酸）殘基和/或脂質(zhì)殘基。
[0025] 如上所提到，在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，免疫原性載體可以通過連接 基團(tuán)的方式在免疫抑制劑化合物的預(yù)定位置連接至免疫抑制劑化合物。在一些實(shí)例中，連 接基團(tuán)可以包含約2至約50個原子，或4至約30個原子，不計(jì)算氫，并且可以包含2至約 30個原子，或3至約20個原子（分別獨(dú)立地選自通常由碳、氧、硫、氮和磷組成的組）的 鏈。部分或所有連接基團(tuán)可以是被連接至免疫抑制劑化合物的分子部分，諸如，但不限于， 例如，聚（氨基酸）上的氨基酸殘基。在一些實(shí)例中，連接基團(tuán)包含肟官能度。
[0026] 連接基團(tuán)中雜原子數(shù)目的范圍可以為0至約20,或1至約15,或約2至約10。連 接基團(tuán)可以是脂族或芳族的。當(dāng)存在雜原子時，氧通常作為鍵合至碳、硫、氮或磷的氧代或 氧基存在，氮通常作為通常鍵合至碳、氧、硫或磷的硝基、亞硝基或氨基存在；硫類似于氧； 而磷鍵合至碳、硫、氧或氮，通常作為膦酸酯和磷酸酯單酯或二酯。在連接基團(tuán)和待綴合的 分子之間形成共價鍵中常用的官能度是烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、氮雜、硫醚 和羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。包含雜原子的連接基團(tuán)的一個具體實(shí)施方案是如 上提到的肟官能度。
[0027] 對于大多數(shù)部分，當(dāng)連接基團(tuán)具有連接官能度（用于與部分反應(yīng)的官能度），諸 如，例如，包括氮和硫類似物的非氧代羰基，磷酸酯基，氨基，烷基化劑諸如鹵（halo)或甲 苯磺?；榛?，氧基（羥基或硫類似物，巰基），氧代羰基（例如醛或酮），或活性烯烴諸如 乙烯基砜或α-、β-不飽和酯時，這些官能度連接至胺基、羧基、活性烯烴、烷基化劑，例如 溴乙?；?。其中胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸連接時，形成酰胺、脒和磷酰胺。其中硫醇和 活化烯烴連接時，形成硫醚。其中硫醇與烷基化劑連接時，形成硫醚。其中醛和胺在還原條 件下連接時，形成烷基胺。其中酮或醛和羥胺（包括其中取代基替代羥基的氫的其衍生物） 連接時，形成肟官能度（=Ν-0_)。其中羧酸或磷酸和醇連接時，形成酯。各種連接基團(tuán)是本 令頁域眾所周知的：參見，例如，Cautrecasas, .Τ. Biol. Chem. (1970) 245:3059。
[0028] 他克草司作為具體實(shí)例 以下具體說明是通過對本發(fā)明范圍說明的方式，而不是作為對本發(fā)明范圍的限制。免 疫抑制劑藥物，具體而言他克莫司的選擇也是通過說明且不是限制的方式，因?yàn)楸景l(fā)明具 有檢測任何具有空間上分開區(qū)域（可以對其產(chǎn)生抗體且在針對化合物的測定過程中此類 產(chǎn)生的抗體將與其特異性結(jié)合）的半抗原的一般應(yīng)用。
[0029] 可以制備結(jié)合他克莫司分子的分開部分的單克隆抗體（圖1)?？梢源_定單克隆抗 體結(jié)合的分開部分，例如，通過使用他克莫司的代謝物的交叉反應(yīng)研究。參照圖2,可以制 備的一種單克隆抗體結(jié)合基本上由包括甲氧基和羥基取代基的C29-C34環(huán)和包括甲氧基 取代基的C15組成的他克莫司的部分（區(qū)域14)?？梢灾苽淞硪环N單克隆抗體，其結(jié)合基 本上由C10-C14環(huán)的甲氧基和包括C22酮氧且還包括C24羥基和C26酯氧的C1-C26環(huán)的 C19-C27組成的他克莫司的部分（區(qū)域12)。通過三維分析對他克莫司結(jié)構(gòu)的檢查揭示了 區(qū)域12和14的構(gòu)象。
[0030] 針對區(qū)域14的單克隆抗體可以從以下免疫原制備，其中他克莫司在他克莫司分 子的C19-C27區(qū)域中的位置，或通過鍵直接或通過連接基團(tuán)的中間性（intermediacy)，連 接至免疫原性載體。
[0031] 在一個具體實(shí)例中，通過說明而非限制的方式，根據(jù)本文所述的原理，他克莫司在 他克莫司分子的C22位置，或通過鍵直接或通過連接基團(tuán)的中間性，連接至免疫原性載體。 在一個具體實(shí)例中，通過說明而非限制的方式，酮基在C22位置與胺反應(yīng)以產(chǎn)生肟。所述胺 可以是，但不限于，例如，羧基甲氧基胺。
[0032] 在一個方法中，他克莫司與羧基甲氧基胺的反應(yīng)產(chǎn)生羧甲基肟。在該具體實(shí)例中， 他克莫司可以在緩沖鹽（諸如，例如，乙酸鈉）存在的情況下與羧基甲氧基胺在醇介質(zhì)（諸 如，例如，甲醇、乙醇或丙醇）中反應(yīng)，以得到羧甲基肟。該肟可以連接至免疫原性載體，諸 如，例如，高分子量蛋白，其可以是，但不限于，例如，牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、卵清蛋 白、纖維蛋白原或鑰孔域血藍(lán)蛋白。在一個實(shí)例中，所述蛋白是鑰孔域血藍(lán)蛋白。
[0033] 在一個實(shí)例中，制備他克莫司與高分子量蛋白的綴合物的方法如下：（1)如上 所述制備他克莫司的羧甲基肟；（2)活化羧甲基肟以產(chǎn)生反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺酯； 和（3)使N-羥基琥珀酰亞胺酯與高分子量蛋白反應(yīng)以產(chǎn)生綴合物。進(jìn)行羧甲基肟的活 化以產(chǎn)生N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如，通過使用偶聯(lián)劑諸如水溶性碳二亞胺，諸如，例如， (3-二甲基氨基丙基1-乙基_3_二甲基氨基丙基）-碳二亞胺鹽酸化物（EDAC)。
[0034] 在另一個實(shí)例中，在他克莫司的C19 - C27區(qū)域內(nèi)的碳原子處衍生化的他克莫司 的綴合物是溴乙酰基衍生物。他克莫司的溴乙?；苌锏闹苽浒ǎ?)使他克莫司與羧 基甲氧基胺反應(yīng)以產(chǎn)生他克莫司的羧甲基肟衍生物，（2)活化羧甲基肟以產(chǎn)生反應(yīng)性N-羥 基琥珀酰亞胺酯，和（3)使N-羥基琥珀酰亞胺酯與溴乙酰基乙二胺的三氟乙酸鹽反應(yīng)以產(chǎn) 生溴乙?；苌铩Ｈ缟纤鲋苽湓摲椒ㄖ惺褂玫聂燃谆垦苌??？梢允褂么祟愪逡阴?基衍生物通過使溴乙?；糠峙c蛋白的巰基反應(yīng)以產(chǎn)生他克莫司的蛋白綴合物。
[0035] 可以如下通過篩選方法鑒定針對區(qū)域14的單克隆抗體：基于其與不同他克莫司 衍生物諸如代謝物和免疫原的結(jié)合特性鑒定抗體克隆的結(jié)合區(qū)域?；谝韵聦^(qū)域14鑒 定為14H04克隆的結(jié)合區(qū)域：(a)采用的免疫原具有通過他克莫司的C22酮基連接的免疫 原性載體蛋白，（b)他克莫司C22肟顯示出與單克隆抗體14H04的強(qiáng)結(jié)合，這表明在C22區(qū) 域附近不會發(fā)生抗體結(jié)合（改變該區(qū)域沒有破壞抗體結(jié)合），（c)他克莫司C32氨基甲酸酯 化合物不結(jié)合單克隆抗體14H04,且涉及C31甲氧基的脫甲基化的代謝物顯著降低了抗體 結(jié)合，兩者都表明，14H04結(jié)合C29-34環(huán)，和（d)與15-0-脫甲基（demethyl)他克莫司沒 有交叉反應(yīng)性表明14H04結(jié)合C15鄰近區(qū)域（改變15-0-甲基去除了抗體的結(jié)合能力）。
[0036] 針對區(qū)域12的單克隆抗體可以從以下免疫原制備，其中他克莫司在他克莫司分 子的C29-C34區(qū)域中的位置，或通過鍵直接或通過連接基團(tuán)的中間性，連接至免疫原性載 體。對于通過他克莫司的C19 - C27區(qū)域中位置的連接，連接基團(tuán)和連接程序如上所述。 在一個實(shí)例中，部分通過采用羥基的他克莫司分子的位置C32連接至他克莫司。
[0037] 可以通過以下篩選方法鑒定針對區(qū)域12的單克隆抗體?；谝韵聦^(qū)域12鑒定 為1E2克隆的結(jié)合區(qū)域：(a)采用的免疫原通過C32連接，且改變C32 (例如，他克莫司C32 氨基甲酸酯化合物）不改變單克隆抗體1E2的結(jié)合，（c) 1E2具有與他克莫司的C32酯衍 生物的100%結(jié)合，和（(1)改變031甲氧基（31-0-去甲基（(16811161:1171))不減少單克隆抗 體1E2的結(jié)合。以上所有都表明單克隆抗體1E2不結(jié)合他克莫司的C29-C34環(huán)。連接至 C24的羥基的修飾減弱了單克隆抗體1E2與他克莫司的結(jié)合。他克莫司C22肟化合物不結(jié) 合1E2,這表明單克隆抗體1E2結(jié)合他克莫司的C22-C24區(qū)域。如在Ml (13-0-去甲基）和 MVI (13,31二去甲基）的情況下的C13甲氧基的改變?nèi)コ藛慰寺】贵w1E2與他克莫司的 結(jié)合，表明單克隆抗體1E2結(jié)合他克莫司的C13區(qū)域。
[0038] 鑒于上述，單克隆抗體1E2和14H04在他克莫司分子上具有分開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這 允許針對他克莫司藥物的夾心測定。
[0039] 根據(jù)以下程序?qū)嵤┩ㄟ^ACMIA測定形式的他克莫司衍生物的測量。代謝物獲得 自 Isotechnika Pharma Inc (Alberta,Canada)和 University of Colorado in Denver, Colorado的Christistians博士實(shí)驗(yàn)室。他克莫司衍生物化合物，諸如免疫原獲得自 Siemens AG (Glasgow，DE)。代謝物和免疫原交叉反應(yīng)性使用美國專利號7, 186,518(其相 關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文）中描述的ACMIA方法進(jìn)行測量。簡而言之，根據(jù)已知技術(shù) 使用標(biāo)準(zhǔn)的異雙官能SMCC(琥珀酰亞胺基反-4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-甲酸 酯）接頭將兩個克隆綴合至β-半乳糖苷酶。通過將他克莫司類似物綴合至牛免疫球蛋白， 然后綴合至聚醛葡聚糖包被的二氧化鉻顆粒而制備鉻顆粒（免疫測定固相）。用于單克隆 抗體14Η04的他克莫司類似物是他克莫司C22肟化合物。用于單克隆抗體1Ε2的類似物是 固定在抗熒光素抗體包被的二氧化鉻顆粒的他克莫司C32熒光素衍生物。通過測試含有摻 入代謝物和其他他克莫司衍生物諸如免疫原的樣品而檢測交叉反應(yīng)性。將從含有摻入代謝 物的樣品獲得的測定信號與從含有他克莫司標(biāo)準(zhǔn)品的樣品獲得的信號進(jìn)行比較。通過將表 觀他克莫司濃度除以添加代謝物的濃度并表示將結(jié)果表示為百分比來確定交叉反應(yīng)性。
[0040] 應(yīng)當(dāng)指出的是，根據(jù)本文所述的原理的夾心測定應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)出相比于利用一種或另 一種上述單克隆抗體試劑的競爭測定的與他克莫司代謝物的較低交叉反應(yīng)性。在夾心測定 中，代謝物需要結(jié)合兩種抗體以表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性。如果代謝物僅結(jié)合一種抗體，而不結(jié)合 另一種（或與另一種具有弱結(jié)合），則沒有生成任何測定信號，因此，沒有表明交叉反應(yīng)性。 如果代謝物表現(xiàn)出與一種抗體的100%結(jié)合，但與另一種具有較弱結(jié)合（例如，30%)，通過 該測定測量的交叉反應(yīng)性是較弱的結(jié)合（即，30%)。此外，如果代謝物表現(xiàn)出與一種抗體 的低結(jié)合（例如，40% )，且與另一種抗體具有甚至更低的結(jié)合（例如，20% )，則夾心測定 中的交叉反應(yīng)性應(yīng)當(dāng)比更低結(jié)合更低（在上述實(shí)例中，40%Χ20% = 8%)。在交叉反應(yīng)性研究 中，兩種抗體，1Ε2和14Η04,表現(xiàn)出與代謝物ΜΙ 13-0-去甲基-他克莫司、ΜΙΙ、31-0_去甲 基-他克莫司、]?11115-0-去甲基-他克莫司、]\〇￥12-0!1-他克莫司、]\1-￥113,31-0-二去 甲基-他克莫司和M-VII 15, 31-0-二去甲基-他克莫司不同的交叉反應(yīng)性概況。在夾心 測定中測量的交叉反應(yīng)性應(yīng)當(dāng)?shù)扔诨虻陀诒憩F(xiàn)出與代謝物較低結(jié)合的抗體的交叉反應(yīng)性。
[0041] 針對免疫抑制劑藥物的測定的總體描沭 如上所提到，根據(jù)本文描述的原理的實(shí)例能夠?qū)崿F(xiàn)用于測定懷疑含有免疫抑制劑藥物 的樣品中的免疫抑制劑藥物的夾心測定。在夾心測定中，采用兩種單克隆抗體，其中每種同 時結(jié)合免疫抑制劑藥物分子的分開區(qū)域，以形成免疫復(fù)合體。免疫復(fù)合體的檢測允許測定 樣品中的免疫抑制劑藥物。
[0042] 待測試的樣品通常是生物樣品。短語"生物樣品"是指任何生物材料，諸如，例如， 體液、機(jī)體組織、機(jī)體化合物和培養(yǎng)基。樣品可以是來自任何來源的固體、半固體或流體 (液體或氣體）。在一些實(shí)施方案中，樣品可以是機(jī)體排泄物、機(jī)體吸出物（aspirant)、機(jī)體 切除物或機(jī)體提取物。機(jī)體通常是哺乳動物的機(jī)體，在某些實(shí)施方案中，機(jī)體是人體。機(jī)體 排泄物是從機(jī)體排泄的那些物質(zhì)（盡管它們也可以通過切除或提取獲得），諸如，例如尿、 排泄物、糞便、陰道粘液、精液、淚液、呼氣、汗、皰液和炎性滲出物。機(jī)體切除物是從機(jī)體切 除的那些物質(zhì)，諸如，例如，皮膚、毛發(fā)和組織樣品，包括來自器官和其他機(jī)體部分的活檢樣 品。機(jī)體吸出物是從機(jī)體吸出的那些物質(zhì)，諸如，例如，粘液、唾液和痰。機(jī)體提取物是從機(jī) 體提取的那些物質(zhì)，諸如，例如，全血、血漿、血清、脊髓液、腦脊髓液、淋巴液、關(guān)節(jié)液和腹膜 液。在一些實(shí)例中，樣品是全血、血漿或血清。
[0043] 在測定之前，或在測定過程中的一些情況下，樣品可以經(jīng)受一種或多種預(yù)處理以 裂解細(xì)胞和/或從內(nèi)源結(jié)合物質(zhì)釋放免疫抑制劑藥物。裂解細(xì)胞可以通過使用溶血劑實(shí) 現(xiàn)，所述溶血試劑是破壞紅血細(xì)胞膜的完整性，從而釋放細(xì)胞的胞內(nèi)內(nèi)容物的化合物或化 合物的混合物。溶血劑包括，但不限于，例如，非離子型去垢劑、陰離子型去垢劑、兩性去垢 齊IJ、低離子強(qiáng)度水溶液（低滲溶液）、細(xì)菌劑和引起補(bǔ)體依賴性裂解的抗體。
[0044] 可以被用作溶血劑的非離子型去垢劑包括合成去垢劑和天然去垢劑兩者。合 成去垢劑的實(shí)例包括 TRITON? X-100、TRITON? N-101、TRITON? X-114、TRITON? X-405、 TRITON? SP-135、TWEEN? 20 (聚氧乙烯（20)脫水山梨醇單月桂酸酯）、TWEEN? 80 (聚 氧乙烯（20)脫水山梨醇單油酸酯）、D0WFAX?、Z0NYIΛ季戊四醇基棕櫚酸酯、AD0GENβ 464、 ALKAN0L? 6112表面活性劑、烯丙基醇1，2- 丁氧基化物-嵌段-乙氧基化物HLB 6、BRIJ?、 乙二胺四（乙氧基化物-嵌段-丙氧基化物）四醇、IGEPAL?、MERP0L?、聚（乙二醇）、2_[乙 基[(十七氟辛基）磺酰基]氨基]乙基醚、聚乙烯-嵌段-聚（乙二醇）、聚氧乙烯脫水 山梨醇四油酸酯、聚氧乙烯山梨醇六油酸酯、TERGIT0L? NP-9、GAFAC? (RH0DAFAC?，烷基聚 氧乙烯二醇磷酸酯，諸如，例如，α-十二烷基-ω-羥基聚（氧-1,2-乙二基）磷酸酯），和 ΕΡ110?等?？梢员挥米魅苎獎┑奶烊淮嬖诘娜ス竸┌?，例如，皂苷、鈉或鉀中和的脂肪酸、 中和的磷脂、甘油二酯、中和的磷脂酰絲氨酸、磷脂酸（phosphatidate)、中和的磷脂酰乙醇 胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿、膽汁鹽、未酯化的膽固醇、中和的鞘氨醇、神經(jīng)酰 胺等。也可以使用一種或多種合成去垢劑或一種或多種天然存在的去垢劑的組合和合成去 垢劑和天然存在的去垢劑的組合。
[0045] 采用的溶血劑的性質(zhì)和量或濃度取決于例如樣品的性質(zhì)、免疫抑制劑藥物的性 質(zhì)、試劑組分的剩余部分的性質(zhì)和反應(yīng)條件中的一種或多種。溶血劑的量至少足以引起紅 細(xì)胞裂解以釋放細(xì)胞內(nèi)容物。在一些實(shí)例中，溶血劑的量為例如約〇. 0001%至約〇. 5%， 約 0. 001 %至約 0. 4%，約 0. 01 %至約 0. 3%，約 0. 01 %至約 0. 2%，約 0. 1 %至約 0. 3%，約 0.2%至約0.5%，或約0. 1 %至約0.2% (百分比為重量/體積）。
[0046] 釋放劑是從內(nèi)源結(jié)合部分替代免疫抑制劑藥物的化合物或化合物的混合物。釋放 劑可以，并且在許多情況下，從內(nèi)源結(jié)合部分替代免疫抑制劑藥物的代謝物。在許多實(shí)例 中，釋放劑具有與內(nèi)源結(jié)合蛋白的高結(jié)合親和力，使得它容易從內(nèi)源結(jié)合蛋白替代免疫抑 制劑藥物和在需要時替代其代謝物。此外，釋放劑不在任何顯著程度結(jié)合針對測定中使用 的藥物的單克隆抗體。短語"不在任何顯著程度結(jié)合"意指，結(jié)合的程度應(yīng)該是足夠低的， 從而使得可以實(shí)施針對藥物的準(zhǔn)確測定。因此，釋放劑可以是任何部分，或單一化合物或化 合物的混合物，其中實(shí)現(xiàn)期望的替代結(jié)果而不與測定抗體顯著結(jié)合。
[0047] 在一些實(shí)例中，釋放劑是免疫抑制劑藥物的類似物，包括結(jié)構(gòu)類似物。免疫抑制劑 藥物類似物是可以從結(jié)合蛋白替代類似免疫抑制劑藥物、但不在任何顯著程度競爭針對免 疫抑制劑藥物的單克隆抗體的修飾的藥物。修飾提供了將免疫抑制劑藥物類似物連接至 另一分子的方式。在一個實(shí)例中，免疫抑制劑藥物類似物可以是，例如，通過連接基團(tuán)綴合 至另一分子的免疫抑制劑藥物。對于包含羥基或羧酸官能度的免疫抑制劑藥物，釋放劑可 以是免疫抑制劑藥物的酯，其相對于待檢測的免疫抑制劑藥物對內(nèi)源結(jié)合蛋白具有高結(jié)合 親和力，并且對于針對免疫抑制劑藥物的抗體沒有顯著結(jié)合親和力。例如，在針對他克莫司 的測定中，他克莫司的酯可以用作釋放劑，只要它滿足上述要求。結(jié)構(gòu)類似物是與免疫抑制 劑藥物具有相同或類似的結(jié)構(gòu)或空間特性，從而使得結(jié)構(gòu)類似物實(shí)現(xiàn)與免疫抑制劑藥物的 類似物相同或類似結(jié)果的部分。結(jié)構(gòu)類似物可以是，例如，涉及免疫抑制劑藥物的另一種 化合物。例如，在針對他克莫司的測定中，西羅莫司的酯可以用作釋放劑。該酯可以是，例 如，氨基甲酸酯、碳酸酯、(^至(： 6羧酸的酯等。參見，例如，美國專利號7，186,518,其相關(guān)公 開內(nèi)容通過引用并入本文。釋放劑的其他實(shí)例包括對于環(huán)孢菌素 A的[Thr2，LeU5，D-Hiv8， Leu1(l]-環(huán)孢菌素 A、對于西羅莫司的FK506、對于FK506的西羅莫司等。參見，例如，美國專 利號6, 187, 547,其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0048] 釋放劑在介質(zhì)中的濃度是足以實(shí)現(xiàn)如上討論的從內(nèi)源結(jié)合部分替代免疫抑制劑 藥物和在一些情況下免疫抑制劑藥物的代謝物，以使藥物和代謝物可接近結(jié)合針對藥物的 抗體的期望結(jié)果的濃度。采用的釋放劑的量或濃度取決于例如樣品的性質(zhì)、免疫抑制劑藥 物的性質(zhì)、藥物代謝物的性質(zhì)、其他試劑組分的性質(zhì)和反應(yīng)條件中的一種或多種。在一些實(shí) 施方案中，釋放劑的量為約〇. 000001%至約〇. 5%，約0. 0001%至約0. 4%，約0. 001%至約 0.3%，約0.01%至約0.2%，約0.1%至約0.3%，約0.2%至約0.5%，約0.1%至約0.2% 等等（百分比為重量/體積）。
[0049] 該測定是免疫測定，其可以在不分離（均質(zhì)）或分離（異質(zhì)）任何測定組分或產(chǎn) 物的情況下進(jìn)行。均質(zhì)或異質(zhì)測定在通常提供最佳測定靈敏度的溫和pH的含水緩沖介質(zhì) 中實(shí)施。含水介質(zhì)可以是單獨(dú)的水或可以包括0. 1至約40體積百分比的共溶劑。介質(zhì)的 pH通常在約4至約11的范圍內(nèi)，或約5至約10的范圍內(nèi)，或約6. 5至約9. 5的范圍內(nèi)。pH 通常會是單克隆抗體和免疫抑制劑藥物的最佳結(jié)合以及測定的其他試劑諸如例如信號產(chǎn) 生系統(tǒng)的成員的pH最佳值之間的折衷。
[0050] 可以使用各種緩沖劑以實(shí)現(xiàn)期望的pH并在測定過程中維持pH。說明性緩沖劑包 括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、巴比妥等。采用的具體緩沖劑對于本發(fā)明不是關(guān)鍵，但在 單獨(dú)測定中，一種或另一種緩沖劑可以是優(yōu)選的。上述方法中可以采用各種輔助材料。例 如，除了緩沖劑以外，介質(zhì)可以包含用于介質(zhì)和用于采用的試劑的穩(wěn)定劑。經(jīng)常，除了這些 添加劑以外，可以包括例如蛋白，諸如白蛋白；有機(jī)溶劑，諸如甲酰胺；季銨鹽；聚陰離子， 諸如硫酸葡聚糖；表面活性劑，特別是非離子型表面活性劑；結(jié)合增強(qiáng)劑，例如，聚亞烷基 二醇。
[0051] 可以在添加上述各種試劑之間以一個或多個時間間隔包括任何時間間隔將一個 或多個孵育期間應(yīng)用于介質(zhì)。該介質(zhì)通常以足以使試劑的各種組分的結(jié)合發(fā)生的溫度和時 間進(jìn)行孵育。在測量期間過程中，適中的溫度通常用于實(shí)施該方法，通常為恒定溫度，優(yōu)選 室溫。孵育溫度的范圍為約5°C至約99°C，或約15°C至約70°C，或約20°C至約45°C。孵育 的時間期間為約0. 2秒至約6小時，或約2秒至約1小時，或約1至約5分鐘。該時間期間 取決于介質(zhì)的溫度和各種試劑結(jié)合速率（這通過結(jié)合速率常數(shù)、濃度、結(jié)合常數(shù)和解離速 率常數(shù)確定）。測量過程中的溫度范圍為約l〇°C至約50°C，或約15°C至約40°C。
[0052] 可以測定的免疫抑制劑藥物分析物的濃度通常從約1(Γ5至約1(Γ17 M，或從約1(Γ6 至約1(Γ14 Μ變化?？紤]因素，諸如測定是否是定性的、半定量的或定量的（相對于樣品中 存在的分析物的量），具體檢測技術(shù)和分析物的濃度通常決定了各種試劑的濃度。
[0053] 測定介質(zhì)中各種試劑的濃度將通常通過免疫抑制劑藥物分析物的目標(biāo)濃度范圍 來確定。然而，每種試劑的最終濃度通常根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，以優(yōu)化該測定在該范圍內(nèi)的靈敏 度。即，分析物濃度的顯著變化應(yīng)當(dāng)提供精確測量的信號差異?？紤]因素，諸如信號產(chǎn)生系 統(tǒng)的性質(zhì)和免疫抑制劑分析物的性質(zhì)通常決定各種試劑的濃度。
[0054] 盡管添加順序可以廣泛變化，但基于測定的性質(zhì)將存在某些優(yōu)先。最簡單的添加 順序是同時添加所有物質(zhì)，并確定如均質(zhì)測定中測定介質(zhì)對信號具有的作用。或者，可以依 次組合試劑。任選地，孵育步驟可以在如上所討論的每次添加之后涉及。
[0055] 在上面討論的測定中，采用一種或多種標(biāo)記，其中標(biāo)記通常是信號產(chǎn)生系統(tǒng) ("sps"）的部分。標(biāo)記的性質(zhì)取決于具體測定形式。sps通常包括一種或多種組分，至少 一種組分是可檢測的標(biāo)記，其生成的可檢測的信號，所述信號涉及結(jié)合和/或未結(jié)合的標(biāo) 記的量，即與待檢測的免疫抑制劑藥物或與反映待檢測的免疫抑制劑藥物的量的試劑結(jié)合 或不結(jié)合的標(biāo)記的量。該標(biāo)記是產(chǎn)生或能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生信號的任何分子，并且可以是，例 如，熒光劑、放射性標(biāo)記、酶、化學(xué)發(fā)光劑或光敏劑。因此，根據(jù)具體情況，通過檢測酶活性、 化學(xué)發(fā)光、光吸收或放射性檢測和/或測量信號。
[0056] 合適的標(biāo)記包括，通過說明但非限制的方式，酶諸如β -半乳糖苷酶、堿性磷酸 酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（"G6TOH"）和辣根過氧化物酶；核酶；復(fù)制酶諸如QB復(fù)制酶 的底物；促進(jìn)劑；染料；熒光劑，諸如熒光素、異硫氰酸酯、羅丹明化合物、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋 白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺；復(fù)合體，諸如由被稱為量子點(diǎn)（Quantum dots)的半 導(dǎo)體納米晶體中存在的CdSe和ZnS制備的那些；化學(xué)發(fā)光劑，諸如異魯米諾；敏化劑；輔 酶；酶底物；放射性標(biāo)記，諸如 125l、ml、14C、3H、57C 〇和75Se ;顆粒，諸如乳膠顆粒、碳顆粒、金 屬顆粒，包括磁性顆粒，例如，鉻顆粒等；金屬溶膠；微晶；脂質(zhì)體；細(xì)胞等，其可以用染料、 催化劑或其他可檢測基團(tuán)進(jìn)一步標(biāo)記。合適的酶和輔酶公開于Litman，等人，美國專利號 4,275，149，第19-28列，和8(^1181 &81^等人，美國專利號4,318,980，第10-14列；合適的 熒光劑和化學(xué)發(fā)光劑公開于Litman，等人，美國專利號4, 275, 149,第30和31欄；其通過引 用并入本文。
[0057] 標(biāo)簽可以直接產(chǎn)生信號，因此，產(chǎn)生信號不需要額外組分。許多有機(jī)分子，例如熒 光劑，能夠吸收紫外線和可見光，其中光吸收將能量轉(zhuǎn)移至這些分子并將它們提升至激發(fā) 能態(tài)。這種吸收能量然后通過在第二波長的光發(fā)射而消散。其他直接產(chǎn)生信號的標(biāo)記包括 放射性同位素和染料。
[0058] 或者，標(biāo)簽可以需要其他組分來產(chǎn)生信號，然后信號產(chǎn)生系統(tǒng)將包括產(chǎn)生可測量 的信號所需的所有組分。此類其他組分可以包括底物、輔酶、增強(qiáng)劑、其他酶、與酶產(chǎn)品反 應(yīng)的物質(zhì)、催化劑、活化劑、輔因子、抑制劑、清除劑、金屬離子、和對于信號生成物質(zhì)的結(jié)合 所需的特異性結(jié)合物質(zhì)。合適的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的詳細(xì)討論可見，Ullman等人，美國專利號 5, 185, 243,第11-13列，其通過引用并入本文。
[0059] 可以將標(biāo)記或其他sps成員或一種或多種單克隆抗體結(jié)合至支持物?？梢砸员绢I(lǐng) 域已知的任何方式將單克隆抗體可以結(jié)合至固體支持物，只要該結(jié)合基本上不干擾與免疫 抑制劑藥物的區(qū)域結(jié)合的能力。在一些實(shí)例中，標(biāo)簽或其他sps成員或單克隆抗體可以被 包被或直接共價結(jié)合至固相，或可以具有多層一種或多種載體分子，諸如聚（氨基酸），包 括蛋白，諸如血清白蛋白或免疫球蛋白，或多糖（碳水化合物），諸如，例如，葡聚糖或葡聚 糖衍生物。連接基團(tuán)也可用于共價偶聯(lián)固體支持物和待偶聯(lián)的部分。連接基團(tuán)可以是如上 所述的用于將免疫原連接至免疫抑制劑藥物分子的基團(tuán)。也可以采用結(jié)合至支持物的其他 方法。例如，固體支持物可以具有小分子的結(jié)合劑的包被，諸如，例如，抗生物素蛋白或抗 體，其中小分子，諸如，例如，生物素或半抗原，可以結(jié)合至待偶聯(lián)的部分，或反之亦然。組分 與支持物表面的結(jié)合可以是直接或間接的，共價或非共價的，并且可以通過在文獻(xiàn)中通常 可用的眾所周知的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。參見，例如，"Immobilized Enzymes, 〃 Ichiro Chibata， Halsted Press, New York (1978)和 Cautrecasas, .T. Biol. Chem. , 245:3059 (1970)。
[0060] 支持物可以由有機(jī)或無機(jī)、固體或流體、水溶性材料（其可以是透明或部分透明 的）構(gòu)成。支持物可以具有許多形狀中的任一種，諸如顆粒，包括珠、膠片、薄膜、管、孔、條、 桿、平表面，諸如，例如，板、DENDRIMERS等。基于測定類型，支持物在其應(yīng)用的介質(zhì)中是可 以是可懸浮的或可以不是可懸浮的。作為說明而非限制的可懸浮支持物的實(shí)例是聚合材 料，諸如，例如，膠乳，脂質(zhì)雙分子層或脂質(zhì)體，油滴，細(xì)胞和水凝膠，和磁性顆粒。其他支持 物組合物包括聚合物，諸如，例如硝酸纖維素，醋酸纖維素，聚（氯乙烯），聚丙烯酰胺，聚丙 烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚（4-甲基丁稀），聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚（對苯二甲酸二 乙酯），尼龍，聚（乙烯丁酸酯）；以其本身或與其他材料結(jié)合使用。
[0061] 支持物可以是顆粒。顆粒應(yīng)該具有至少約0. 02微米且不超過約100微米的平均 直徑。在一些實(shí)施方案中，顆粒具有約0. 05微米至約20微米，或約0. 3微米至約10微米 的平均直徑。顆?？梢允怯袡C(jī)的或無機(jī)的，可溶脹的或不可溶脹的，多孔的或非多孔的，優(yōu) 選密度接近于水，通常為約0.7 g/mL至約1.5 g/mL，且由可以是透明的、部分透明的或不 透明的材料構(gòu)成。顆粒可以是生物材料，諸如細(xì)胞或微生物，例如，紅細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì) 胞、雜交瘤、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、和大腸桿菌、病毒等。顆粒也可以是由有機(jī)和無機(jī)聚 合物、脂質(zhì)體、膠乳顆粒、磁性或非磁性顆粒、磷脂小泡、乳糜微粒、脂蛋白等構(gòu)成的顆粒。在 一些實(shí)例中，顆粒是鉻顆?；蚰z乳顆粒。
[0062] 聚合物顆?？梢杂杉映苫蚩s合聚合物形成。顆粒將是在含水介質(zhì)中容易分散的， 并且可吸附或可官能化，以便允許直接或通過連接基團(tuán)間接地綴合至針對免疫抑制劑藥物 的單克隆抗體。連接基團(tuán)可以是如上所述的用于將免疫原連接至免疫抑制劑藥物分子的 基團(tuán)。顆粒也可以衍生自天然存在的材料、合成修飾的天然存在的材料和合成材料。特別 感興趣的有機(jī)聚合物是多糖，特別是交聯(lián)的多糖，諸如瓊脂糖（agarose)，其可作為瓊脂糖 (Sepharose)、葡聚糖獲得，可作為Sephadex和Sephacryl、纖維素、淀粉等獲得；加成聚合 物，諸如聚苯乙烯，聚乙烯醇，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的衍生物（特別是具有游離羥基官 能度的酯和酰胺）的均聚物和共聚物等。
[0063] 可以將標(biāo)記和/或其他sps成員結(jié)合至兩種不同單克隆抗體中的一種或兩種。標(biāo) 記與sbp成員的鍵合可以通過導(dǎo)致用與單克隆抗體的鍵替代標(biāo)記的氫原子的化學(xué)反應(yīng)來 實(shí)現(xiàn)，或可以包括標(biāo)記和單克隆抗體之間的連接基團(tuán)。連接基團(tuán)可以是如上所述的用于 將免疫原連接至免疫抑制劑藥物分子的基團(tuán)。其他sps成員也可以共價結(jié)合至單克隆抗 體。例如，兩個sps成員諸如熒光劑和猝滅劑可以分別各自結(jié)合至單克隆抗體，其中熒光 劑被結(jié)合至一種單克隆抗體，且猝滅劑被結(jié)合至另一種單克隆抗體。當(dāng)兩種不同的單克隆 抗體結(jié)合至免疫抑制劑藥物時，夾心復(fù)合體的形成使得熒光劑和猝滅劑密切鄰近，從而允 許猝滅劑與熒光劑相互作用以產(chǎn)生信號。綴合的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如， Rubenstein等人，美國專利號3, 817, 837,其通過引用并入本文。
[0064] 作為標(biāo)簽蛋白的特別感興趣的酶是氧化還原酶，特別是脫氫酶，諸如葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶，乳酸脫氫酶等，和涉及產(chǎn)生過氧化氫和使用過氧化氫以便將染料前體 氧化為染料的酶。具體的組合包括，但不限于，糖氧化酶，例如葡萄糖和半乳糖氧化酶，或雜 環(huán)氧化酶，諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，其偶聯(lián)采用過氧化氫來氧化染料前體的酶，即，過 氧化物酶諸如辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶或微過氧化物酶。額外的酶組合是本領(lǐng)域眾 所周知的。當(dāng)單一酶用作標(biāo)記時，其他酶可以找到用途，諸如水解酶、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶， 優(yōu)選水解酶諸如堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶?；蛘?，可以使用螢光素酶，諸如螢火蟲螢光 素酶和細(xì)菌螢光素酶。
[0065] 可以找到用途的說明性輔酶包括NAD[H]、NADP[H]、磷酸吡哆醛、FAD[H]、FMN[H] 等，通常是涉及循環(huán)反應(yīng)的輔酶。參見，例如，美國專利號4, 318, 980,其公開內(nèi)容通過引用 并入本文。
[0066] 信號產(chǎn)生系統(tǒng)的活化取決于信號產(chǎn)生系統(tǒng)成員的性質(zhì)。對于用光活化的信號產(chǎn)生 系統(tǒng)的那些成員，所述成員用光照射。對于在顆粒表面上的信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員，添加堿可 能導(dǎo)致活化。鑒于本文的公開內(nèi)容將為本領(lǐng)域技術(shù)人員建議其他活化方法。對于一些信號 產(chǎn)生系統(tǒng)，不需要任何活化劑，諸如涉及作為放射性標(biāo)記、酶等等的標(biāo)記的那些系統(tǒng)。對于 酶系統(tǒng)，添加底物和/或輔因子可能是必要的。
[0067] 對于信號的存在和量的檢查還包括信號的檢測，這通常僅僅是其中讀取信號的步 驟。信號通常使用儀器讀取，所述儀器的性質(zhì)取決于信號的性質(zhì)。該儀器可以是分光光度 計(jì)、熒光計(jì)、吸收光譜儀、發(fā)光計(jì)、化學(xué)發(fā)光計(jì)、光能測定儀、攝影儀器等。檢測的信號的存在 和量與樣品中存在的西羅莫司化合物的存在和量相關(guān)。測量過程中的溫度范圍可以為約 10°C至約70°C，或約20°C至約45°C，或約20°C至約25°C。在一個方法中，使用已知濃度的 待篩選的分析物形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。如上所討論，也可以使用校準(zhǔn)劑和其他對照。
[0068] 短語"測量免疫抑制劑藥物的量"是指免疫抑制劑藥物的定量、半定量和定性測 定。定量、半定量和定性的方法，以及用于測定免疫抑制劑藥物的所有其他方法，被認(rèn)為是 測量免疫抑制劑藥物的量的方法。例如，僅僅檢測懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品中免疫 抑制劑藥物的存在或不存在的方法被認(rèn)為包括在本公開的范圍之內(nèi)。術(shù)語"檢測"和"測 定"，以及用于測量的其他常用的同義詞包括在本公開的范圍之內(nèi)。
[0069] 在根據(jù)本文描述的原理的一個實(shí)例中，對于免疫抑制劑藥物的區(qū)域特異性的單克 隆抗體中的一種結(jié)合至支持物，對于與其他單克隆抗體結(jié)合的免疫抑制劑藥物的區(qū)域空間 分開的免疫抑制劑藥物的區(qū)域特異性的單克隆抗體中的另一種結(jié)合至sps成員，諸如，例 如，標(biāo)記。將懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品與兩種綴合的單克隆抗體在合適的介質(zhì)中組 合，并將介質(zhì)孵育。然后，檢查介質(zhì)中由兩種不同的單克隆抗體和來自樣品的免疫抑制劑藥 物形成的免疫復(fù)合體的存在和量中的一種或兩種。在檢查之前，支持物可以與介質(zhì)分開或 可以不分開。免疫復(fù)合體的存在和/或量通過測定介質(zhì)中或支持物上標(biāo)記的存在和/或量 來測定。
[0070] 在一個具體實(shí)施方案中，采用捕獲測定。在該測定形式中，一種單克隆抗體共價結(jié) 合至磁性顆粒，諸如，例如，鉻（二氧化鉻）顆粒。將樣品與這些顆粒孵育，以允許樣品中的 免疫抑制劑藥物結(jié)合磁性顆粒上的單克隆抗體。隨后，將綴合至酶，諸如，例如，β_半乳糖 苷酶的第二單克隆抗體與磁性顆粒孵育。在應(yīng)用磁體和洗滌磁性顆粒之后，測量結(jié)合至磁 性顆粒的酶的量，其與樣品中免疫抑制劑藥物的存在和/或量直接相關(guān)。在這種方法中，將 報(bào)道酶的底物添加至最后的反應(yīng)容器中，且用分光光度法將酶活性測定為吸光度隨時間的 變化。
[0071] 在可替代方法中，添加過量磁性顆粒試劑，即，其量高于結(jié)合樣品中可能存在的所 有免疫抑制劑藥物所需要的量。然后，應(yīng)用磁體以便從介質(zhì)分開磁性顆粒，并將磁性顆粒洗 滌并重懸浮于測定介質(zhì)中。添加綴合至第二單克隆抗體的酶，并孵育介質(zhì)，隨后如上所述測 定信號。
[0072] 在另一個實(shí)例中，通過說明而非限制的方式，采用化學(xué)發(fā)光顆粒，其包括與其相關(guān) (諸如通過并入其中或與其結(jié)合）的化學(xué)發(fā)光的化合物。針對免疫抑制劑藥物的單克隆 抗體中的一種結(jié)合至顆粒，諸如通過包被顆粒的多糖的中間性。結(jié)合免疫抑制劑藥物的另 一種單克隆抗體是生物素綴合物的部分。將鏈霉抗生物素蛋白綴合至第二組具有與其結(jié) 合的光敏劑的顆粒。將化學(xué)發(fā)光顆粒與懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品和光敏劑顆?；?合。孵育反應(yīng)介質(zhì)，以允許顆粒借助單克隆抗體與免疫抑制劑藥物的結(jié)合而結(jié)合免疫抑制 劑藥物。然后，用光照射介質(zhì)來激發(fā)光敏劑，所述光敏劑在其激發(fā)態(tài)能夠?qū)⒀趸罨癁閱螒B(tài) (singlet state)。因?yàn)橐唤M顆粒的化學(xué)發(fā)光化合物現(xiàn)在借助免疫抑制劑藥物的存在密切 接近于光敏劑，所以它被單態(tài)氧（singlet oxygen)活化并發(fā)射冷光。然后檢查介質(zhì)中發(fā)射 的冷光或光的存在和/或量，其存在與樣品中免疫抑制劑藥物的存在和/或量相關(guān)。
[0073] 講行測定的試劑倉 用于進(jìn)行具體測定的試劑可以存在于試劑盒中，所述試劑盒可用于方便地進(jìn)行用于測 定免疫抑制劑藥物分析物的測定。在一個實(shí)例中，試劑盒在包裝組合中包含用于分析分析 物的試劑，其性質(zhì)取決于具體測定形式。試劑可以包括，例如，根據(jù)本文所述的原理的一種 或多種單克隆抗體，其可以綴合至標(biāo)記或支持物。取決于試劑的交叉反應(yīng)性和穩(wěn)定性，試劑 可以各自在不同的容器中或各種試劑可以在一個或多個容器中進(jìn)行組合。試劑盒可以進(jìn)一 步包括其他分開包裝的用于進(jìn)行測定的試劑，諸如額外結(jié)合成員和輔助試劑。
[0074] 試劑盒中各種試劑的相對量可以廣泛變化，以提供顯著優(yōu)化本方法過程中需要發(fā) 生的反應(yīng)的試劑的濃度，并進(jìn)一步顯著優(yōu)化測定靈敏度。在適當(dāng)情況下，試劑盒中的一種或 多種試劑可以被提供為干粉，通常是凍干的，包括賦形劑，其在溶解之后將提供具有用于進(jìn) 行方法或測定的適當(dāng)濃度的試劑溶液。試劑盒可以進(jìn)一步包括根據(jù)如上所述的本實(shí)施方案 的方法的書面說明。
[0075] 如本文中使用的短語"至少"意指指定項(xiàng)目的數(shù)目可以等于或大于所述數(shù)目。如 本文中使用的短語"約"意指所述數(shù)目可以變化正或負(fù)10% ;例如，"約5"意指4. 5至5. 5 的范圍。指定"第一"和"第二"是完全任意的，并不意指暗示上述語言涉及的組的任何成 員之間的順序或排名，諸如，例如，"第一和第二單克隆抗體"或"第一單克隆抗體"和"第二 單克隆抗體"。
[0076] 以下實(shí)施例通過說明而非限制的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，并且意 在描述，而非限制本發(fā)明的范圍。本文公開的份和百分?jǐn)?shù)以體積計(jì)，除非另有說明。 實(shí)施例
[0077] 除非另有說明，所有化學(xué)品均購自Sigma-Aldrich Company (St. Louis M0)。他 克莫司獲得自 Astellas Pharma US，Inc.，Deerfield，IL。
[0078] 使用獲得自Siemens AG，Newark DE的DMENSION? RxL分析儀實(shí)施測試。用夾心 免疫測定形式使用酶檢測系統(tǒng)采用儀器。在本文中使用和在下面更詳細(xì)討論的夾心方法實(shí) 施方案中，綴合至酶的經(jīng)標(biāo)記的抗體（Ab)(綴合物）和患者樣品中的他克莫司藥物（TACR0) 之間的結(jié)合以及隨后所得免疫復(fù)合體與鉻顆粒上的捕獲抗體的結(jié)合確定患者樣品中他克 莫司的量。通過3-4次混合/洗滌和磁分離循環(huán)自動去除未結(jié)合的標(biāo)簽抗體酶綴合物。將來 自鉻顆粒上剩余的綴合物的酶活性進(jìn)行測量，其與患者樣品中他克莫司的量直接成比例。
[0079] 實(shí)施例1 俥用自動化ACMIA夾心測定來測定他克草司 他克草司-鑰孔jal血藍(lán)蛋白綴合物的制各。向1.05 mL無水二甲基甲酰胺中他克莫 司單肟（32. 3 mg，36. 8 Mmol)的溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽 酸化物（EDAC) (11 mg，57. 4 μ M，L 5 當(dāng)量）和 N-羥基琥珀酰亞胺（7. 3 mg，63. 4 μ M，1. 7 當(dāng)量）。連接是在他克莫司分子的C22位置。將反應(yīng)在室溫在氬氣下攪拌1小時。然后將 混合物經(jīng)由注射器逐滴添加至5.0 mL磷酸鹽緩沖鹽水（0. 1 M，pH 8.0)和0.25 mL二甲基 甲酰胺中鑰孔趣|血藍(lán)蛋白（74 mg，54%純）的溶液中。在室溫下攪拌2小時后，將所得懸浮 液針對PBS (磷酸鹽緩沖鹽水）（10 mM，pH 7. 0)進(jìn)行透析（1 X 4 L，4°C，2小時）。
[0080] 然后將所得混合物用二氯甲烷萃取3次，以去除任何痕量的未反應(yīng)的他克莫司單 肟。使用二喹啉甲酸（BCA)蛋白測定溶液進(jìn)行混合物的定量分析，以得到8 ml PBS (10 mM， pH 7.0)中的50 mg免疫原。
[0081] 使用 TNBS 方法（A. F. S. A. Habeeb，Anal. Biochem. 14:328 (1966))測定半抗原 數(shù)得到1300的半抗原數(shù)。將免疫原使用干冰-丙酮浴立即冷凍并保持在-20°C用于儲存。
[0082] 如下制備含有他克莫司的三種位置異構(gòu)體（在位置C32連接的KLH，在位置C24 連接的KLH和在位置C32和C24連接的KLH)的免疫原混合物：將圓底燒瓶中的他克莫司 (301.3 mg)在真空干燥1.5小時。向燒瓶中添加攪拌棒、琥拍酸酐（568. 2 mg)、4-(二甲基 氨基）吡啶（46.3 mg)、二氯甲烷（2 mL，無水）和吡啶（2.093 mL)。將反應(yīng)混合物在室溫 (24°C )在氮?dú)鈿夥障聰嚢?4. 5小時。三種位置異構(gòu)體是該反應(yīng)的產(chǎn)物：他克莫司-32-琥 珀酸酯、他克莫司-24-琥珀酸酯和他克莫司-24, 32-二-琥珀酸酯。一旦停止反應(yīng)，則通 過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，并將產(chǎn)物通過真空泵進(jìn)一步干燥兩小時。
[0083] 向小瓶中添加來自上述的他克莫司-琥珀酸酯混合物（2. 5 mg，2. 8微摩爾）、N_羥 基琥珀酰亞胺（1. 〇 mg，8. 7微摩爾）和無水乙腈（250 μυ。將混合物加蓋，并在室溫?cái)嚢琛?向攪拌的混合物中添加 Ν, Ν-二環(huán)己基碳二亞胺（3. 0 mg, 15微摩爾）。將小瓶加蓋，并將混 合物在室溫?cái)嚢琛?br>
[0084] 2小時后，將混合物蒸發(fā)至干燥。將所得物質(zhì)溶解在無水N，N_二甲基甲酰胺（250 μυ中。這是活化的FK506-琥珀酸酯的工作溶液。
[0085] 向20 mL小瓶中添加8 mL 10 mM磷酸鹽緩沖液pH 8和DMF (1. 5 mL)中KLH (8 mg)的溶液。將混合物冷卻至約4°C，并在攪拌下將200 μ?來自上述的工作溶液逐滴添加 至冷卻溶液。將混合物在4°C攪拌16-24小時，然后用水稀釋至30 mL，用兩個CENTRIC0N? 30過濾器脫鹽，并用新鮮水再重構(gòu)3次。用水將最終物質(zhì)稀釋至10 mL。通過BCA蛋白測 定方法測定蛋白濃度。
[0086] 針對他克草司的單克降抗體的制各。如下制各結(jié)合他克草司分子的分開部分的 單克隆抗體。免疫原是如上所述制備的他克莫司-鑰孔相I血藍(lán)蛋白綴合物。使用該免疫 原來免疫Balb/c小鼠。第一次免疫是腹膜內(nèi)200 μ 1體積中的25 μ g，具有單磷酰脂質(zhì) A和合成海藻糖二桿菌分枝菌酸酯（trehalose dicorynomycolate)佐劑（RIBI MPL+TDM Emulsion,RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton MT)。五周后，用 200 μ 1 單憐醜脂 質(zhì)Α和合成海藻糖二桿菌分枝菌酸酯佐劑中的25 μ g免疫原腹膜內(nèi)給予加強(qiáng)免疫。隨后， 在另外8周后，靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給予200 μ 1 Hanks'平衡鹽溶液中25 μ g免疫原的融合 前加強(qiáng)（prefusion boost)。
[0087] 三天后，使用指定為P3x63_AG8. 653的非分泌型鼠骨髓瘤通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行融 合。通過標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施克隆。
[0088] 根據(jù)以下方案通過以下反向ELISA免疫測定程序篩選克隆。以100 μ 1/孔用磷酸 鹽緩沖鹽水中5 μ g/ml的多克隆山羊抗小鼠 IgG (IgG+IgA+IgM) (Zymed Laboratories, South San Francisco CA)包被板。板包被在室溫進(jìn)行2小時或更久，或在約4°C進(jìn)行過 夜；可以將所述板在約4°C包裹在膜中儲存數(shù)天。然后將板輕輕拍干，并用300 μ 1/孔的 封閉緩沖稀釋液（PBS中0. 5%牛血清白蛋白，0. 05% TWEEN? 20)封閉。通過在室溫在板振 蕩的情況下孵育15分鐘或更久而進(jìn)行板封閉。然后將板輕輕拍干。然后如下將待篩選的 單克隆抗體添加至各孔中：添加50 μ 1/孔的封閉緩沖稀釋液連同50 μ 1/孔的從融合生 長板中的相應(yīng)孔轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)上清液。孵育在室溫在振蕩的情況下約1小時。使用具有S20 堆疊器（stacker)的TITERTECK PLUS ?洗板機(jī)用作為具有0.05% TWEEN? 20的PBS的洗 滌緩沖液洗滌板。以100 μ 1/孔添加在封閉緩沖稀釋劑中稀釋至1:4000的共價偶聯(lián)至葡 萄糖-6-磷酸脫氫酶的他克莫司的酶綴合物。在室溫在振蕩的情況下進(jìn)行孵育約1小時。 然后將板洗滌，并以100 μ 1/孔的體積添加顯色溶液。顯色溶液含有0.593 mM對碘硝基 四唑紫、0.02 M NAD、0. 033 Μ葡萄糖-6-磷酸、0.055 M Tris、0. 02%疊氮化鈉和心肌黃酶 (硫辛酰脫氫酶）的1:4000稀釋液。BSA以5% w/vol BSA溶液的1% (體積/體積（vol/ vol))存在。使用BSA來幫助防止還原的對碘硝基四唑紫的快速沉淀。
[0089] 從篩選選擇產(chǎn)生合適的單克隆抗體的雜交瘤。這被指定為14H04抗體。
[0090] 使用如上所述的他克莫司分子的具有在C32、C24和C32以及C24位置處連接的 KLH的免疫原混合物以類似方式制備指定為1E2的他克莫司的單克隆抗體。
[0091] 溶血件預(yù)處理溶液的制各。該預(yù)處理溶液含有5 yg/mL西羅莫司（SIR0)、6.8 mg/ mL PIPES? 1.5 鈉鹽、0.3 mg/mL EDTA 二鈉、1.0 mg/mL 皂苷、0.2% PR0CLIN? 300、0· 024 mg/mL硫酸新霉素和0· 99 mg/mL NaN3，pH 6· 5。最終反應(yīng)混合物中的SIR0濃度為1· 1 μ g/ mL。表1顯示了在對用于測定他克莫司的全血樣品的部分發(fā)生溶血中使用的溶血試劑的組 成（AI=如指示）。Choi是膽固醇，且Trig是甘油三酯。
[0092] 表 1
【權(quán)利要求】
1. 用于測定懷疑含有免疫抑制劑藥物的樣品中的免疫抑制劑藥物的方法，所述方法包 括： (a) 在介質(zhì)中組合提供： (i) 所述樣品， (ii) 針對所述免疫抑制劑藥物的第一單克隆抗體，和 (iii) 針對所述免疫抑制劑藥物的第二單克隆抗體，其中所述第二單克隆抗體結(jié)合除 了所述第一單克隆抗體結(jié)合所述免疫抑制劑藥物的部分以外的所述免疫抑制劑藥物的部 分， (b) 在用于所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體結(jié)合所述免疫抑制劑藥物的 條件下孵育所述介質(zhì)，和 (c) 檢查所述介質(zhì)中包含所述免疫抑制劑藥物、所述第一單克隆抗體和所述第二單克 隆抗體的免疫復(fù)合體的存在，所述免疫復(fù)合體的存在和/或量表明所述樣品中所述免疫抑 制劑藥物的存在和/或量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑藥物選自他克莫司、環(huán)孢菌素、雷帕霉 素和依維莫司。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體中的一種 包含信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體中的一種 結(jié)合至支持物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑藥物是他克莫司，且所述第一單克隆 抗體結(jié)合基本上由包括甲氧基和羥基取代基的C29-C34環(huán)和包括甲氧基取代基的C15組成 的他克莫司的部分。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑藥物是他克莫司，且所述第二單克隆 抗體結(jié)合基本上由C10-C14環(huán)的甲氧基和包括C22酮氧的C1-C26環(huán)的C19-C27組成的他 克莫司的部分。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑藥物是他克莫司，且所述第一單克隆 抗體針對包含在C22處連接至他克莫司的免疫原性載體的免疫原產(chǎn)生。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑藥物是他克莫司，且所述第二單克隆 抗體針對包含在C32處連接至他克莫司的免疫原性載體的免疫原產(chǎn)生。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫抑制劑藥物是他克莫司，所述第一單克隆抗 體是14H04,且所述第二單克隆抗體是1E2。
10. 用于測定懷疑含有他克莫司的樣品中的他克莫司的方法，所述方法包括： (a) 在介質(zhì)中組合提供： (i) 所述樣品， (ii) 針對他克莫司的第一單克隆抗體，和 (iii) 針對他克莫司的第二單克隆抗體，其中所述第二單克隆抗體結(jié)合除了所述第一 單克隆抗體結(jié)合他克莫司的部分以外的他克莫司的部分， (b) 在用于所述第一抗體和所述第二抗體結(jié)合所述樣品中的他克莫司的條件下孵育 所述介質(zhì)，和 (C)檢查所述介質(zhì)中包含他克莫司、所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體的免 疫復(fù)合體的存在，所述免疫復(fù)合體的存在和/或量表明所述樣品中他克莫司的存在和/或 量。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體中的一 種包含信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體中的一 種結(jié)合至支持物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第一單克隆抗體結(jié)合基本上由包括甲氧基和羥 基取代基的C29-C34環(huán)和包括甲氧基取代基的C15組成的他克莫司的部分。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第二單克隆抗體結(jié)合基本上由C10-C14環(huán)的甲 氧基和包括C22酮氧的C1-C26環(huán)的C19-C27組成的他克莫司的部分。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第一單克隆抗體針對包含在C22處連接至他克 莫司的免疫原性載體的免疫原產(chǎn)生。
16. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第二單克隆抗體針對包含在C32處連接至他克 莫司的免疫原性載體的免疫原產(chǎn)生。
17. 根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述第一單克隆抗體是14H04,且所述第二單克隆抗 體是1E2。
18. 用于測定懷疑含有他克莫司的樣品中的他克莫司的方法，所述方法包括： (a) 在介質(zhì)中組合提供： (i) 所述樣品， (ii) 締合磁性顆粒的針對他克莫司的第一單克隆抗體，和 (iii) 針對他克莫司的第二單克隆抗體，其中所述第二單克隆抗體結(jié)合除了所述第一 單克隆抗體結(jié)合他克莫司的部分以外的他克莫司的部分，且其中所述第二單克隆抗體與酶 締合， (b) 在用于所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體結(jié)合他克莫司的條件下孵育 所述介質(zhì)，和 (d)檢查所述介質(zhì)中包含他克莫司和所述第一單克隆抗體和所述第二單克隆抗體的 免疫復(fù)合體的存在，所述免疫復(fù)合體的存在和/或量表明所述樣品中他克莫司的存在和/ 或量。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述第一單克隆抗體結(jié)合基本上由包括甲氧基和羥 基取代基的C29-C34環(huán)和包括甲氧基取代基的C15組成的他克莫司的部分，且其中所述第 二單克隆抗體結(jié)合基本上由C10-C14環(huán)的甲氧基和包括C25羥基和C22酮氧的C1-C26環(huán) 的C19-C27組成的他克莫司的部分。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述第一單克隆抗體是14H04,且所述第二單克隆抗 體是1E2。
【文檔編號】C07K16/00GK104160273SQ201380012686
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月7日
【發(fā)明者】T.Q.魏 申請人:西門子醫(yī)療保健診斷公司